摘要：氮是植物必需的大量元素之一，對(duì)于西瓜生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。為闡明西瓜響應(yīng)低氮脅迫的作用機(jī)制，對(duì)連續(xù)低氮脅迫下西瓜的表型變化進(jìn)行分析，并利用Illumina Novaseq平臺(tái)對(duì)3個(gè)氮素水平（CK、N1、N3）處理下第15天的西瓜葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。結(jié)果表明，低氮處理促進(jìn)了西瓜地下根系伸長(zhǎng)，但對(duì)地上植株長(zhǎng)度和地上鮮重有明顯抑制作用，處理后植株表現(xiàn)出地上部矮小的癥狀。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示，在CK/N1、N1/N3、CK/N3對(duì)比中，分別鑒定出121、1 184、516個(gè)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），其中共有的DEGs有12個(gè)，上調(diào)1個(gè)和下調(diào)11個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因主要通過(guò)煙酰胺合成酶、bHLH轉(zhuǎn)錄因子、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、葉綠素代謝等通路來(lái)響應(yīng)低氮脅迫，而上調(diào)表達(dá)基因與酪氨酸代謝有關(guān)。綜上，西瓜響應(yīng)低氮脅迫是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，經(jīng)轉(zhuǎn)錄組鑒定的與氮脅迫相關(guān)的關(guān)鍵基因在提高西瓜對(duì)低氮脅迫的耐受性以及提高西瓜的氮利用效率方面有重要作用。以上研究結(jié)果為深入研究西瓜低氮脅迫響應(yīng)機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：西瓜；響應(yīng)；低氮脅迫；轉(zhuǎn)錄組分析doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0156

中圖分類號(hào)：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）12003009

氮是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸以及磷脂的重要組成部分，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量元素之一，氮素缺乏會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育、物質(zhì)代謝和產(chǎn)量形成等[12]。土壤中可供植物吸收的氮素是有限的，人們經(jīng)常通過(guò)施用過(guò)量氮肥來(lái)達(dá)到高產(chǎn)的目的。我國(guó)氮肥的平均利用率僅為33%[3]。高氮投入和低氮素利用效率（nitrogen useefficiency，NUE）不僅會(huì)增加作物生產(chǎn)成本，還會(huì)破壞生態(tài)環(huán)境，導(dǎo)致土壤酸化[4]、水體富營(yíng)養(yǎng)化[56]、溫室效應(yīng)和大氣污染[78]等，進(jìn)而威脅人類健康。當(dāng)前，減少氮肥投入、提高作物NUE是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中亟需解決的問(wèn)題。闡明作物對(duì)低氮耐受性的作用機(jī)制并選育耐低氮、氮高效利用的種質(zhì)資源是實(shí)現(xiàn)“減氮增效”、降低環(huán)境污染最經(jīng)濟(jì)有效的途徑，對(duì)于實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)綠色和可持續(xù)發(fā)展也具有十分重要的意義。

植物吸收氮素最常見(jiàn)的形式是硝酸鹽（NO? 3）和銨鹽（NH+ 4），其中NO?3 是主要形式[9]。氮以NO?3 和NH+4 的形式通過(guò)其轉(zhuǎn)運(yùn)體被根系吸收。對(duì)大多數(shù)植物來(lái)說(shuō)，根部同化吸收NO?3 后大部分被運(yùn)送到地上莖部[10]。在同化過(guò)程中，NO?3 在葉片細(xì)胞質(zhì)中先由硝酸還原酶（nitrate reductase，NR）還原為亞硝酸鹽；然后，在葉綠體中亞硝酸鹽還原酶（nitritereductase，NIR）和細(xì)胞質(zhì)中谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS）作用下被還原為NH+4[11-12]。這些合成的含氮化合物作為氨基酸、蛋白質(zhì)和其他含氮代謝物的前體參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育[1314]。氮素供應(yīng)不足時(shí)，植物會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、葉片變黃、產(chǎn)量降低等癥狀[15-17]，植株的光合能力也會(huì)減弱，導(dǎo)致生長(zhǎng)不良[18-20]。研究證明，氮代謝過(guò)程中的關(guān)鍵基因?qū)τ诖龠M(jìn)植物的耐低氮程度、提高NUE具有十分重要的作用[21-23]。

RNA-Seq高通量測(cè)序技術(shù)被廣泛用于多種作物的轉(zhuǎn)錄組分析，如油菜、小麥、水稻等，目的在于檢測(cè)與缺氮有關(guān)的基因，并研究氮脅迫下可能的調(diào)控機(jī)制[24-26]。在低氮處理下， 甘藍(lán)型油菜可以通過(guò)調(diào)控 BnaNRTs、BnaGN1s、BnaNIAs 家族基因提高NUE， 同時(shí)調(diào)控BnaMYBs、BnaWRKYs 家族和可變剪接積極適應(yīng)低氮脅迫[24]。小麥響應(yīng)低氮脅迫的重要途徑有3條，即鈣介導(dǎo)的植物?病原體相互作用、MAPK 信號(hào)通路和磷脂酰肌醇信號(hào)通路[25]。在水稻響應(yīng)低氮脅迫過(guò)程中，根系通過(guò)調(diào)控與氮吸收利用、碳代謝和根系生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因來(lái)適應(yīng)低氮環(huán)境[26]。

西瓜是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。研究表明，氮對(duì)西瓜生長(zhǎng)具有十分重要的作用，它能顯著促進(jìn)西瓜生長(zhǎng)發(fā)育，提高光合速率、產(chǎn)量、果實(shí)品質(zhì)和水分利用效率[27]；而氮素不足會(huì)嚴(yán)重影響西瓜生長(zhǎng)，如缺氮會(huì)影響西瓜幼苗葉綠素?zé)晒馓匦?，進(jìn)而降低生物量，不利于果實(shí)發(fā)育期果實(shí)膨大等[28]。由此可見(jiàn)，西瓜生長(zhǎng)受低氮脅迫影響較大，但目前關(guān)于低氮脅迫影響西瓜生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制仍認(rèn)識(shí)有限。因此，研究低氮脅迫對(duì)西瓜生長(zhǎng)及其基因表達(dá)的影響對(duì)提高西瓜的NUE、獲得高品質(zhì)西瓜具有重要意義。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析西瓜生長(zhǎng)過(guò)程對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)，鑒定與低氮脅迫相關(guān)的差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步研究西瓜生長(zhǎng)響應(yīng)低氮脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試西瓜品種為‘滿春’，由開(kāi)封市農(nóng)林科學(xué)研究院提供。經(jīng)前期試驗(yàn)篩選，該材料對(duì)低氮條件適應(yīng)性較好。

1.2 試驗(yàn)方法

挑選出大小一致、籽粒飽滿的西瓜種子，用蒸餾水清洗干凈后，平鋪于濾紙上瀝干水分后，用紗布包好放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。待催芽結(jié)束，將種子播種于72孔穴盤中，放置在人工氣候室培養(yǎng)（25 ℃/14 h光照，18 ℃/10 h黑暗）；培養(yǎng)至3葉1心，挑選長(zhǎng)勢(shì)均勻的幼苗，清洗干凈根部基質(zhì)，注意保護(hù)根系的完整性，轉(zhuǎn)移至含氮量分別為0.750 0（N1）、0.075 0 mmol·L?1 （N2）和0.007 5 mmol·L?1（N3）的營(yíng)養(yǎng)液（改良的1/2 Hoagland配方，pH 7.0）進(jìn)行低氮脅迫處理，以含氮量為7.500 0 mmol·L?1為對(duì)照（CK），連續(xù)培養(yǎng)22 d，每3 d更換1次營(yíng)養(yǎng)液。各處理營(yíng)養(yǎng)液配制如下。

1.3 西瓜幼苗表型測(cè)定

分別在脅迫第8、第15和第22天測(cè)定幼苗的地上部長(zhǎng)度和鮮重、地下部長(zhǎng)度和鮮重。每處理6株，3次重復(fù)。

1.4 西瓜幼苗響應(yīng)低氮脅迫的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

1.4.1 樣品獲取 在脅迫第15天分別取CK、N1、N3處理的葉片，提取總RNA，質(zhì)量檢測(cè)合格后送北京果殼生物科技有限公司利用Illumina Novaseq平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。每處理3株， 2次重復(fù)。

1.4.2 樣品檢測(cè)與文庫(kù)構(gòu)建 測(cè)序后獲得的原始數(shù)據(jù)（raw data），經(jīng)過(guò)濾后得到有效數(shù)據(jù)（cleandata），與西瓜參考基因組（http：//cucurbitgenomics.org/ftp/genome/watermelon/97103/v2/）進(jìn)行序列比對(duì)，得到比對(duì)數(shù)據(jù)（mapped data），用于新基因挖掘、差異表達(dá)分析、差異表達(dá)基因（differentiallyexpressed genes，DEGs）功能注釋和功能富集等生物信息學(xué)分析。

1.4.3 差異基因篩選 各樣本基因表達(dá)量用每千個(gè)堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬(wàn)映射讀取的片段數(shù)（fragments per kilobase of transcript per million"mapped reads，F(xiàn)PKM）算法[1]進(jìn)行歸一化處理。

利用差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（1 discovery rate，F(xiàn)DR）篩選DEGs，將FC≥2.00 且FDRlt;0.05 作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)DEGs 進(jìn)行GO（gene ontology）功能注釋和富集分析，利用KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路注釋分析，應(yīng)用STRING軟件對(duì)DEGs進(jìn)行蛋白質(zhì)互作分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用Duncan’s 多重比較法進(jìn)行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 低氮脅迫條件下對(duì)西瓜生長(zhǎng)表型的影響

在連續(xù)低氮脅迫處理下，幼苗生長(zhǎng)發(fā)育受阻，表現(xiàn)出植株矮小等癥狀（圖1）。在第8天，幼苗地上部鮮重、地下部鮮重和地下部長(zhǎng)度在4個(gè)處理間均無(wú)顯著差異，但N3 處理的地上部長(zhǎng)度顯著低于CK和N2處理；隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，CK處理的地上部長(zhǎng)度、地上部鮮重、地下部長(zhǎng)度和地下部鮮重均呈逐漸增加趨勢(shì)，N1和N2處理也有類似趨勢(shì)；在第15和第22天，幼苗的地上部長(zhǎng)度和地上部鮮重隨著氮脅迫的加強(qiáng)顯著降低，其中N2和N3處理的地下部長(zhǎng)度均大于CK。此外，在第8、第15和第22天時(shí)，N1處理的地下部鮮重均高于CK，其中在第15和第22天顯著高于CK。由此表明，低氮脅迫初期，西瓜幼苗在不同氮素水平處理下的表型變化較小；隨著低氮脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，脅迫程度越強(qiáng)，對(duì)幼苗表型的影響越大，低氮脅迫促進(jìn)根系的伸長(zhǎng)，但對(duì)于地上部生長(zhǎng)有明顯抑制作用。

2.2 西瓜響應(yīng)低氮脅迫的轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析 對(duì)CK、N1和N3處理第15 天的葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)果（表1）表明，檢測(cè)到的有效數(shù)據(jù)分別為44 680 604、42 755 765和44 968 308，獲得比對(duì)基因組的數(shù)據(jù)分別為43 215 897、41 534 388和43 682 840，比對(duì)效率分別為96.73%、97.14% 和97.16%，Q30堿基百分比分別是91.05、91.43和91.57，GC含量分別為44.94%、45.52%和45.98%。

2.2.2 DEGs分析 由表2和圖2可知，CK 與N1相比，共發(fā)現(xiàn)121 個(gè)DEGs，其中上調(diào)34 個(gè)，下調(diào)87個(gè)；N1與N3相比，DEGs共1 184個(gè)，其中上調(diào)843 個(gè)，下調(diào)341 個(gè)；CK 與N3 相比，DEGs 共516個(gè)，其中上調(diào)327個(gè)，下調(diào)189個(gè)。

2.2.3 DEGs的GO富集分析 對(duì)CK與N1、N1與N3、CK 與N3 間的DEGs 分別進(jìn)行GO 富集分析（圖3）發(fā)現(xiàn)，均包括生物學(xué)過(guò)程（biological process）、細(xì)胞組分（cellular component）和分子功能（molecularfunction），GO 注釋數(shù)量分別是110、1 134、484個(gè)。富集顯著的生物學(xué)過(guò)程均包括花粉識(shí)別、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)和蛋白質(zhì)代謝相關(guān)過(guò)程；富集顯著的分子功能均包括電子載體活性、轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移除氨基?；酝獾孽；⒀趸€原酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、水解酶活性；由于CK/N1富集顯著的細(xì)胞組分只有細(xì)胞核，因此在3組對(duì)比中暫未發(fā)現(xiàn)均顯著的細(xì)胞組分。以上結(jié)果表明，低氮脅迫對(duì)西瓜特定生長(zhǎng)發(fā)育階段的花粉發(fā)育、金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)以及與之有關(guān)的分子功能影響較大。

2.2.4 DEGs 的KEGG 通路富集分析 對(duì)CK 與N1、N1與N3、CK與N3間的DEGs分別進(jìn)行KEGG通路富集分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，富集最為顯著的20個(gè)代謝通路均包括苯丙烷類物質(zhì)生物合成、類黃酮生物合成、酪氨酸代謝、異喹啉生物堿的生物合成，其中苯丙烷類物質(zhì)生物合成在3組對(duì)比中的DEGs數(shù)量分別為7、26、22個(gè)，這些基因有上調(diào)表達(dá)，也有下調(diào)表達(dá)；類黃酮生物合成在3 組對(duì)比中的DEGs數(shù)量分別為1、8、7個(gè)，這些基因在CK與N1對(duì)比中，均為下調(diào)表達(dá)，在N1與N3、CK與N3對(duì)比中，有上調(diào)表達(dá)，也有下調(diào)表達(dá)；酪氨酸代謝在3組對(duì)比中的DEGs數(shù)量分別是2、9、7個(gè)，且均為上調(diào)表達(dá)；異喹啉生物堿的生物合成在3組對(duì)比中的DEGs數(shù)量分別為1、7、5個(gè)，均為上調(diào)表達(dá)。綜上表明，低氮脅迫下DEGs可能主要通過(guò)這些代謝通路上調(diào)或者下調(diào)影響西瓜的生長(zhǎng)發(fā)育。

2.2.5 關(guān)鍵DEGs分析 為進(jìn)一步分析西瓜幼苗響應(yīng)低氮脅迫的關(guān)鍵基因，以 FDR≤0.01 且FC≥2.00 為標(biāo)準(zhǔn)，從CK 與N1、N1 與N3、CK 與N3 的DEGs中查找共有基因，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，3組對(duì)比的DEGs 中共有12 個(gè)共有的DEGs，其中有11 個(gè)下調(diào)表達(dá)，這11個(gè)基因有4個(gè)（Cla97C01G023010、Cla97C07G136330、Cla97C02G040720、Cla97C02G0-34910）編碼鐵、鋅、鐵-硫等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、金屬轉(zhuǎn)運(yùn)體以及與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的煙酰胺合成酶基因，有2 個(gè)（Cla97C04G071110、 Cla97C04G071130）編碼bHLH 轉(zhuǎn)錄因子，有1個(gè)（Cla97C08G150960）編碼糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，還有1個(gè)（Cla97C05G091150）與葉綠素代謝有關(guān)，有3 個(gè)（Cla97C06G124190、Cla97C01G021100、Cla97C02G034900）未注釋到功能，為推測(cè)蛋白；Cla97C03G057100在3組對(duì)比中均為上調(diào)表達(dá)，該基因編碼多酚氧化酶，與酪氨酸代謝有關(guān)。以上結(jié)果表明，這12 個(gè)共同的DEGs可能在西瓜響應(yīng)低氮脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用，主要通過(guò)煙酰胺合成酶、bHLH 轉(zhuǎn)錄因子、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、葉綠素代謝相關(guān)蛋白、酪氨酸代謝相關(guān)蛋白的下調(diào)或上調(diào)來(lái)響應(yīng)低氮脅迫。

3 討論

氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的重要營(yíng)養(yǎng)元素。研究表明，氮供應(yīng)不足，植物表現(xiàn)出明顯的應(yīng)答反應(yīng)，如水稻、玉米、煙草及地毯草等在缺氮條件下生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，表現(xiàn)生長(zhǎng)慢、葉片黃、產(chǎn)量低、干物質(zhì)量少等癥狀，植株會(huì)通過(guò)根系伸長(zhǎng)來(lái)吸收深層土壤中的硝態(tài)氮，以便獲得更高的NUE[15-17]。本研究表明，連續(xù)的低氮脅迫使西瓜幼苗根系伸長(zhǎng)，但地上部生長(zhǎng)受到顯著抑制，由此表明，提高植株NUE對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)低氮脅迫15 d的西瓜幼苗葉片進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CK 與N1、N1與N3、CK 與N3 對(duì)比的DEGs 分別有121、1 184、516個(gè)，與大麥[10]、小麥[25]、水稻[26]、馬鈴薯[29]等作物中DEGs數(shù)量差異較大，說(shuō)明不同物種對(duì)低氮脅迫的響應(yīng)程度不同。GO富集分析顯示，CK與N1的DEGs主要參與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、花粉識(shí)別等過(guò)程；N1與N3的DEGs主要參與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、花粉識(shí)別、蛋白質(zhì)代謝等過(guò)程；CK 與N3 的DEGs 主要參與糖酵解、氮代謝等過(guò)程，與前人研究結(jié)果[10，25，29]類似；但在3組對(duì)比中，均有DEGs參與蛋白質(zhì)代謝、花粉識(shí)別和金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)，行使電子載體活性、轉(zhuǎn)移酶活性、氧化還原酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、水解酶活性等功能，說(shuō)明西瓜幼苗響應(yīng)低氮脅迫除了主要通過(guò)參與光合作用、氮代謝、蛋白質(zhì)代謝等關(guān)鍵基因外，參與花粉識(shí)別和金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)的基因也起重要作用。KEGG富集通路分析顯示，CK與N1、N1與N3、CK與N3對(duì)比中均包含多種代謝通路，如光合生物鐘的碳固定、光合作用，天線蛋白、乙醛酸鹽和二羧酸鹽代謝、碳代謝、氨基酸的生物合成、氮代謝等，與大麥中的結(jié)果[10]類似；在3組對(duì)比中，均包括的代謝通路有苯丙烷類物質(zhì)生物合成、類黃酮生物合成、酪氨酸代謝和異喹啉生物堿的生物合成，說(shuō)明低氮脅迫下西瓜DEGs可能通過(guò)多種代謝通路起作用。

為了響應(yīng)土壤中有效氮水平的變化，植物進(jìn)化出了復(fù)雜的適應(yīng)策略。前人對(duì)植物響應(yīng)低氮脅迫的分子調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了較多研究，證明植物響應(yīng)低氮脅迫的關(guān)鍵調(diào)控基因與植物對(duì)低氮脅迫的耐受性和獲得較高NUE密切相關(guān)。Zhang等[21]利用全基因組分析方法在大豆中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)特異的GATA 基因（GmGATA44），該基因具有抗低氮脅迫的功能。He等[30]在小麥中過(guò)表達(dá)TaNAC2-5A 可促進(jìn)根系生長(zhǎng)，提高硝酸鹽流入速率，從而提高根系獲取氮的能力。Tang 等[23]在水稻中過(guò)表達(dá)玉米 C4-PEPC 基因，可提高低氮脅迫下的光呼吸通路，從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)低氮脅迫的耐受性、提高產(chǎn)量。Wang 等[31]在玉米中過(guò)表達(dá)玉米內(nèi)源2-烯醛還原酶ZmAER 基因，顯著提高了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)低氮脅迫的耐受性。本研究基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，對(duì)CK與N1、N1與N3、CK與N3進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)共同的關(guān)鍵DEGs 12個(gè)，其中11個(gè)下調(diào)表達(dá)，1個(gè)上調(diào)表達(dá)。在下調(diào)表達(dá)基因中有 4 個(gè)（Cla97C01-G023010、Cla97C07G136330、Cla97C02G040720、Cla97C02G034910）是編碼鐵、鋅、鐵-硫等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及與金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的煙酰胺合成酶（nicotianamine synthase， NAS），其他下調(diào)基因主要是通過(guò)bHLH轉(zhuǎn)錄因子、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、葉綠素代謝等通路來(lái)響應(yīng)低氮脅迫；上調(diào)表達(dá)基因則與酪氨酸代謝有關(guān)。這些基因可能在增強(qiáng)西瓜對(duì)低氮脅迫的耐受性以及提高西瓜NUE方面有重要作用，為進(jìn)一步深入研究西瓜低氮脅迫響應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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