摘要：為篩選出適宜高寒地區(qū)低溫青貯的優(yōu)良乳酸菌菌株，本試驗(yàn)從箭筈豌豆（Vicia sativa）、小黑麥（Triticosecale wittmack）和燕麥（Avena sativa）3種牧草青貯飼料中分離乳酸菌菌株并通過低溫控制培養(yǎng)及產(chǎn)酸試驗(yàn)進(jìn)行篩選，對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)、生理生化鑒定及16S rDNA同源性分析。結(jié)果表明，從3種牧草青貯牧草分離純化得到42株乳酸菌，篩選得到具有較強(qiáng)低溫生長能力和產(chǎn)酸能力的10株耐低溫乳酸菌，其中7株為同型發(fā)酵乳酸菌，3株為異型發(fā)酵乳酸菌，10株菌株都具有較好的耐酸性、耐鹽性和耐溫性，經(jīng)同源性測(cè)序分析菌株GN1，GN3和GN10為植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum），菌株GN2，GN4和GN7為短乳桿菌（Levilactobacillus brevis），菌株GN5和GN6為彎曲乳桿菌（Latilactobacillus curvatus），菌株GN8和GN9為清酒乳桿菌（Latilactobacillus sakei subsp.）。結(jié)合耐低溫乳酸菌產(chǎn)酸能力、低溫生長能力和生理生化特性等多種結(jié)果綜合考慮，植物乳桿菌GN1，GN3和GN10及短乳桿菌GN7適宜作為高原地區(qū)低溫青貯發(fā)酵的備選菌株。

關(guān)鍵詞：甘南地區(qū)；青貯；低溫；乳酸菌

中圖分類號(hào)：Q939.11+7""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）07-2305-09

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.032

引用格式：

趙永琦， 尹國麗， 鞏海強(qiáng)，等.甘南地區(qū)青貯牧草耐低溫乳酸菌的篩選與鑒定［J］.草地學(xué)報(bào)，2024，32（7）：2305-2313

ZHAO Yong-qi， YIN Guo-li， GONG Hai-qiang，et al.Screening and Identification of Low-temperature Tolerant Lactic Acid Bacteria from Silage Grass in Gannan Region［J］.Acta Agrestia Sinica，2024，32（7）：2305-2313

Screening and Identification of Low-temperature Tolerant Lactic Acid

Bacteria from Silage Grass in Gannan Region

ZHAO Yong-qi， YIN Guo-li*， GONG Hai-qiang， LIANG Wen-bin， LEI Qing

（College of Pratacultural Science， Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland Ecosystem/Pratacultural Engineering

Laboratory of Gansu Province， Ministry of Education， Lanzhou， Gansu Province 730070， China）

Abstract：In order to screen out excellent lactic acid bacteria strains for low-temperature silage in alpine areas，the experiment isolated lactic acid bacteria strains from three types of pasture silage：Vicia sativa，Triticosecale wittmack and Avena sativa，screened them through low-temperature culture and acid production tests，identified their morphology，physiology and biochemistry，and analyzed 16S rDNA homology. The results showed that 42 strains of lactic acid bacteria were isolated and purified from 3 types of pasture silage，and 10 strains of low-temperature tolerant lactic acid bacteria with strong low-temperature growth ability and acid production ability were screened，of which 7 strains were homofermentative lactic acid bacteria and 3 strains were heterofermentative lactic acid bacteria. All 10 strains had good acid resistance，salt tolerance and temperature tolerance. According to homology sequencing analysis，strains GN1，GN3 and GN10 were Lactiplantibacillus plantarum，strains GN2，GN4 and GN7 were Levilactobacillus brevis，strains GN5 and GN6 were Latilactobacillus curvatus，and strains GN8 and GN9 were Latilactobacillus sakei subsp.. Taking into account various results such as the acid production ability，low-temperature growth ability and physiological and biochemical characteristics of low-temperature tolerant lactic acid bacteria，Lactobacillus plantarum GN1，GN3 and GN10 and Lactobacillus brevis GN7 were suitable as candidate strains for low-temperature silage fermentation in plateau areas.

Key words：Gannan region;Silage;Low temperature;Lactic acid bacteria

收稿日期：2023-12-21；修回日期：2024-03-04

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-34）；2022年甘肅省高等學(xué)校產(chǎn)業(yè)支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2022CYCZ-50）資助

作者簡(jiǎn)介：

趙永琦（1998-），男，藏族，甘肅蘭州人，碩士研究生，主要從事飼草學(xué)研究，E-mail：835367676@qq.com；*通信作者 Author for correspondence，E-mail：ygl@gsau.edu.cn

甘南地區(qū)平均海拔3 000 m，草地面積260.25萬 hm2［1］，是青藏高原重要的畜牧業(yè)基地［2］。青藏高原海拔較高，氣候寒冷，冷季較長，牧草生長期較短，牧草產(chǎn)量低，牧草季節(jié)性供給不平衡成為制約甘南地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的重要因素［3］。發(fā)展成本較低的青貯牧草飼料是解決牧草季節(jié)性供給不平衡和長期保存牧草飼料的重要方法，也是促進(jìn)甘南地區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展的有效措施。青貯發(fā)酵是復(fù)雜的微生物活動(dòng)和生物化學(xué)反應(yīng)過程，多種微生物共同參與發(fā)酵過程，乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是青貯過程中的主導(dǎo)微生物，利用飼料中可溶性碳水化合物發(fā)酵生成乳酸、乙酸等有機(jī)酸，迅速降低青貯環(huán)境中pH值，抑制有害微生物生長，達(dá)到長期保存的目的［4］。

環(huán)境溫度對(duì)青貯品質(zhì)影響較大，Zhang等［5］研究發(fā)現(xiàn)青貯適宜溫度為20～40℃，過高或過低都會(huì)影響青貯品質(zhì)，甘南地區(qū)年平均溫度1～3℃，低于青貯適宜溫度［6］。徐煒［7］研究發(fā)現(xiàn)受甘南地區(qū)氣候條件影響，自然青貯牧草中pH值和氨態(tài)氮含量高，干物質(zhì)、可溶性糖和乳酸含量低，牧草青貯品質(zhì)差。同時(shí)，溫度也會(huì)影響乳酸菌生長和繁殖并降低其產(chǎn)酸能力，從而延長青貯發(fā)酵時(shí)間，造成青貯發(fā)酵不完全。Pang等［8］發(fā)現(xiàn)乳酸菌含量最低為105 cfu·g-1時(shí)青貯發(fā)酵品質(zhì)較好，若含量低于104 cfu·g-1 則不能保證青貯品質(zhì)。苜蓿（Medicago sativa）在4℃條件下青貯30 d后乳酸菌含量達(dá)105 cfu·g-1，在25℃條件下青貯15 d后乳酸菌含量達(dá)105 cfu·g-1，低溫下乳酸菌生長繁殖能力明顯降低，青貯發(fā)酵所需的時(shí)間延長，增加了青貯過程中營養(yǎng)物質(zhì)的損耗。添加耐低溫乳酸菌菌株可以縮短低溫發(fā)酵時(shí)間，保安安等［9］從垂穗披堿草（Elymus nutans Griseb.）中分離出的1株耐低溫植物乳桿菌進(jìn)行低溫青貯，發(fā)現(xiàn)耐低溫菌株在低溫條件下能夠縮短低溫青貯時(shí)間并減少青貯過程中營養(yǎng)物質(zhì)的消耗。添加耐低溫乳酸菌可以降低低溫對(duì)青貯品質(zhì)的影響［10］，柴繼寬等［11］將篩選出的耐低溫乳酸菌添加至燕麥（Avena sativa L.）中在15℃，10℃和5℃下青貯45 d后發(fā)現(xiàn)其與空白對(duì)照組及商用對(duì)照組相比均顯著改善了青貯飼料的青貯品質(zhì)。

篩選適宜高寒地區(qū)環(huán)境的耐低溫乳酸菌是解決飼料青貯時(shí)間長、發(fā)酵不完全問題的有效方法。因此，本試驗(yàn)以甘南地區(qū)3種常見飼用牧草資源為材料，分離篩選出具有良好耐低溫能力和產(chǎn)酸能力的本土菌株，以期為解決牧草季節(jié)性供給不平衡和牧草飼料長期保存的問題提供適宜低溫青貯的乳酸菌菌種資源，為青藏高原地區(qū)牧草青貯生產(chǎn)提供依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)樣品

試驗(yàn)地位于甘南藏族自治州夏河縣，地理坐標(biāo)為102°95′N，34°99′E，海拔高度2 690 m，該地區(qū)氣候?yàn)楦咴箨懶詺夂?，平均氣溫?～13℃之間，寒冷濕潤，年均溫普遍低于3℃，氣溫年較差一般在20～22℃之間［12］。

樣品處理：于2022年9月17日在試驗(yàn)地收獲結(jié)莢期箭筈豌豆（Vicia sativa）、完熟期小黑麥（Triticosecale wittmack）和乳熟期燕麥（Avena sativa），將箭筈豌豆、小黑麥和燕麥草樣剪碎至2～3 cm，用30 cm×30 cm聚乙烯袋裝500 g草樣后真空密封，培養(yǎng)箱5℃溫度下進(jìn)行青貯。

菌種來源：乳酸菌分離于青貯120 d箭筈豌豆、小黑麥和燕麥樣品中，保存于-80℃超低溫冰箱。

1.2" 乳酸菌的分離與純化

取青貯120 d小黑麥、箭筈豌豆和燕麥樣品5 g放入45 mL無菌水，搖床150 r·min-1震蕩12 h，取1 mL加入到裝有9 mL無菌水的試管中進(jìn)行稀釋，依次稀釋至10-3，10-4，10-5，10-6和10-7倍5個(gè)梯度，于10-4，10-5，10-6和10-7倍4個(gè)濃度梯中分別取200 μL在MRS固體培養(yǎng)基上涂布后放置37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24～48 h［13］，挑選典型菌落，進(jìn)行平板劃線純化培養(yǎng)，不斷純化培養(yǎng)直到獲得純菌株。將純化后的純菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和過氧化氫酶測(cè)驗(yàn)，將革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶陰性菌株［14］用MRS液體培養(yǎng)基進(jìn)行富集，與甘油混合封裝，置于-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆茫?5］。

1.3" 耐低溫乳酸菌篩選

將菌株于液體培養(yǎng)基中活化2次，以2%相對(duì)體積接種量分別接種于pH值為3.0，4.0，5.0和6.0的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，每株取3個(gè)平行樣測(cè)定pH值，探究乳酸菌的耐酸能力；以2%相對(duì)體積接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基，分別放置于5℃，10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃和45℃溫度條件下培養(yǎng)2 d，每株取3個(gè)平行樣測(cè)定在波長600 nm時(shí)的OD值，探究乳酸菌對(duì)不同溫度的適應(yīng)能力；以2%相對(duì)體積接種量分別接種于NaCl濃度為3.0%，6.0%和9.0%的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，每株取3個(gè)平行樣測(cè)定在波長600 nm時(shí)的OD值，探究乳酸菌的耐鹽能力。根據(jù)乳酸菌實(shí)際生長狀況，篩選出抗逆性強(qiáng)的耐低溫乳酸菌菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4" 乳酸菌形態(tài)及生理生化鑒定

觀察乳酸菌的菌體特征，挑取單菌落進(jìn)行油鏡鏡檢、葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)及碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)，將篩選出的耐低溫乳酸菌進(jìn)行基本生理生化特性檢測(cè)［16］。

1.5" 耐低溫乳酸菌產(chǎn)酸試驗(yàn)及不同溫度生長試驗(yàn)

將上述活化后的乳酸菌菌株以2%相對(duì)體積接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，因5℃和10℃溫度條件下乳酸菌生長速度較慢，故將溫度控制在15℃，25℃和35℃三個(gè)溫度梯度下培養(yǎng)24 h，以未加菌懸液的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，每4 h取一次樣，每株取3個(gè)平行樣，測(cè)定各樣品在波長600 nm時(shí)的OD值；將菌株于液體培養(yǎng)基中活化2次，以2%相對(duì)體積接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中在37℃溫度條件下培養(yǎng)24 h，以未加菌懸液的空白培養(yǎng)基為對(duì)照，每4 h取一次樣，每株取3個(gè)平行樣，測(cè)定各菌株pH值。

1.6" 乳酸菌16S rDNA的分子鑒定

將活化的菌株富集培養(yǎng)24 h后離心收集菌體，用試劑盒提取細(xì)菌DNA，用細(xì)菌16S rDNA的通用引物27F，1492R，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，9.5 μL ddH2O，總體積為25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，51℃退火45 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min后4℃保存［17］。檢測(cè)目的條帶后將擴(kuò)增產(chǎn)物送至擎科生物有限公司，測(cè)定耐低溫乳酸菌菌株基因序列信息。

將菌株基因序列信息與NCBI網(wǎng)站里的Gene Bank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，選擇與測(cè)定序列同源性最高的已知分類地位的菌種。從Gene Bank數(shù)據(jù)庫中下載已知菌株的16S rDNA基因序列，與所測(cè)菌株的16S rDNA序列采用Clustal進(jìn)行比對(duì)，用MEGA11軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹（Phylogeny tree），確定各菌株分類地位［18］。

1.7" 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，用IBM SPSS Statistics 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析，MEGA11軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹［19］，Origin 2022繪制折線圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1 "乳酸菌分離純化及低溫復(fù)篩

通過分離MRS培養(yǎng)基上單個(gè)菌株初步獲得42株乳酸菌。對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶試驗(yàn)和葡萄糖產(chǎn)氣試驗(yàn)，將革蘭氏染色陽性和過氧化氫酶陰性的菌株于5℃，10℃和15℃下分別進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)生長狀況進(jìn)行篩選，最終得到10株耐低溫乳酸菌（表1）。GN3和GN10菌落顏色呈黃色，10株菌株形狀均為桿狀，革蘭氏染色呈紫色，過氧化氫酶反應(yīng)呈陰性，其中GN1，GN3，GN5，GN6，GN8，GN9和GN10為同型發(fā)酵乳酸菌，GN2，GN4和GN7為異型發(fā)酵乳酸菌。

2.2" 耐低溫乳酸菌生理生化特性分析

10株耐低溫乳酸菌生理生化特性如表2所示，所有菌株均能在pH6.0，5.0和4.0下正常生長，pH3.0時(shí)菌株GN1，GN5和GN6可以正常生長，其余菌株可以微弱生長。耐鹽性試驗(yàn)中，所有菌株均表現(xiàn)出較好的耐鹽性，均能在NaCl濃度為3.00%和6.00%時(shí)正常生長；在NaCl濃度為9.00%時(shí)GN1菌株和GN10菌株可以微弱生長，其余8種菌株均不能生長。在溫度適應(yīng)性測(cè)試中，所有菌株均能在10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃和40℃下正常生長；在5℃條件下，菌株GN2，GN4，GN8和GN9可以微弱生長，其他菌株均能正常生長；在45℃條件下，菌株GN2，GN4，GN7和GN9可以微弱生長，其余菌株均能正常生長。

10株乳酸菌碳源發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，10株菌株均可與果糖、葡萄糖、葡萄糖酸鹽、麥芽糖和蜜二糖發(fā)生正常反應(yīng)，均不與鼠李糖發(fā)生反應(yīng)。菌株GN1，GN3和GN10與松三糖微弱反應(yīng)，與除鼠李糖外的其他碳源均能正常反應(yīng)，結(jié)合伯杰細(xì)菌手冊(cè)（第八版）［20］和他人研究結(jié)果［21］，初步推斷菌株GN1，GN3和GN10為植物乳桿菌；菌株GN2，GN4和GN7均不與松三糖、七葉苷、山梨醇、甘露糖、水楊素和纖維二糖發(fā)生反應(yīng)，均與棉子糖和乳糖發(fā)生微弱反應(yīng)，GN7菌株與甘露醇與蔗糖發(fā)生微弱反應(yīng)，GN2菌株和GN4菌株均不與甘露醇、蕈糖與蔗糖發(fā)生正常反應(yīng)，但GN7菌株與蕈糖發(fā)生正常反應(yīng)，初步推斷菌株GN2，GN4和GN7為同屬不同種菌株；GN5菌株和GN6菌株碳源發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為相似，均不與阿拉伯糖、松三糖、棉子糖、甘露醇、蔗糖和山梨醇發(fā)生反應(yīng)，與其他碳源正常發(fā)生反應(yīng)，故推斷GN5菌株和GN6菌株為同屬菌株；GN8菌株和GN9菌株均不與松三糖、甘露糖、水楊素、棉子糖、甘露醇、蕈糖、山梨醇和苦杏仁苷發(fā)生反應(yīng)，GN8菌株與半乳糖發(fā)生微弱反應(yīng)，與七葉苷不發(fā)生反應(yīng)，GN9菌株與半乳糖和七葉苷發(fā)生正常反應(yīng)。

2.3" 耐低溫乳酸菌產(chǎn)酸能力及低溫生長特性

耐低溫乳酸菌產(chǎn)酸速率如圖1所示，培養(yǎng)4 h時(shí)，GN10菌株產(chǎn)酸速率最快，pH值降至5.52，顯著低于其他菌株（Plt;0.05）；菌株GN1，GN3，GN6，GN7，GN8和GN10在培養(yǎng)8 h時(shí)產(chǎn)酸速率較快，pH值均降至5.0以下，顯著低于其他菌株（Plt;0.05）；在培養(yǎng)12 h時(shí)GN6菌株產(chǎn)酸速率最快，pH值降至4.09，顯著低于其他菌株（Plt;0.05），其次是GN1和GN10菌株，pH值降至4.11，顯著低于除GN6菌株外的其他菌株；培養(yǎng)16 h時(shí)菌株GN1和GN6產(chǎn)酸速率最快，pH值降低至4.0以下；培養(yǎng)20 h時(shí)，除菌株GN2，GN4，GN5和GN9以外，其他菌株pH均降至4.0以下；培養(yǎng)24 h時(shí)，GN1菌株產(chǎn)酸速率最快，pH值降至3.69顯著低于其他處理（Plt;0.05），其次是菌株GN6，GN7，GN10和GN3，pH值分別降至3.77，3.78，3.82和3.85，顯著低于其他菌株（Plt;0.05）。

耐低溫乳酸菌在15℃下的生長速率如表4所示，在0～8 h時(shí)，GN6菌株生長速率最快，其次是GN1菌株，GN9菌株生長速率最慢，菌株GN1，GN3，GN6，GN7，GN8和GN10處于對(duì)數(shù)生長期；在8～12 h時(shí)，GN1菌株生長速率最快，顯著高于其他菌株（Plt;0.05），GN9菌株生長速率顯著低于其他菌株（Plt;0.05），菌株GN2，GN4，GN5和GN9處于對(duì)數(shù)生長期；在12～16 h時(shí)，GN1菌株生長速率最快顯著高于其他菌株（Plt;0.05），GN9菌株生長速率最慢顯著低于其他菌株（Plt;0.05）；在16～24 h時(shí)GN1菌株生長速率最快顯著高于其他菌株（Plt;0.05），其次是GN7菌株和GN6菌株。

耐低溫乳酸菌在25℃下的生長速率如表5所示，在0～8 h時(shí)，GN6生長速率最快，顯著高于其他處理（Plt;0.05），GN8和GN9生長速率最慢，顯著低于其他處理（Plt;0.05），除GN8和GN9外其它菌株均處于對(duì)數(shù)生長期，GN9菌株在8～12 h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長期，GN8菌株在12～16 h時(shí)處于對(duì)數(shù)生長期；在20 h時(shí)菌株GN1，GN3，GN5，GN6和GN10生長速率達(dá)到最高，菌株GN1，GN3，GN6和GN10生長速率較快顯著高于其他菌株（Plt;0.05），GN2菌株生長速率最慢顯著低于其他處理（Plt;0.05）；在24 h時(shí)，菌株GN1，GN3，GN6，GN7和GN10生長速率較快顯著高于其他處理（Plt;0.05），GN2菌株和GN5菌株生長速率較慢，顯著低于其他處理（Plt;0.05），GN1菌株和GN3菌株生長速率相較20 h時(shí)沒有發(fā)生變化，菌株GN5，GN6和GN10生長速率相較20 h時(shí)降低，菌株GN1，GN3，GN5，GN6和GN10生長速率接近飽和處于生長穩(wěn)定期。

耐低溫乳酸菌在35℃下的生長速率如表6所示，在4～8 h時(shí)10株菌株均處于對(duì)數(shù)生長期，GN10菌株生長速率最高，顯著高于其他菌株（Plt;0.05），GN9生長速率最低，顯著低于其它菌株（Plt;0.05）；在8～16 h時(shí)，菌株GN10和GN1生長速率顯著高于其它菌株（Plt;0.05），GN4菌株生長速率顯著低于其它菌株（Plt;0.05）；在16～24 h，菌株GN1，GN2，GN3，GN6，GN7，GN8和GN10生長速率顯著高于其它菌株（Plt;0.05），24 h時(shí)菌株GN1，GN3，GN5，GN6，GN8和GN10生長速率相較于20 h降低，表明生長速率接近飽和處于生長穩(wěn)定期。

2.4" 耐低溫乳酸菌16S rDNA同源性序列分析

經(jīng)16S rDNA測(cè)序及同源性分析發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)中篩選出的耐低溫乳酸菌分屬植物乳桿菌、彎曲乳桿菌、短乳桿菌和清酒乳桿菌四個(gè)種，GN1，GN3和GN10與植物乳桿菌相似度最高，GN2，GN4和GN7與短乳桿菌相似度最高，GN5和GN6與彎曲乳桿菌相似度最高，GN8和GN9與清酒乳桿菌相似度最高。

3" 討論

溫度對(duì)微生物生長繁殖的影響是決定青貯品質(zhì)的重要因素［22］。乳酸菌是青貯過程中的主導(dǎo)微生物，低溫不利于乳酸菌的生長和繁殖，乳酸菌的生長溫度是5～55℃，適宜生長溫度為30～40℃［23］，適宜的溫度促使乳酸菌代謝所需的酶呈現(xiàn)出較高的活性，使得乳酸菌最大程度地產(chǎn)生有機(jī)酸。Guchte等［24］研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌對(duì)溫度變化具有較好的適應(yīng)性，最適宜溫度為20～45℃，與Zhang等［5］研究發(fā)現(xiàn)青貯適宜溫度為20～40℃相吻合，說明溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵性能的影響和溫度對(duì)青貯品質(zhì)的影響相互關(guān)聯(lián)，分離篩選耐低溫乳酸菌可以提升青藏高原地區(qū)低溫青貯飼料的青貯品質(zhì)［25］。

本次試驗(yàn)中篩選出菌株GN1，GN3，GN5，GN6，GN7，GN10在5℃低溫條件下均可正常生長，其余菌株微弱生長，10株菌株在10℃溫度條件下均可正常生長，該研究結(jié)果與藺豆豆等［26］從青藏高原燕麥中分離耐低溫乳酸菌結(jié)果相似，而張紅梅［27］從青藏高原垂穗披堿草中篩選出的耐低溫乳酸菌在4℃低溫條件下完全不能生長，10℃溫度條件下微弱生長，研究結(jié)果與本結(jié)果不同，可能因?yàn)椴煌N牧草中分離出乳酸菌生長能力存在差異。篩選出的10株乳酸菌中有7株同型乳酸菌和3株異型乳酸菌，3株同型乳酸菌展現(xiàn)出較強(qiáng)的耐低溫能力和產(chǎn)酸能力，只有1株異型乳酸菌具有良好的耐低溫能力，多數(shù)同型發(fā)酵乳酸菌產(chǎn)酸能力強(qiáng)于異型發(fā)酵乳酸菌，這與Olstorpe等［28］研究結(jié)果相似。菌株GN1，GN3，GN6，GN7和GN10在15℃，25℃和35℃三個(gè)溫度條件下均表現(xiàn)出較強(qiáng)的生長能力，且在產(chǎn)酸試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的產(chǎn)酸能力，該研究結(jié)果與儲(chǔ)徐建等［29］研究結(jié)果相似，說明產(chǎn)酸能力與生長能力為正相關(guān)關(guān)系。10株菌株在15℃條件下生長速率低于25℃和35℃，且菌株進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期所需時(shí)間也隨著溫度的降低而延長，這與崔美巖［30］研究結(jié)果相似，說明低溫對(duì)乳酸菌的生長和繁殖有抑制作用。

10株菌株經(jīng)過16S rDNA測(cè)序比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，菌株GN1，GN3和GN10與植物乳桿菌相似度最高，菌株GN2，GN4和GN7與短乳桿菌相似度最高，菌株GN5和GN6與彎曲乳桿菌相似度最高，菌株GN8和GN9與清酒乳桿菌相似度最高。結(jié)合碳源發(fā)酵試驗(yàn)、同源性測(cè)序分析和前人研究結(jié)果可知［31］，菌株GN2，GN4和GN7同為Levilactobacillus brevis strain，菌株間同源性相似度較高，但GN7菌株與蔗糖和甘露醇發(fā)生微弱反應(yīng)，GN2和GN4菌株則不發(fā)生反應(yīng)，同時(shí)GN7菌株耐低溫能力和產(chǎn)酸能力也強(qiáng)于GN2和GN4菌株，此結(jié)果與Somashekaraiah等［32］研究結(jié)果相似，說明同源性相似度較高的不同來源乳酸菌中存在差異。菌株GN1，GN3和GN10同為植物乳桿菌且均具有較強(qiáng)的耐低溫能力和產(chǎn)酸能力，同時(shí)能夠發(fā)酵的碳源也多于其他菌株，適宜作為青貯添加菌劑，與張慧杰等［33］研究結(jié)果相似。菌株GN7為短乳桿菌，耐低溫能力和產(chǎn)酸能力較強(qiáng)，且異型發(fā)酵乳酸菌可以提高青貯飼料開窖后有氧穩(wěn)定性，減少有氧發(fā)酵提升青貯品質(zhì)［34］，適宜作為異型發(fā)酵乳酸菌添加劑。綜上，菌株GN1，GN3，GN7和GN10適宜作為青藏高原地區(qū)低溫青貯乳酸菌添加劑的潛力菌株。

4" 結(jié)論

從甘南地區(qū)三種青貯牧草中初步純化得到42株乳酸菌，進(jìn)行低溫生長試驗(yàn)和產(chǎn)酸試驗(yàn)篩選得到10株耐低溫乳酸菌，10株菌株均表現(xiàn)出較好的耐低溫、耐酸和耐鹽能力，其中7株為同型乳酸菌，3株為異型乳酸菌。對(duì)10株菌株進(jìn)行生理生化測(cè)定、不同溫度生長測(cè)定、產(chǎn)酸試驗(yàn)和16S rDNA同源性測(cè)序分析，最終得到的10株菌株中3株為植物乳桿菌，3株為短乳桿菌，2株為彎曲乳桿菌，2株為清酒乳桿菌。綜合考慮菌株的耐低溫能力、產(chǎn)酸能力、生理生化性質(zhì)和生長速率，植物乳桿菌GN1，GN3和GN10，短乳桿菌GN7可以作為青藏高原地區(qū)低溫青貯添加劑的添加菌株。

參考文獻(xiàn)

［1］" 劉興元，陳全功，王永寧. 甘南草地退化對(duì)生態(tài)安全與經(jīng)濟(jì)發(fā)展的影響［J］. 草業(yè)科學(xué)，2006，23（12）：39-42

［2］" 姚寶輝，王纏，郭懷亮，等. 人工草地建設(shè)對(duì)甘南草原土壤理化特性和微生物數(shù)量特征的影響［J］. 水土保持學(xué)報(bào)，2019，33（1）：192-199

［3］" 許冬梅，曹蕾，荊佩欣，等. 青藏高原幾種牧草附著耐低溫乳酸菌的篩選［J］. 微生物學(xué)雜志，2017，37（3）：87-94

［4］" 洪梅，刁其玉，閆貴龍，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化青貯飼料乳酸菌的培養(yǎng)條件［J］. 動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)報(bào)，2010，22（5）：1307-1313

［5］" ZHANG J G，KAWAMOTO H，CAI Y M. Relationships between the addition rates of cellulase or glucose and silage fermentation at different temperatures［J］. Animal ence Journal，2010，81（3）：325-330

［6］" 蘇軍虎，JI W H，徐長林，等. 甘南草原主要草食動(dòng)物的食性及其生態(tài)位特征［J］. 動(dòng)物學(xué)雜志，2017，52（3）：381-389

［7］" 徐煒. 青藏高原高寒牧區(qū)紫花苜蓿青貯及青干草調(diào)制研究［D］. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015：34-78

［8］" PANG H，TAN Z，QIN G，et al. Phenotypic and phylogenetic analysis of lactic acid bacteria isolated from forage crops and grasses in the Tibetan Plateau［J］. The Journal of Microbiology，2012，50（1）：63-71

［9］" 保安安，張娟，張紅梅，等. 青藏高原垂穗披堿草青貯飼料中乳酸菌的多樣性及低溫發(fā)酵菌株的篩選［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2016，43（8）：1785-1794

［10］荊佩欣，張紅梅，曹蕾，等. 青藏高原耐低溫乳酸菌在垂穗披堿草青貯中的應(yīng)用［J］. 草業(yè)科學(xué)，2017，34（11）：2396-2402

［11］柴繼寬，趙桂琴，琚澤亮. 添加不同乳酸菌對(duì)燕麥低溫青貯發(fā)酵的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（3）：923-928

［12］趙玉宇，黃德君，毛祝新，等. 青藏高原地區(qū)不同垂穗披堿草居群營養(yǎng)品質(zhì)研究［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2013，22（1）：38-45

［13］孫寧，雷敬玲，吳曉青，等. 自然發(fā)酵酸筍中乳酸菌的篩選鑒定及益生特性研究［J］. 中國釀造，2020，39（6）：63-68

［14］呼斯楞，劉紅新，于潔，等. 內(nèi)蒙古呼倫貝爾地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳中乳酸菌的多樣性分析［J］. 微生物學(xué)通報(bào)，2016，43（5）：984-990

［15］MATHARA J M，SCHILLINGER U，KUTIMA P M，et al. Isolation，identification and characterisation of the dominant microorganisms of kule naoto：the Maasai traditional fermented milk in Kenya［J］. International Journal of Food Microbiology，2004，94（3）：269-278

［16］高熳熳，焦新雅，張志勝，等. 侗族傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉中乳酸菌的篩選、發(fā)酵特性及安全性分析［J］. 食品工業(yè)科技，2020，41（12）：94-99，105

［17］鞏海強(qiáng)，柴繼寬，陳三冬，等. 抑制黃曲霉乳酸菌的篩選與鑒定［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（2）：587-595

［18］琚澤亮. 青藏高原燕麥附著耐低溫乳酸菌篩選及其青貯發(fā)酵性能研究［D］. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2022：26-37

［19］關(guān)皓，曾泰儒，帥楊，等. 西南高溫高濕地區(qū)青貯中天然乳酸菌群落結(jié)構(gòu)特征及優(yōu)質(zhì)乳酸菌的篩選［J］. 草業(yè)科學(xué)，2019，36（12）：3203-3213

［20］布坎南，吉本斯. 伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)（第八版）［M］. 中國科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯阻譯.北京：科學(xué)出版社，1995：797-828

［21］魏艷，曾小群，潘道東，等. 新疆地區(qū)不同酸奶中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的分離與鑒定［J］. 中國食品學(xué)報(bào)，2012，12（12）：161-166

［22］徐春城. 現(xiàn)代青貯理論與技術(shù)［M］. 北京：科學(xué)出版社，2013：68-73

［23］尹勝利，杜鑒，徐晨. 乳酸菌的研究現(xiàn)狀及其應(yīng)用［J］. 食品科技，2012，37（9）：25-29

［24］GUCHTE M V D，SERROR P，CHERVAUX C，et al. Stress responses in lactic acid bacteria［J］. Antonie Van Leeuwenhoek，2002，82（1-4）：187-216

［25］李海萍，關(guān)皓，賈志鋒，等. 添加麥麩和乳酸菌對(duì)川西北高寒地區(qū)燕麥裹包青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的影響［J］. 草地學(xué)報(bào)，2023，31（1）：302-310

［26］藺豆豆，琚澤亮，柴繼寬，等. 青藏高原燕麥附著耐低溫乳酸菌的篩選與鑒定［J］. 草業(yè)學(xué)報(bào)，2022，31（5）：103-114

［27］張紅梅. 青藏高原不同海拔區(qū)垂穗披堿草發(fā)酵特性及耐低溫乳酸菌篩選研究［D］. 蘭州：蘭州大學(xué)，2016：15-25

［28］OLSTORPE M，LYBERG K，LINDBERG J E，et al. Population diversity of yeasts and lactic acid bacteria in pig feed fermented with whey，wet wheat distillers’ grains，or water at different temperatures［J］. Applied and Environmental Microbiology，2008，74（6）：1696-1703

［29］儲(chǔ)徐建，李長慧，劉明燦，等. 耐低溫乳酸菌的分離與優(yōu)化培養(yǎng)［J］. 草業(yè)科學(xué)，2014，31（7）：1380-1387

［30］崔美巖. 青藏高原不同材料來源乳酸菌極端環(huán)境耐受性及優(yōu)良菌株益生性的初步研究［D］. 鄭州：鄭州大學(xué)，2017：19-36

［31］凌代文. 乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法［M］. 北京：中國輕工業(yè)出版社，1998：6-67

［32］SOMASHEKARAIAH R，MOTTAWEA W，GUNDURAJ A，et al. Probiotic and antifungal attributes of Levilactobacillus brevis MYSN105，isolated from an Indian traditional fermented food Pozha［J］. Frontiers in Microbiology，2021，12：696267

［33］張慧杰，玉柱，王林，等. 青貯飼料中乳酸菌的分離鑒定及優(yōu)良菌株篩選［J］. 草地學(xué)報(bào)，2011，19（1）：137-141

［34］王旭哲，張凡凡，馬春暉，等. 同/異型乳酸菌對(duì)青貯玉米開窖后品質(zhì)及微生物的影響［J］. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2018，34（10）：296-304

（責(zé)任編輯" 閔芝智）