摘要：本研究旨在探究不同溫度下添加不同濃度苯乳酸（Phenyl lactic acid，PLA）對玉米（Zea mays L.）秸稈青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)、抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）和可移動遺傳元件（Mobile genetic genes，MGEs）豐度變化的影響。采用雙因素（苯乳酸×溫度）完全隨機設(shè)計，溫度設(shè)定20℃和30℃，苯乳酸設(shè)置添加組（0.2% PLA和0.4% PLA）和對照組（CK），30 d后取樣分析青貯品質(zhì)。結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著PLA濃度增加，兩種溫度下的pH值、乳酸菌數(shù)量和乙酸含量均顯著增加（Plt;0.05）。酵母菌數(shù)量隨著PLA濃度增加而增加，而乳酸和氨態(tài)氮含量隨之下降。與20℃相比，30℃條件下自然青貯的玉米秸稈飼料pH值顯著增加，乳酸菌數(shù)量顯著下降（Plt;0.05）。本試驗所檢測的ARGs屬于大環(huán)內(nèi)脂類、磺胺類和四環(huán)素類抗性基因，添加PLA發(fā)酵30 d后，與對照組相比，這些ARGs和MGEs絕對豐度均顯著下降（Plt;0.05），其中sul1，sul2，sul3，ermB，tetC與Tn916/1545豐度變化趨勢相似，Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)兩者之間具有極顯著正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.01）。綜上，兩種溫度條件下，添加PLA對玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)均具有改善作用，可以減少ARGs的污染。

關(guān)鍵詞：玉米秸稈；抗生素抗性基因；苯乳酸；溫度；青貯

中圖分類號：S816.5+3""" 文獻標(biāo)識碼：A""""" 文章編號：1007-0435（2024）07-2290-07

doi：10.11733/j.issn.1007-0435.2024.07.030

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收稿日期：2024-04-17；修回日期：2024-05-21

基金項目：國家重點研發(fā)項目（2022YFE0111000-2，2022YFD1300901）資助

作者簡介：

楊丹（1999-），女，漢族，碩士研究生，江西南昌人，主要從事牧草青貯加工研究，E-mail：ydycbwywtb@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：zqing1988@126.com

Impacts of Phenyllactic Acid and Temperature on the Fermentation Quality and

Antibiotic Resistance Genes of Corn Straw Silage

YANG Dan， YIN Han-xue， ZHANG Qing*

（College of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou，

Guangdong Province 510642， China）

Abstract：This study aimed to investigate the effects of adding different concentrations of phenyl lactic acid （PLA） at various temperatures on the fermentation quality，abundance changes of antibiotic resistance genes （ARGs），and mobile genetic elements （MGEs） of corn （Zea mays L.） straw silage. A two-factor completely randomized design was employed，with PLA concentration and temperature as the factors. The experimental groups included a control group （CK） and addition groups （0.2%PLA and 0.4%PLA） at temperatures of 20℃ and 30℃. After 30 days，samples were collected for analysis of silage quality. The results revealed that the addition of PLA significantly increased the pH value and the quantity of lactic acid bacteria at both temperatures （Plt;0.05）. At a storage temperature of 20℃，there was a significant increase in acetic acid content （Plt;0.05），while ammonia nitrogen content decreased. Moreover，the number of lactic acid bacteria and butyric acid content were significantly higher at 20℃ compared to 30℃ （Plt;0.05）. The detected ARGs in this experiment belonged to the macrolide，sulfonamide，and tetracycline classes of resistance genes. After 30 days of fermentation with PLA addition，the absolute abundances of these ARGs and MGEs significantly decreased （Plt;0.05）. Among them，sul1，sul2，sul3，ermB， tetC，and Tn916/1545 exhibited similar trends in abundance changes，and Pearson correlation analysis revealed a highly significant positive correlation between them （Plt;0.01）.In conclusion，the addition of PLA to corn straw silage improved the fermentation quality and reduced pollution from ARGs under both temperature conditions.

Key words：Corn straw;Antibiotic resistance genes;Phenyllactic acid;Temperature;Silage

玉米（Zea mays L.）是我國的主要糧食作物之一，其種植面積大，給我國提供了豐富的秸稈資源［1］。玉米秸稈作為我國反芻家畜的主要粗飼料來源，含有豐富的營養(yǎng)成分，在實際生產(chǎn)中，由于收獲期早、含水量高等因素，玉米秸稈的使用十分困難，一旦處理不當(dāng)，不僅加劇環(huán)境污染，還會造成生物資源浪費［2］。青貯是一項提高秸稈利用率且能夠有效解決北方春冬季節(jié)飼料均衡供應(yīng)問題的重要技術(shù)，將玉米秸稈進行青貯處理可以有效解決畜牧業(yè)青貯飼料短缺問題，是一種經(jīng)濟實用的飼料化利用方式［3］。

人類大量濫用抗生素，導(dǎo)致不同生態(tài)環(huán)境下逐漸出現(xiàn)較多具有抗生素抗性且攜帶抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）的微生物［4-5］。大量研究表明，ARGs可從被污染的土壤、水源和糞便中通過水平基因轉(zhuǎn)移，從一個微生物菌株轉(zhuǎn)移至另一個微生物菌株，相互獲得抗性基因，再由根際或葉際微生物菌群轉(zhuǎn)移至植物中，攜帶ARGs的細(xì)菌以多種方式定植在植物體內(nèi)，最終通過食物鏈傳遞到人體［6-8］。Wu等［9］在玉米籽粒青貯飼料通過宏基因組學(xué)手段檢測到ARGs的存在，發(fā)現(xiàn)添加香蘭素能夠提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)，但可能導(dǎo)致ARGs向食用青貯飼料的反芻動物轉(zhuǎn)移。飼料在青貯發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有害污染物，會在動物飼料與環(huán)境中長期存在，進而在食物鏈中積累，危害動物健康及畜產(chǎn)品安全［10］。ARGs作為近年來嚴(yán)重威脅人類健康的污染物，迫切需要人們采取有效措施來控制ARGs的大量傳播。

苯乳酸（Phenyl lactic acid，PLA）作為一種具有廣譜抑菌效果的新型天然生物防腐劑，安全系數(shù)和穩(wěn)定性較高，可抑制食源性致病菌、腐敗菌，特別是能防止真菌污染，被廣泛應(yīng)用于食品保鮮領(lǐng)域［11-12］。有研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過青貯廢水處理的水稻秸稈中添加不同濃度的苯乳酸，無論添加量如何，均有助于厭氧發(fā)酵時揮發(fā)性脂肪酸的形成，具備生產(chǎn)可再生能源的潛力［13］。Lu等［14］發(fā)現(xiàn)在蘆葦金絲雀草飼料中添加苯乳酸，有助于乳酸菌迅速增殖，抑制酵母菌生長，提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。Wang等［15］發(fā)現(xiàn)在蛋雞飼料中添加苯乳酸，不僅短期內(nèi)可以增強蛋雞的免疫力，還可以提高雞蛋的產(chǎn)量與品質(zhì)，同時提高飼料的利用率。然而，目前大多數(shù)研究報道都集中在苯乳酸對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的改善作用，關(guān)于添加苯乳酸對玉米秸稈青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和ARGs豐度影響的研究較少［16］。

另外，環(huán)境溫度對于青貯發(fā)酵是重要的影響因素之一［17］，中國南方地區(qū)高溫多雨的氣候條件可能對青貯飼料制作與貯藏造成一定負(fù)面影響。發(fā)酵過程中受氣候環(huán)境影響，青貯飼料的營養(yǎng)物質(zhì)和微生物結(jié)構(gòu)也會隨之變化。因此，本研究通過實時熒光定量技術(shù)對兩種溫度條件下經(jīng)過不同濃度的苯乳酸處理的玉米秸稈青貯飼料進行分析，為促進玉米秸稈在畜牧業(yè)中的應(yīng)用，提升飼料品質(zhì)，生產(chǎn)營養(yǎng)安全的青貯飼料提供科學(xué)依據(jù)，同時為降低ARGs的傳播風(fēng)險提供了新思路。

1" 材料與方法

1.1" 試驗原料

本試驗所選用的玉米為‘華美甜12號’，種植于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林北試驗田（23°16′ N，113°36′ E），玉米秸稈為2023年12月收割的蠟熟期去穂玉米秸稈，苯乳酸購自上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.2" 試驗設(shè)計

本試驗采用雙因素完全隨機設(shè)計，因素一為添加不同濃度的苯乳酸，分別為0.2% PLA（PLA1）和0.4% PLA（PLA2），將添加等量的無菌生理鹽水作為對照（CK）組;因素二為不同貯藏溫度，分別為20℃（L）和30℃（H）。采集的新鮮玉米秸稈原料用鍘刀切成2 cm左右的大小，將不同濃度的苯乳酸噴灑在原料上混合均勻，之后把樣品分別裝入聚乙烯塑料包裝（20 cm×30 cm）袋中，每袋約100 g，真空密封機進行密封，共制作24袋青貯樣品（6個處理×4個重復(fù)），按照20℃和30℃分別進行較低溫和較高溫青貯，青貯30 d后分析青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)。

1.3" 青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)測定

1.3.1" 微生物數(shù)量測定" 青貯30 d后開袋，混合均勻后使用五點法稱取樣品10 g，并注入90 mL無菌生理鹽水充分振蕩后逐層稀釋，取100 μL不同梯度稀釋菌液涂布在孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基上，28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d以便于酵母菌和霉菌計數(shù)。取1 mL不同梯度菌液于MRS瓊脂培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)乳酸菌和大腸桿菌2 d后計數(shù)（所使用的培養(yǎng)基均購于廣州鼎國生物技術(shù)有限公司）［18］。

1.3.2" pH值及有機酸測定" 從樣品中取10 g于自封袋中與90 mL蒸餾水混合搖勻，放置4℃冰箱保存24 h后取出，用濾紙過濾后使用雷磁PHS-3C型pH計（上海市精密科學(xué)儀器有限公司）測定濾液的pH值。剩余濾液經(jīng)0.22 μm孔徑的濾膜進行過濾，采用島津GC-14型高效液相色譜儀測定有機酸（乳酸、乙酸、丙酸和丁酸）含量［19］。

1.3.3" 化學(xué)成分測定" 采用蒽酮比色法測定可溶性碳水化合物，用葡萄糖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品煮沸10 min，冷卻過濾定容，吸取搖勻后加入蒽酮，在620 nm波長下測定吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算原料中所含可溶性碳水化合物含量［20］。取適量樣品，稱重記錄，置于65℃恒溫干燥箱烘干48 h，計算樣品烘干后的重量與烘干前的重量的百分比就是干物質(zhì)含量。

1.4" 引物設(shè)計與合成

一共檢測了5種抗生素抗性基因，2種可移動基因元件（Mobile genetic elements，MGEs），包括磺胺類抗性基因（sul1，sul2和sul3）、大環(huán)內(nèi)酯類抗性基因（ermB）、四環(huán)素類抗性基因（tetC）以及MGEs（intl1和Tn916/1545）。引物序列均由北京擎科生物科技股份有限公司合成，具體引物序列和退火溫度詳見表1。

1.5" 樣品總DNA提取

選用天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取試劑盒，依照說明書提取玉米秸稈DNA。提取的DNA樣本通過NanoDrop ND-1000分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國）測定其濃度和純度，保存于-20℃冰箱儲存以便后續(xù)檢測ARGs和MGEs。

1.6" 熒光定量PCR

設(shè)計完ARGs引物，采用PCR儀對ARGs進行定性檢測。反應(yīng)體系為20 μL。PCR混合物為：8 μL Nuclease-free ddH2O，正向與反向引物各0.5 μL，Taq DNA聚合酶10 μL，DNA模板1 μL（其中DNA濃度范圍為10 ng·μL-1 ～ 103 ng·μL-1）。PCR升溫程序為：在95℃下初始變性3 min，在94℃下變性25 s，在退火溫度下退火25 s，72℃下延伸15 s，共進行35個循環(huán)，最后在72℃下延伸5 min。將PCR擴增產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖電泳，觀察目的基因片段，若條帶亮度高且單一，進行切膠回收，獲得目的基因片段。將目的基因片段連接至pGEM-T Easy載體，導(dǎo)入大腸桿菌（E.coli）感受態(tài)細(xì)胞DH5α，接種于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)過夜，進行藍(lán)白斑篩選。挑選陽性克隆子接種于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA，檢測DNA濃度和純度，然后由生工生物工程（上海，中國）股份有限公司測序分析，結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）進行比對，確保質(zhì)粒中存在目的基因。

1.7" 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

根據(jù)周雨婷［5］研究報道的公式計算目的基因拷貝數(shù)（copies）。將質(zhì)粒DNA進行10倍梯度稀釋進行qPCR擴增制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。使用RocheLightCycler480 PCR儀對ARGs進行定量分析，定量PCR引物與上述定性PCR測定中使用的相同，每個樣品均設(shè)3組平行樣。熔解曲線分析用于檢測是否存在非特異性擴增。qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的平方相關(guān)系數(shù)R2gt;0.99，擴增效率為90%～110%，用于計算ARGs拷貝數(shù)。

1.8" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有的統(tǒng)計分析均使用SPSS 24.0軟件完成，采用單因素方差分析以及Turkey法對不同濃度的苯乳酸添加處理的平均值差異進行多重比較，如果Plt;0.05，代表顯著性，并用不同字母標(biāo)記。利用GraphPad Prism 8繪制ARGs和MGEs絕對豐度的柱狀圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 對玉米秸稈發(fā)酵品質(zhì)的影響

不同溫度下添加苯乳酸對玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響如表2所示。隨著苯乳酸濃度增加，與對照組相比，兩種溫度條件下的pH值，乳酸菌數(shù)量和乙酸含量均顯著增加（Plt;0.05）。酵母菌數(shù)量隨著苯乳酸濃度增加而增加，而乳酸和氨態(tài)氮含量隨著苯乳酸濃度增加而減少。與20℃相比，30℃條件下自然青貯的玉米秸稈飼料pH值顯著下降，乳酸菌數(shù)量顯著升高（Plt;0.05）。

2.2" 對玉米秸稈青貯中ARGs和MGEs絕對豐度的影響

如圖1所示，青貯30天后添加苯乳酸對ARGs和MGEs的絕對豐度有顯著性影響（Plt;0.05）。與CK相比，除較高溫下PLA組的ermB，其余添加苯乳酸各處理組的ARGs豐度均顯著下降（Plt;0.05）。其中，較低溫條件下添加PLA，tetC絕對豐度降幅最大，從102.85拷貝數(shù)·g-1降低到102.38拷貝數(shù)·g-1和102.1拷貝數(shù)·g-1，降低了66%和82%；sul3絕對豐度降幅最小，由103.42拷貝數(shù)·g-1降低到103.20拷貝數(shù)·g-1和103.23拷貝數(shù)·g-1，僅降低了40%和35%；較高溫條件下添加PLA，sul3絕對豐度下降幅度最大，由104.49拷貝數(shù)·g-1降低到103.22拷貝數(shù)·g-1和103.22拷貝數(shù)·g-1，降低了95%和95%；ermB的豐度降幅最小，由103.38拷貝數(shù)·g-1降低到103.06拷貝數(shù)·g-1和103.27拷貝數(shù)·g-1，僅降低了52%和22%。與CK相比，添加苯乳酸均顯著降低了MGEs的絕對豐度（Plt;0.05）。其中，Tn916/1545的去除率最高，在83%～87%之間；intl1的去除率在21%～79%之間。

2.3" ARGs與MGEs之間相互關(guān)系

ARGs與MGEs之間的Pearson相關(guān)性分析見表3。結(jié)果顯示，sul1，sul2，sul3，ermB和tetC的絕對豐度與Tn916/1545的絕對豐度極顯著正相關(guān)（Plt;0.01），sul1，sul2，sul3和tetC的絕對豐度與intl1的絕對豐度極顯著負(fù)相關(guān)（Plt;0.01）。

3" 討論

3.1" 對玉米秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

在青貯過程中，乳酸菌迅速生長對青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)至關(guān)重要［17］。本研究中，添加0.2%PLA后乳酸菌數(shù)量較CK組顯著增加。常規(guī)青貯條件下，乳酸菌分解植物中的可溶性糖等發(fā)酵底物產(chǎn)生乳酸等有機酸，迅速降低pH值，抑制其他不良微生物的生長［18］。但有研究表明，PLA能抑制乳酸菌的活性，可能對青貯過程中LAB的產(chǎn)酸能力造成影響［24］。因此，本研究中兩種溫度下PLA處理的乳酸含量均低于CK組，PLA處理組的pH值均高于CK組。盡管添加PLA使pH值增加，但CK組和PLA1組的pH值均小于4.2，符合良好青貯發(fā)酵條件［25］。發(fā)酵30天后，所有PLA處理的酵母菌數(shù)量，PA和BA含量均高于CK組，可能是因為厭氧發(fā)酵過程中乳酸含量降低，pH值增加，微生物之間相互競爭營養(yǎng)物質(zhì)，酵母菌、梭菌等不良微生物利用可溶性糖等營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生乙醇、丁酸和氨等難聞氣體，降低青貯發(fā)酵品質(zhì)［26］。隨著貯藏溫度的升高，乳酸菌在高溫下不適宜生長，溫度越高乳酸菌數(shù)量越低，使得乳酸含量也越低，pH值越高，這一結(jié)論與李夢玉研究報道相符［27］。

3.2" 對玉米秸稈ARGs和MGEs絕對豐度的影響

在玉米秸稈青貯中檢測的ARGs大部分為大環(huán)內(nèi)脂類、磺胺類和四環(huán)素類抗性基因［28］?；前奉愒谛笄蒺B(yǎng)殖中常被單獨或與其他抗生素聯(lián)用于預(yù)防和治療腹瀉等細(xì)菌性感染疾?。?］。大環(huán)內(nèi)酯類是歐洲養(yǎng)牛生產(chǎn)中治療許多感染的常用藥物［10］。有研究在植物乳桿菌培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的苯乳酸能夠抑制多種真菌和致病菌的生長，應(yīng)用于動物飼料中可能成為抗生素的替代品［15］。Zhang等［8］研究發(fā)現(xiàn)在紫花苜蓿青貯飼料中ARGs的主要載體以有害細(xì)菌或病原菌為主，添加乳酸菌后ARGs豐度降低是因為減少了ARGs宿主細(xì)菌。在本研究中，這些ARGs均被檢測到，青貯30天后，添加PLA的玉米秸稈青貯飼料中ARGs絕對豐度顯著下降，可能是由于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的PLA，抑制了攜帶ARGs的致病菌的增殖，從而降低ARGs的豐度，這一結(jié)果與許冬梅研究報道相似［29］。有研究認(rèn)為溫度是引起ARGs變化的關(guān)鍵因素之一，尤其在堆肥過程中長時間的高溫期和較高的堆體溫度對大多數(shù)ARGs潛在宿主微生物有消除作用［30］。與堆肥發(fā)酵不同，青貯過程中乳酸菌更適宜在30℃生長，一旦溫度超過50℃，乳酸菌將停止生產(chǎn)乳酸，雜菌大量增殖，容易造成營養(yǎng)損失［31］。因此，本研究中無論較高溫還是較低溫條件，對玉米秸稈青貯的ARGs變化不大。然而添加苯乳酸后，較低溫下PLA1處理組的ARGs豐度變化更顯著，較高溫下PLA2處理組的ARGs豐度變化更顯著。

3.3" ARGs與MGEs之間相關(guān)性分析

由質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子和整合子等組成的MGEs能夠促進ARGs在微生物之間發(fā)生水平基因轉(zhuǎn)移［32］。Jacobsen等［33］通過大鼠作為體內(nèi)模型，發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵干香腸中分離的L. plantarum DG 522和L. plantarum DG 507可以通過可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒將抗性基因tet（M）、erm（B）轉(zhuǎn)移至E.faecalis JH2-2。一些研究表明水平基因轉(zhuǎn)移是ARGs傳播的重要途徑［34］。先前研究認(rèn)為sul1與intl1基因有關(guān)，能夠在環(huán)境微生物之間進行水平轉(zhuǎn)移，但在本研究中發(fā)現(xiàn)sul1與intl1顯著負(fù)相關(guān)，與宋磊等人結(jié)論相似［35］。與此同時，sul1，sul2，sul3，ermB，tetC與Tn916/1545呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，添加PLA顯著降低了Tn916/1545的豐度，說明添加PLA能夠降低轉(zhuǎn)座酶上ARGs的豐度，抑制轉(zhuǎn)座酶誘導(dǎo)下ARGs的水平基因轉(zhuǎn)移，這也解釋了青貯后PLA處理組sul1，sul2，sul3，ermB和tetC的絕對豐度比CK組下降的多。Zhang等［7］研究表明隨著青貯時間的延長，高豐度的MGEs伴隨著高水平基因轉(zhuǎn)移潛力。因此，可以推測ARGs的降低可能通過抑制MGEs引起的水平基因轉(zhuǎn)移實現(xiàn)，說明添加苯乳酸能有效去除青貯過程中的ARGs。

4" 結(jié)論

玉米秸稈青貯飼料中ARGs種類豐富，MGEs是影響ARGs豐度變化的因素之一。添加苯乳酸后，不管任何溫度條件，青貯飼料中ARGs和MGEs豐度均顯著降低。添加苯乳酸不僅可以改善玉米秸稈青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)，還能減少ARGs的污染，其中在20℃貯藏溫度下PLA1的ARGs豐度變化更顯著，在30℃貯藏溫度下PLA2的ARGs豐度變化更顯著。

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（責(zé)任編輯" 閔芝智）