摘要：為研究染色體分離樣蛋白1（chromosomesegregation 1-like，CSE1L）在小鼠骨骼肌發(fā)育中的作用，利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建CSE1L 基因敲除的C2C12細胞系。針對小鼠 CSE1L 的第3外顯子設計3組sgRNA，構(gòu)建sgRNA表達質(zhì)粒（連接綠色熒光蛋白，green fluorescent protein，GFP）和Cas9質(zhì)粒（連接紅色熒光蛋白，red fluorescent protein，RFP）共轉(zhuǎn)染C2C12 細胞，篩選高切割效率的sgRNA；將轉(zhuǎn)染該sgRNA 和Cas9 的C2C12細胞進行流式細胞分選，獲取共表達紅、綠雙色熒光蛋白的細胞，并用DNA測序進行鑒定。通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白免疫印跡（Western-blot）鑒定其分子特征。最后分別利用CCK-8、細胞周期以及凋亡實驗對CSE1L 敲除細胞系活力和凋亡進行檢測。結(jié)果顯示，小鼠成肌細胞中CSE1L 基因mRNA和蛋白水平表達量都顯著降低（Plt;0.01），提示CSE1L 基因敲除成功。該基因缺失導致C2C12細胞變細長、細胞活力在72 h顯著下調(diào)，細胞周期停滯、凋亡增加。成功構(gòu)建了CSE1L 基因敲除的細胞系，并研究了小鼠骨骼肌細胞生長發(fā)育相關(guān)功能，為探索CSE1L 基因功能提供細胞模型，并為后續(xù)基因編輯敲除鼠制備奠定基礎。

關(guān)鍵詞：CRISPR-Cas9；CSE1L；基因敲除；骨骼肌發(fā)育

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0250

中圖分類號：Q78 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）11022509

染色體分離樣蛋白1（chromosomesegregation1-like，CSE1L）基因，又稱為細胞凋亡易感基因（cllular apoptosis susceptible，CAS），由25 個外顯子組成，編碼972 個氨基酸，蛋白分子量為100 kD。該蛋白首次在人MCF-7乳腺癌細胞中發(fā)現(xiàn)，在維持細胞增殖與凋亡的平衡中扮演著重要的角色[12]。CSE1L 參與多種細胞機制的調(diào)節(jié)，包括細胞周期檢查點以及細胞增殖和凋亡[34]。CSE1L 作為細胞周期檢查點的一部分，參與有絲分裂過程中染色體的精確分離[5]。CSE1L 缺失會導致有絲分裂后期染色體分離異常[6]。CSE1L 在多種實體瘤中高表達，包括肺癌、乳腺癌、胃癌等[1，78]，CSE1L 基因缺失會導致檢查點的紊亂，使細胞分裂不穩(wěn)定，導致癌癥高發(fā)，因此在臨床醫(yī)學中也作為腫瘤診斷標志物檢測[9]。CSE1L 也與細胞的增殖和凋亡相關(guān)，在增殖細胞中高表達，在靜止細胞中低表達[10]。近年來的研究多是針對CSE1L 在癌癥上的研究， CSE1L 在骨骼肌生長發(fā)育中的作用機制未見報道。本團隊前期研究證實，CSE1L基因參與豬骨骼肌的生長發(fā)育[11]。小鼠成肌細胞系C2C12 細胞是研究骨骼肌生物學過程的通用模型。因此，構(gòu)建CSE1L 敲除的C2C12細胞系可為進一步研究CSE1L 基因在骨骼肌發(fā)育過程中的調(diào)控作用提供可靠的體外細胞模型。

CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)通過人工設計的向?qū)gRNA引導Cas9核酸酶在基因組特定位點進行靶向精準編輯，具有效率高、成本低、操作簡便等優(yōu)點，廣泛應用于基因敲除、基因篩選、基因治療以及分子育種等多個領域，尤其在構(gòu)建敲除細胞和（或）敲除動物/植物模型方面具有不可替代的作用，為動植物分子設計育種提供技術(shù)和理論支持[12-15]。本研究運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在小鼠成肌細胞C2C12中構(gòu)建CSE1L基因敲除細胞系，探討CSE1L 對細胞形態(tài)、細胞增殖、周期和凋亡的影響，為進一步研究CSE1L蛋白在骨骼肌生長發(fā)育中的作用提供細胞模型。

1 材料與方法

1.1 細胞和質(zhì)粒

小鼠成肌細胞C2C12購自國家模式與特色實驗細胞資源庫/中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，YP152-GFP 和Cas9-P2A-mcherry 質(zhì)粒載體由本實驗室保存，感受態(tài)細胞購自深圳康體生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 試劑

細胞用DMEM培養(yǎng)基（YEASEN，41401ES76）、FBS（BI，04-001-1ACS） 、Pen-strep（YEASEN，60162ES76）、PBS（YEASEN，41403ES76）、胰酶（YEASEN，40127ES60）培養(yǎng)；電轉(zhuǎn)用Cell LineNucleofector Kit V 轉(zhuǎn)染試劑盒（Lonza，VCA-1003）；FastPure Cell/Tissue DNA Isolation Mini Kit 、高保真酶（Vazyme，P515）、熒光定量PCR（Vazyme，Q711）試劑均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒（TIANGEN，DP117）購自天根生化科有限公司；RNA提取用TRIZOL（Thermo Fisher，15596018CN）、反轉(zhuǎn)錄（Thermo Fisher，K1622）、Pierce?BCA蛋白檢測試劑盒（Thermo Fisher，23227），購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。CCK-8 試劑（YEASEN，40203ES76）、細胞凋亡檢測試劑盒（YEASEN，40302ES50）、細胞周期檢測試劑（BDPharmingen，550825） 和CSE1L 抗體（Abcam，ab151546）購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司，Actin（Sangon，D190826）、二抗（Sangon，LF102）購自生工生物工程（上海）股份有限公司。引物（表1）由廣州金唯智生物科技公司合成。

1.3 靶向小鼠CSE1L 基因的sgRNA 設計

通過 NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索小鼠CSE1L（ NM_023565.3）基因序列 。在NC_000068.8 序列的第3個外顯子區(qū)域，按照CRISPR Cas9靶點設計原則，利用 sgRNA 在線設計工具（https：//chopchop. cbu. uib. no/）針對CSE1L第3外顯子序列設計3對sgRNA（表1），且預測其在基因組內(nèi)無其他靶點。在靶序列正義鏈的5’端前部添加 CACCG，同時合成 sgRNA 互補的寡核苷酸，并在5’端添加AAAC，3’端添加C，合成的正反向oligo DNA序列。

同時，依據(jù)目的基因的序列，利用NCBI工具設計CRISPR-Cas9敲除鑒定引物（表1）進行PCR。

1.4 靶向小鼠CSE1L 基因的sg 載體的構(gòu)建

將合成的3對反向互補的sgRNA oligo DNA單鏈退火，形成帶有粘性末端的短雙鏈DNA。將正反向sgRNA序列以10 μmol·L?1溶于 ddH2O，配制以下反應體系：4.5 μL Forward oligo，4.5 μL Reverse oligo，1 μL T4 Ligation buffer，95～25 ℃梯度連接，每間隔5 min下降5 ℃。將短雙鏈DNA與經(jīng) BpiⅠ酶切后的質(zhì)粒YP152-GFP 連接，4 μL sgRNA 變性產(chǎn)物、1 μL 10×T4 Ligation buffer、1 μL T4 DNA連接酶，加ddH2O至10 μL，22 ℃連接30 min。連接成功后加入50 μL DH5α 感受態(tài)細胞，混勻后冰浴放置25～30 min，在42 ℃金屬浴中熱激60 s，置于冰上2～3 min，然后將其均勻涂抹在氨芐抗性的固體培養(yǎng)基上，置于37 ℃細菌培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落送廣州金唯智生物科技公司測序鑒定。

測序結(jié)果顯示，3對sgRNA序列均正確插入載體骨架上，表示載體構(gòu)建成功，將其命名為CSE1LsgRNA1、CSE1L-sgRNA2和CSE1L-sgRNA3，按照天根無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，備用。

1.5 C2C12 細胞培養(yǎng)

C2C12細胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素，在37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞密度達到80%～90%時即可傳代。

1.6 sgRNA 切割效率的測定

將質(zhì)粒稀釋到1 μg·μL?1，待10 cm培養(yǎng)皿中細胞密度為80%時消化細胞并計數(shù)，具體電轉(zhuǎn)步驟如下：取4管15 mL離心管，分別加入1.5×106個細胞，離心后棄上清。取3個1.5 mL EP管，加入100 μL細胞核轉(zhuǎn)染液，分別加入構(gòu)建好的質(zhì)粒各5 μL，并加入5 μL Cas9-P2A-mcherry 質(zhì)粒，混勻后加入含有細胞的15 mL離心管中，充分混勻。其中3管細胞電轉(zhuǎn)，剩余1管細胞作為平行對照。使用Lonza 2b電轉(zhuǎn)儀，電轉(zhuǎn)程序為T-020，電轉(zhuǎn)完成室溫靜置5 min，加入培養(yǎng)基重懸細胞并放入6孔板中培養(yǎng)48 h。用胰酶消化細胞，通過流式細胞儀篩選并收集具有紅綠雙色強陽性熒光的細胞，提取基因組DNA 用于PCR。PCR 體系：2 × Phanta Max MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 1 μL，無菌水7 μL。PCR程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物送至廣州金唯智生物有限公司進行DNA測序鑒定。

1.7 CSE1L-/-敲除細胞株篩選

選擇Cas9蛋白切割效率最高的sgRNA質(zhì)粒，與Cas9-P2A-mcherry 質(zhì)粒一同電轉(zhuǎn)進細胞，轉(zhuǎn)染方法按照 Cell Line Nucleofector Kit V 轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行。電轉(zhuǎn)48 h后通過流式細胞儀篩選出具有紅綠雙色強陽性熒光的細胞，收集細胞并培養(yǎng)在6孔板細胞中。6孔板細胞長滿時，取一半細胞用于提取DNA，另一半細胞繼續(xù)擴大培養(yǎng)[16]。細胞基因組DNA 提取和PCR 擴增方法同1.6，PCR產(chǎn)物送至廣州金唯智生物有限公司進行DNA測序。

1.8 RT-qPCR

將對照組C2C12細胞和CSE1L-/-細胞系分別鋪至6孔板中，待細胞密度長至80%左右時使用電動移液器吸棄培養(yǎng)基，PBS 清洗3 遍后加入Trizol，用傳統(tǒng)氯仿法提取RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA 作為熒光定量的模板，按照諾唯贊熒光定量試劑盒說明書進行RT-qPCR，引物序列見表1。

1.9 Western blot

將對照組C2C12細胞和CSE1L-/-細胞系分別鋪至6孔板中，待細胞密度長至80%左右時收獲細胞，裂解獲得蛋白，進行Western blot。步驟如下：用預冷PBS洗滌細胞沉淀，加入RIPA裂解液裂解細胞，冰上孵育30 min；4 ℃、12 000 r·min?1離心30 min。吸取上清液，按照Thermo Fisher 公司BCA 蛋白檢測試劑盒說明書測定蛋白含量。加入5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（YEASEN，20315ES05），100 ℃金屬浴加熱10 min使蛋白變性后進行SDS-PAGE 電泳。230 mA 恒流條件下轉(zhuǎn)膜80 min。用5%脫脂牛奶緩沖液將膜室溫封閉1～2 h，用TBST 緩沖液洗滌3 次，每次10 min。稀釋CSE1L（1∶ 2 500）和ACTIN（1∶3 000）抗體，4 ℃ 孵育過夜。第2 天用TBST緩沖液洗膜3次，再用HRP 標記親和純化羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育1 h，用TBST緩沖液洗滌 3次后置于蛋白印跡成像系統(tǒng)下觀察條帶。

1.10 細胞增殖曲線繪制

取對數(shù)生長期的對照組C2C12 細胞和CSE1L-/-細胞系接種到96孔板中，每孔含約1×104個細胞，每24 h取1組細胞，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置于培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度值并繪制細胞增殖曲線，每組設8個重復。

1.11 細胞周期測定

將對照組C2C12細胞和CSE1L-/-細胞系分別鋪至6孔板中，待細胞密度長至約80%時用胰酶消化細胞，收集到的細胞1 000 r·min?1離心5 min，吸棄上清液，加入3 mL PBS重懸細胞，1 000 r·min?1離心5 min后吸棄上清液，固定在預冷的75% 乙醇中， ?20 ℃儲存過夜。次日，細胞用PBS洗滌后，加入500 μL PI/RNase溶液，室溫避光孵育15 min，通過流式細胞儀分析細胞周期變化。

1.12 細胞凋亡

提前將C2C12細胞和CSE1L-/-細胞系分別鋪至6孔板中，待細胞密度長至約80%時按照1.11方法收集對照組C2C12細胞和CSE1L-/-細胞系，PBS洗滌后加入100 μL FITC結(jié)合緩沖液懸浮細胞，最低密度為1×106 cell·mL?1，在4 ℃ 下加入5 μLAnnexin V-FITC 和10 μL PI Staining Solution，混勻后在室溫下避光孵育15 min，用流式細胞儀及FlowJo軟件分析細胞變化。

1.13 數(shù)據(jù)分析

采用Image J軟件分析凝膠電泳條帶灰度值并計算敲除效率；RT-qPCR以及CCK-8結(jié)果使用GraphPad prism 8.0分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶向小鼠CSE1L 的sgRNA 切割效率分析

3 種sgRNA 質(zhì)粒（CSE1L-sgRNA1、CSE1LsgRNA2和 CSE1L-sgRNA3）分別攜帶有不同的靶標序列，為了篩選出Cas9蛋白切割活性最高的靶標序列，將構(gòu)建好的3 種質(zhì)粒分別和Cas9-P2Amcherry質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到C2C12細胞中，檢測Cas9蛋白對該打靶位點的敲除效率。測序結(jié)果顯示，sgRNA打靶位置出現(xiàn)雜峰，說明轉(zhuǎn)染sgRNA質(zhì)粒后細胞基因組DNA 發(fā)生編輯。sgRNA-1 測序峰值最紊亂， Cas9蛋白對該位點靶標序列切割活性最高。后續(xù)實驗選取sgRNA-1進行轉(zhuǎn)染。

2.2 流式分選獲得CSE1L-/-細胞系

將構(gòu)建好的CSE1L-sgRNA1 和Cas9-mcherry共轉(zhuǎn)C2C12細胞，48 h后通過熒光流式細胞分選技術(shù)收集GFP和RFP強信號細胞群，結(jié)果如圖1所示，檢測CSE1L-/-細胞系轉(zhuǎn)染效率為5.81%。收集該部分細胞群，并將收集到的細胞裂解PCR產(chǎn)物進行一代測序。測序結(jié)果顯示，與對照組C2C12細胞相比，CSE1L-/-細胞系在sgRNA配對位置出現(xiàn)復合峰，提示該位置出現(xiàn)序列變異，成功獲得CSE1L-/-細胞系。

2.3 CSE1L 敲除細胞形態(tài)學變化分析

由圖2 可知，與正常C2C12 細胞相比，CSE1L-/-細胞系在形態(tài)上差別明顯。正常C2C12細胞形狀飽滿，呈梭形，而敲除CSE1L 基因后的C2C12 細胞出現(xiàn)多個突觸，細胞形狀呈放射狀。可能是CSE1L 基因敲除后，細胞骨架不穩(wěn)定，導致細胞縮小，突觸增加。

2.4 敲除細胞CSE1L 蛋白水平分析

將構(gòu)建好的CSE1L-sgRNA1 和Cas9-mcherry共轉(zhuǎn)C2C12細胞，48 h后通過熒光流式細胞分選技術(shù)收集EGFP和RFP強信號的細胞群，利用RTqPCR和Western blot檢測CSE1L mRNA 和蛋白水平變化。結(jié)果表明，相對于對照組C2C12細胞，CSE1L-/-細胞系中該基因在mRNA水平（圖3A）和蛋白水平上（圖3 B）都極顯著下調(diào)（Plt;0.001）。

2.5 CSE1L 基因敲除對細胞活力的影響

用CCK-8 檢測法檢測CSE1L 基因敲除對C2C12 細胞活力的影響，結(jié)果如圖4 所示，CSE1L-/-細胞系的增殖活力在48 h內(nèi)無顯著差異，從72 h 開始細胞活力較C2C12 細胞極顯著降低（Plt;0.01），96 h開始細胞活力較對照組細胞極顯著降低（Plt;0.001）。

2.6 CSE1L 基因敲除對細胞周期的影響

為探究CSE1L 基因敲除對C2C12細胞周期的影響，用PI法對細胞進行染色，通過流式細胞術(shù)分析處于不同細胞周期的細胞比例，結(jié)果如圖5所示。CSE1L-/-細胞系G0/G1期和G2/M期細胞比例均顯著高于對照組，而S期細胞比例則顯著低于對照組，提示細胞DNA合成受到抑制，進一步印證了CSE1L敲除導致C2C12細胞的增殖水平降低。

2.7 CSE1L 基因敲除對細胞凋亡的影響

為探究CSE1L 基因敲除對C2C12細胞凋亡的影響，用FITC/PI雙染法對細胞進行染色，通過流式細胞術(shù)分析細胞凋亡比例，結(jié)果如圖6所示。與對照組細胞相比，CSE1L-/-細胞系早期凋亡細胞比例增加，晚期凋亡細胞比例極顯著增加（Plt;0.01），說明敲除CSE1L基因能夠顯著促進C2C12細胞凋亡。

3 討論

微管是細胞骨架的架構(gòu)主干，與微絲、中間絲一同構(gòu)成細胞骨架。細胞骨架主要在維持細胞形態(tài)、承受外力、保持細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)中發(fā)揮作用[17]。微管在所有哺乳動物細胞中存在，除紅細胞外，所有微管均由α-微管蛋白和β-微管蛋白組成。α-微管蛋白和β-微管蛋白通常以頭尾相連的方式形成二聚體，也被稱為微管蛋白。微管也是一些細胞器的主體，如中心粒就由9 組3 聯(lián)微管組成[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，CSE1L 基因敲除后會導致C2C12細胞形態(tài)發(fā)生變化，正常C2C12細胞形態(tài)圓潤飽滿，CSE1L-/-細胞偏細長瘦小，且CSE1L-/-細胞從胞體向四周分散出多條“ 細絲”與相鄰細胞連接，整體呈放射狀。有研究表明，CSE1L 可以與細胞微管相聯(lián)系[19]。CSE1L 與α-微管蛋白和β-微管蛋白相關(guān)，可以增強兩者之間的關(guān)聯(lián)[20]。CSE1L 的缺失導致微管蛋白的結(jié)合能力下降，微管結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，細胞整體形態(tài)變小、萎縮。

紡錘體由微管組成，CSE1L 也與紡錘體的形成密切相關(guān)，條件性敲除CSE1L 的突變體出現(xiàn)染色體分離缺陷，細胞無法降解細胞周期蛋白B[1]。紡錘體是細胞分裂過程中的一種特殊結(jié)構(gòu)，主要負責染色體的運動和分配。在有絲分裂的后期，CSE1L 與組蛋白結(jié)合，幫助組蛋白從微管中組裝到紡錘體的極板上。隨后CSE1L 與紡錘體微管的相互作用力降低，導致紡錘體微管的解聚，從而促進染色體的分離[10]。

在細胞周期中，CSE1L也扮演著極為重要的作用，CSE1L 基因敲除會阻滯細胞周期，抑制DNA合成并誘導細胞凋亡。CSE1L 缺乏可誘導TCam-2細胞的G1/G0阻滯并延遲G2/M期，CSE1L蛋白含量降低會引起周期相關(guān)蛋白cyclin D1和c-Myc表達水平降低[21]。在THP-1細胞中，敲減CSE1L 可誘導THP-1細胞凋亡，凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2表達水平降低，Bax蛋白表達水平升高[4]。本研究觀察到類似的結(jié)果，CSE1L 基因敲低的C2C12細胞生長緩慢，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，微管骨架紊亂，細胞呈細長狀，胞體周圍出現(xiàn)細小突觸，細胞周期阻滯，抑制DNA合成并誘導細胞凋亡。

CSE1L 基因定位于染色體20q13 上，該區(qū)域與多種癌癥密切相關(guān)，在大多數(shù)癌癥中高度表達[22]，包括肺癌、肝細胞癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、淋巴癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、鼻咽癌等[12，23-30]，CSE1L 的表達與高水平癌癥分期和分級呈正相關(guān)[30]，CSE1L 對細胞的存活至關(guān)重要，CSE1L 耗盡會導致細胞死亡[3132]。CSE1L 作為多功能基因，目前大部分研究都是針對其在癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及癌癥的進展等方面，有望成為腫瘤治療的潛在靶點。但是，目前關(guān)于CSE1L 在哺乳動物細胞系中尤其是骨骼肌細胞生長發(fā)育的影響還沒有報道。本研究通過建立CSE1L 基因缺失的C2C12細胞系，篩選高切割效率的sgRNA；將sgRNA 和Cas9共轉(zhuǎn)C2C12細胞系并進行流式細胞分選，通過實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和蛋白免疫印跡（Western-blot） 鑒定CSE1L 分子特征。最后分別利用CCK-8、細胞周期以及凋亡實驗對CSE1L 敲除細胞系進行活力和凋亡檢測。本研成功構(gòu)建了CSE1L 基因敲除的小鼠成肌細胞系，CSE1L 基因mRNA和蛋白水平表達量都顯著下調(diào)， CSE1L 基因缺失導致C2C12細胞活力在72 h顯著下調(diào)，細胞周期停滯、凋亡增加，為進一步深入研究CSE1L基因在骨骼肌生長發(fā)育中功能提供了細胞模型，并為后續(xù)基因編輯小鼠的制備奠定基礎。

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