關(guān)鍵詞 龐氏安胎止血湯；熱證；自然流產(chǎn)；NOD樣受體蛋白3；免疫平衡

自然流產(chǎn)是妊娠女性最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)病過程復(fù)雜，前期會(huì)出現(xiàn)陰道出血，繼而出現(xiàn)陣發(fā)性下腹痛或腰背痛等多種癥狀[1―2]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，導(dǎo)致自然流產(chǎn)的因素有免疫因素、內(nèi)分泌因素、感染因素及凝血因素等[3]。中醫(yī)將自然流產(chǎn)歸為“胎漏”“胎動(dòng)不安”“滑胎”“數(shù)墮胎”范疇；腎為先天之本，主生殖，腎虛則滑胎，以腎虛為前提的脾虛、氣血虛、血瘀、血熱及肝郁共同組成了滑胎的病因病機(jī)[4]。中原龐氏婦科起源于清代乾隆年間，其認(rèn)為“胎前生熱”“妊娠氣滯”“胎前之虛”為“胎漏”“胎動(dòng)不安”的發(fā)病機(jī)制，其第6 代傳人龐清治先生更以清熱止血、養(yǎng)血安胎為原則，創(chuàng)制了“龐氏安胎止血湯”。該方配伍得當(dāng)，具有清熱止血、養(yǎng)血安胎的功效，臨床用于治療熱證之“胎漏”“胎動(dòng)不安”，效果較好[5]。

NOD 樣受體蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體是NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白質(zhì)（apoptosis-associated speck-like protein containing aCARD，ASC）、胱天蛋白酶1 前體（caspase-1 precursor，pro-caspase-1）組成的胞內(nèi)多蛋白復(fù)合物，可促進(jìn)多種炎癥因子的分泌與成熟，且大量表達(dá)于子宮內(nèi)膜和胎盤中，與早產(chǎn)、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等具有較強(qiáng)的相關(guān)性[6―8]。本課題組前期研究指認(rèn)了龐氏安胎止血湯煎煮后的13 種主要活性成分，分別為莫諾苷、綠原酸、芍藥苷、芒果苷、異阿魏酸、甘草苷、菊苣酸、迷迭香酸、荷葉堿、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ[9]，本研究擬采用分子對(duì)接技術(shù)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從調(diào)控NLRP3 炎癥小體角度分析龐氏安胎止血湯改善熱證自然流產(chǎn)的分子機(jī)制，以期為該方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BS110S 型電子天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、MR-96TB型酶標(biāo)儀[騁克儀器（上海）有限公司]、RM2235 型石蠟切片機(jī)（德國Leica 公司）、D3024R型臺(tái)式高速冷凍微量離心機(jī)[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司]、CX23 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 主要藥品與試劑

龐氏安胎止血湯由黃芩10 g、知母30 g、金銀花30 g、蒲公英30 g、荷葉10 g、旱蓮草30 g、藕節(jié)30 g、升麻6 g、蘇梗15 g、白術(shù)10 g、山茱萸30 g、白芍10 g、甘草4 g 組成，各藥材均購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與鑒定教研室2 名副高級(jí)及以上職稱人員鑒定為真品，且符合2020 年版《中國藥典》及國家藥品標(biāo)準(zhǔn)。該方水煎液由河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室制備，具體流程為：取處方量藥材加5倍量蒸餾水浸泡30 min，大火煮沸后小火煎煮30 min，共煎3 次，合并藥液，濃縮為質(zhì)量濃度為1.11 g/mL（以生藥量計(jì)）的藥液。溫陽中藥由附子10 g、干姜10 g、肉桂10 g 組成，各藥材購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院[臨用時(shí)，以5 倍量蒸餾水常規(guī)煎煮后，濃縮為質(zhì)量濃度為1g/mL（以生藥量計(jì)）的藥液，備用]。

地屈孕酮片（批號(hào)363775，規(guī)格10 mg/片）購自荷蘭Abbott Healthcare Products B.V. 公司；米非司酮片（批號(hào)43210213，25 mg/片）購自華潤紫竹藥業(yè)有限公司；氨基甲酸乙酯（批號(hào)20221014）購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；蘇木素染色液、伊紅染色液（批號(hào)分別為190805、20211009）購自福州飛凈生物科技有限公司；三碘甲狀腺原氨酸（triiodothyronine，T3）、甲狀腺素（thyroxine，T4）測(cè)定試劑盒（批號(hào)分別為H222-1-2、H223-1-2）購自南京建成生物工程研究所；大鼠白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、IL-6、IL-10、γ干擾素（interferon-γ，IFN- γ）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（批號(hào)分別為MM-0192R2、MM-0191R1、MM-0190R1、MM-0195R1、MM-0198R1）購自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司；兔抗大鼠NLRP3、ASC、caspase-1 抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG 二抗、DAB 顯色試劑盒（批號(hào)分別為GB114320-100、GB115270-100、GB11383-100、G1213-100UL、G1212-200T）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60 只健康雌性未產(chǎn)SD大鼠（10 周齡，體質(zhì)量200～280 g）和30 只健康雄性SD大鼠（10 周齡，體質(zhì)量250～280 g）均由鄭州市惠濟(jì)區(qū)華興實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（豫）2022-0002。所有大鼠飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，室溫為20～22 ℃，相對(duì)濕度為55%～60%，正常光照，大鼠自由飲水采食。本實(shí)驗(yàn)獲河南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)DWLL202201012。

2 方法

2.1 分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)

根據(jù)本課題組前期研究[9]，從PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載龐氏安胎止血湯主要活性成分莫諾苷、綠原酸、芍藥苷、芒果苷、異阿魏酸、甘草苷、菊苣酸、迷迭香酸、荷葉堿、黃芩苷、木犀草素、芹菜素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的結(jié)構(gòu)文件，經(jīng)Open BabelGUL 轉(zhuǎn)換成PDB 結(jié)構(gòu)文件；再從PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）下載NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白結(jié)構(gòu)文件。利用AutoDock Tools 1.5.7 軟件將龐氏安胎止血湯的主要活性成分與NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白進(jìn)行分子對(duì)接（若結(jié)合能＜－5 kJ/mol，說明兩分子具有親和力，且結(jié)合能數(shù)值越低，表示兩分子結(jié)合越穩(wěn)定），最后采用PyMOL 軟件分析分子對(duì)接結(jié)果，預(yù)測(cè)龐氏安胎止血湯主要活性成分與NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白之間的結(jié)合活性。

2.2 大鼠分組、造模與給藥

將60 只雌性大鼠與30 只雄性大鼠按雌雄比2∶1 合籠過夜配種，于次日清晨觀察雌性大鼠有無陰道栓，有陰道栓者記為妊娠第1 天；待60 只雌性大鼠全部妊娠后，隨機(jī)分為正常組、模型組、地屈孕酮組（0.002 g/kg，劑量根據(jù)臨床等效劑量換算而得）和龐氏安胎止血湯低、中、高劑量組（11.025、22.05、44.10 g/kg，中劑量為臨床等效劑量），每組10 只。從妊娠第1 天起，正常組和模型組大鼠灌胃蒸餾水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，給藥體積均為10 mL/kg，每天1 次，連續(xù)12 d。另外，除正常組外，其余各組大鼠均在灌胃蒸餾水/藥液的同時(shí)灌胃溫陽中藥藥液10 g/kg；第13 天，除正常組外，其余各組大鼠按5 mg/kg 灌胃米非司酮（臨用時(shí)以蒸餾水溶解）以建立大鼠熱證自然流產(chǎn)模型。以造模大鼠血清中T3、T4 水平和流產(chǎn)率升高為標(biāo)準(zhǔn)判定造模成功[8]。最終，各組大鼠無死亡，造模大鼠均造模成功。

2.3 大鼠取材和流產(chǎn)率及子宮系數(shù)的計(jì)算

末次給藥24 h 后，稱定各組大鼠體重，然后腹腔注射氨基甲酸乙酯（1 g/kg）麻醉，腹主動(dòng)脈取血，以3 000r/min 離心10 min，取上清液于－80 ℃下儲(chǔ)存，備用。解剖大鼠取妊娠子宮，觀察胚胎顏色（正常胚胎呈淡紅色，宮內(nèi)未見瘀血；流產(chǎn)胚胎呈黑褐色，胚胎部分消失），統(tǒng)計(jì)各組大鼠流產(chǎn)胚胎數(shù)和正常胚胎數(shù)，并稱定妊娠子宮質(zhì)量，計(jì)算流產(chǎn)率[流產(chǎn)率＝流產(chǎn)胚胎數(shù)/（流產(chǎn)胚胎數(shù)+正常胚胎數(shù)）×100%]和子宮系數(shù)（子宮系數(shù)＝子宮質(zhì)量/體重）。觀察結(jié)束后，去除妊娠子宮周圍組織，經(jīng)生理鹽水洗滌后，稱重，拍照，然后將妊娠子宮一分為二，其中一份用4% 多聚甲醛固定，另一份用液氮速凍后于－80 ℃下儲(chǔ)存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4 大鼠血清中T3、T4、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ水平檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下血清樣品，室溫溶解，按照試劑盒說明書方法操作，然后采用酶標(biāo)儀檢測(cè)大鼠血清中T3、T4、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ水平。

2.5 大鼠妊娠子宮的病理形態(tài)觀察

取“2.3”項(xiàng)下固定的妊娠子宮，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、切片（4 μm）等過程制作病理切片；取部分切片經(jīng)二甲苯脫蠟、HE染色、梯度乙醇脫水后，以中性樹膠封片，采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠妊娠子宮的病理形態(tài)變化，并拍照。

2.6 大鼠妊娠子宮中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

取“2.3”項(xiàng)下妊娠子宮切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、水化后，以檸檬酸鹽緩沖液熱修復(fù)8 min；待切片溫度降至室溫后用H2O2孵育10 min，以磷酸鹽緩沖液浸洗后，以山羊血清孵育30 min，滴加NLRP3（稀釋度為1∶3 000）、ASC（稀釋度為1∶1 000）、caspase-1（稀釋度為1∶3 000）一抗，4 ℃孵育過夜；次日，將切片復(fù)溫至37 ℃后滴加二抗（稀釋度為1∶1 000）孵育20 min，以磷酸鹽緩沖液浸洗后，以DAB 顯色10 min，自來水沖洗終止；再以蘇木素復(fù)染3min，經(jīng)鹽酸乙醇分化后，以自來水再次沖洗；經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片后鏡檢。每只大鼠子宮切片在400 倍鏡下隨機(jī)選取1 個(gè)視野，以棕黃色為陽性染色，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測(cè)定每個(gè)視野中的積分光密度（integrated optical density，IOD）值表示目的蛋白表達(dá)水平。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 分子對(duì)接結(jié)果

由圖1 可知，龐氏安胎止血湯13 種活性成分與NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白的結(jié)合能均小于－5 kJ/mol，表明這13 種活性成分與NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白結(jié)合穩(wěn)定。另外，這3 種蛋白與甘草苷的結(jié)合能在同類蛋白與活性成分對(duì)接中最低，表明這3 種蛋白與甘草苷結(jié)合較為牢固。甘草苷與NLRP3、ASC、procaspase-1 蛋白的分子對(duì)接模擬圖見圖2。

3.2 大鼠流產(chǎn)率及子宮系數(shù)計(jì)算結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠流產(chǎn)率顯著升高（P＜0.05），子宮系數(shù)顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯各劑量組大鼠流產(chǎn)率均顯著降低（P＜0.05），子宮系數(shù)均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表1。

3.3 大鼠血清中T3、T4 水平檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中T3、T4 水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯各劑量組大鼠血清中T3、T4 水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2。

3.4 大鼠血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ 水平檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠血清中IL-2、IFN-γ水平均顯著升高（P＜0.05），IL-4、IL-6、IL-10 水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯各劑量組大鼠血清中IL-2、IFN-γ水平均顯著降低（P＜0.05），IL-4、IL-10 水平均顯著升高（P＜0.05）；地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯中、高劑量組大鼠血清中IL-6水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

3.5 大鼠妊娠子宮的病理形態(tài)觀察結(jié)果

正常組大鼠妊娠子宮內(nèi)膜組織無損傷，蛻膜細(xì)胞排列整齊緊密。與正常組比較，模型組大鼠蛻膜細(xì)胞數(shù)量減少且存在損傷和充血等流產(chǎn)病變。與模型組比較，地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯各劑量組大鼠蛻膜細(xì)胞損傷及充血等流產(chǎn)病變均有不同程度的改善。結(jié)果見圖3。

3.6 大鼠妊娠子宮中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果

與正常組比較，模型組大鼠妊娠子宮中NLRP3、caspase-1、ASC蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，地屈孕酮組和龐氏安胎止血湯各劑量組大鼠妊娠子宮中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4和表4。

4 討論

自然流產(chǎn)發(fā)病率約占妊娠女性的15%，是不孕癥的主要原因之一[1]，但限于倫理原因，流產(chǎn)研究無法直接在人體開展，只能借助符合人體流產(chǎn)病理特征的動(dòng)物模型開展相關(guān)研究，揭示發(fā)病機(jī)制，研究更安全、更有效的臨床干預(yù)手段。已有研究表明，使用米非司酮、米索前列醇等藥物誘導(dǎo)的流產(chǎn)特征與人類自然流產(chǎn)類似，可以作為自然流產(chǎn)動(dòng)物模型的構(gòu)建手段[10]。米非司酮是一種孕激素受體拮抗劑，可以選擇性地拮抗孕酮受體，使孕酮活性降低，引發(fā)妊娠終止[11]。熱證是以機(jī)體陽盛陰虛、臟腑陽氣亢盛為因，以機(jī)能活動(dòng)亢進(jìn)為表現(xiàn)的一種證候形式，分實(shí)熱和虛熱兩種類型?！毒霸廊珪D人規(guī)》有云“凡胎熱者，血易動(dòng)，血?jiǎng)诱撸ゲ话病?，由此可知血虛熱證是自然流產(chǎn)的病因之一。本研究以“溫?zé)崴幰讉幹?，?nèi)熱由生”為理論基礎(chǔ)，采用溫?zé)嶂兴幐阶印⒏山湮檎T導(dǎo)虛熱證動(dòng)物模型[12―13]，該動(dòng)物模型主要表現(xiàn)為甲狀腺功能亢進(jìn)，血清中T3、T4 水平升高以及流產(chǎn)率增加，表明造模成功。

中原龐氏婦科依據(jù)女性妊娠期特殊的生理病理特點(diǎn)，將體質(zhì)與病癥結(jié)合，創(chuàng)立了龐氏安胎止血湯，該方清熱安胎，兼以補(bǔ)腎、健脾、理氣。方中黃芩清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎，知母滋陰降火，二者為君藥。金銀花和蒲公英清熱解毒、防治感染，旱蓮草和藕節(jié)涼血止血、養(yǎng)陰化瘀，四者為臣藥。蘇梗理氣和胃、止痛安胎，白術(shù)健脾益氣、燥濕利水、止汗安胎；升麻少量配白術(shù)、荷葉可升陽止血安胎；山茱萸、白芍補(bǔ)血固腎、安胎，白芍緩急止痛，與知母合用則治妊娠腹痛；知母、山茱萸、白芍雖滋補(bǔ)陰血，但易礙胃生濕；蘇梗、白術(shù)雖理氣祛濕，亦有傷津之弊，兩組藥物配合使用，滋補(bǔ)陰血而無礙胃生濕之弊，理氣祛濕而無傷津之虞——此六者為佐藥。甘草為使藥，調(diào)和諸藥，可達(dá)清熱養(yǎng)陰、理氣安胎的功效[14―15]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)龐氏安胎止血湯干預(yù)后，模型大鼠子宮系數(shù)升高，流產(chǎn)率降低，血清中T3、T4 水平降低，妊娠子宮病理形態(tài)明顯改善，這表明龐氏安胎止血湯對(duì)熱證自然流產(chǎn)大鼠有較好的改善作用。

胚胎是母體的半同種異體移植物，會(huì)受到母體排斥。母胎之間的免疫耐受取決于母胎界面免疫細(xì)胞及細(xì)胞因子之間的動(dòng)態(tài)平衡，若此平衡被打破，胎兒將受到母體排斥而發(fā)生流產(chǎn)[16]。目前研究認(rèn)為，妊娠期母體免疫系統(tǒng)主要通過輔助性T細(xì)胞1（T helper 1 cell，Th1）/Th2 模式維持正常妊娠，Th1 細(xì)胞分泌的IFN-γ、IL-2 等促炎因子，可介導(dǎo)細(xì)胞免疫，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，抑制胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞生長，干擾胚胎和胎兒發(fā)育，引起胚胎丟失，增加流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)；Th2 細(xì)胞分泌的IL-4、IL-6 和IL-10 等抑炎因子，可抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)同種異體移植物免疫耐受，維持母胎界面妊娠，IL-10 還可挽救免疫平衡破壞引起的妊娠不良結(jié)局[17―18]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)龐氏安胎止血湯干預(yù)后，模型大鼠血清中IFN-γ、IL-2 水平降低，IL-4、IL-6 及IL-10 水平升高，這表明龐氏安胎止血湯可通過調(diào)節(jié)炎癥因子水平影響母胎之間的免疫平衡，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)熱證自然流產(chǎn)的改善作用。

NLRP3 炎癥小體是一種多聚蛋白復(fù)合物，其組成包括一個(gè)模式識(shí)別受體蛋白NLRP3，一個(gè)含有CARD結(jié)構(gòu)域的ASC（起中樞銜接蛋白的作用），一個(gè)炎性半胱氨酸天冬酶caspase-1。NLRP3 蛋白作為模式識(shí)別受體蛋白，由一個(gè)C端富含亮氨酸的重復(fù)序列（LRP）、一個(gè)核苷酸結(jié)合寡結(jié)構(gòu)域（NOD）和一個(gè)N末端pyrin 結(jié)構(gòu)域（PYD）組成。NLRP3 被激活后，其PYD結(jié)構(gòu)域與ASC 同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活A(yù)SC，活化的ASC 可募集前體蛋白procaspase-1，促其水解為有活性的caspase-1；具有活性的caspase-1 可剪切多種IL 前體蛋白，促進(jìn)促炎因子成熟與分泌，介導(dǎo)下游炎癥反應(yīng)，此炎癥反應(yīng)加劇可能是早期不明原因流產(chǎn)的原因之一[6]。本研究分子對(duì)接結(jié)果顯示，龐氏安胎止血湯的13 種主要活性成分與NLRP3、ASC、pro-caspase-1 蛋白結(jié)合牢固；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)龐氏安胎止血湯干預(yù)后，模型大鼠妊娠子宮中NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白表達(dá)水平降低，表明龐氏安胎止血湯可能通過調(diào)節(jié)NLRP3 炎癥小體形成，介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，影響母胎之間的免疫平衡，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)熱證自然流產(chǎn)的改善作用。

綜上所述，龐氏安胎止血湯可能通過調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體形成，下調(diào)IFN-γ、IL-2 等促炎因子，上調(diào)IL-4、IL-6、IL-10 等抑炎因子，從而影響母胎之間的免疫平衡，進(jìn)而發(fā)揮改善熱證自然流產(chǎn)的作用。本課題組未來考慮采用NLRP3 抑制劑或構(gòu)建NLRP3 敲除大鼠模型，以更深入地探究龐氏安胎止血湯干預(yù)熱證自然流產(chǎn)的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。