關(guān)鍵詞柿葉提取物；潰瘍性結(jié)腸炎；鐵死亡；Nrf2/HO-1信號通路

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerativecolitis，UC）是炎癥性腸病的主要類型之一，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)不斷上升[1]。長期以來，氧化應(yīng)激被學(xué)界認(rèn)為是UC的重要致病因素[2]。在UC的發(fā)病過程中，腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生可促進(jìn)細(xì)胞過度產(chǎn)生活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS），當(dāng)ROS的生成超過機(jī)體的抗氧化緩沖能力時(shí)，會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化的發(fā)生，并進(jìn)一步誘發(fā)鐵死亡[2]?？梢姡F死亡主要由脂質(zhì)過氧化累積所致，減輕機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)可有效抑制鐵死亡。研究指出，無論是UC還是用于UC治療的藥物都會增加患者并發(fā)癥（如結(jié)腸癌、皮膚癌、宮頸癌、骨骼疾病、焦慮抑郁等）的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，若不及時(shí)治療，這些并發(fā)癥將導(dǎo)致不良的用藥依從性、更高的醫(yī)療費(fèi)用、更快的疾病進(jìn)展，從而嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3―4]。

柿葉（persimmonleaf，PL）提取物多年來被廣泛用作炎癥性疾病的治療劑。研究顯示，PL提取物具有抗炎、抗氧化的作用[5]，其主要活性成分槲皮素可通過降低丙二醛（malondialdehyde，MDA）和ROS水平、抑制鐵死亡來減輕缺血再灌注或葉酸誘導(dǎo)的急性腎損傷[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PL提取物對UC具有保護(hù)作用[7]，但這種作用是否與氧化應(yīng)激和鐵死亡相關(guān)并不清楚。實(shí)驗(yàn)表明，過氧化氫（H2O2）可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生鐵死亡[8]?；诖耍狙芯繑M以H2O2致鐵死亡的IEC-6細(xì)胞（具隱窩樣上皮細(xì)胞特征，是UC相關(guān)體外研究的常用細(xì)胞）作為體外模型，初步探討PL提取物對該細(xì)胞模型的影響，以期為UC治療新藥的研發(fā)提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括IncubatorCO2-PU-90A型CO2培養(yǎng)箱（上海搏旅儀器有限公司）、Ti20型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）、EXL800型酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）、Navios型流式細(xì)胞儀（美國BeckmanCoulter公司）、K5500Plus型實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（realtimePCR，RT-PCR）儀（北京凱奧科技發(fā)展有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

PL（產(chǎn)地安徽亳州，批號20210314）購自安徽亳州藥材市場，由河南省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥研究所劉長河副研究員鑒定為柿樹科植物柿DiospyroskakiThunb.的干燥葉。

鐵死亡抑制劑ferrostatin-1（Fer-1）的對照品（批號HY100579，純度99.96%）購自美國MedChemExpress公司；胎牛血清（fetalbovineserum，F(xiàn)BS；批號2181654CP）購自美國Gibco公司；MTT試劑、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）試劑盒、MDA試劑盒、線粒體膜電位JC-1試劑盒（批號分別為20210508、20210903、20210804、20210323、20210303、20210412）均購自北京索萊寶科技有限公司；PCR試劑盒購自凱杰生物工程（深圳）有限公司；Trizol試劑（批號20210316）購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Revert-AidTMFirstStrandcDNA合成試劑盒（批號00780630）購自美國ThermoFisherScientific公司；ROS試劑盒（熒光探針法，批號D3861）購自美國Invitrogen公司；兔源胱氨酸/谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（cystine/glutamateanti-porter，xCT）、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathioneperoxidase4，GPX4）抗體（批號分別為ab307601、ab125066）均購自英國Abcam公司；兔源核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclearfactor-erythroid2-relatedfactor2，Nrf2）、鐵蛋白重鏈（ferritinheavychain，F(xiàn)TH）抗體（批號分別為#AF0639、#DF6278）均購自美國Affinity公司；兔源還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸/醌氧化還原酶1（NADPH/quinoneoxidoreductase-1，NQO-1）、血紅素氧合酶1（hemeoxygenase-1，HO-1）抗體（批號分別為GB11282、GB11549）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號10494-1）購自武漢三鷹生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G二抗（批號162607）購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.3 細(xì)胞

大鼠IEC-6細(xì)胞由北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞庫提供。

2 方法

2.1 藥液的制備

PL提取物藥液的制備參考本課題組前期已發(fā)表的文獻(xiàn)[8]。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

將IEC-6細(xì)胞接種于含5%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件（培養(yǎng)條件后同）下培養(yǎng)，每2～3d換液1次，待細(xì)胞生長至對數(shù)期進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 PL提取物毒性考察及藥物干預(yù)濃度篩選

2.3.1 PL提取物毒性考察

取對數(shù)生長期的IEC-6細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，將其分為空白對照組和PL提取物不同質(zhì)量濃度組，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。對照組加入完全培養(yǎng)基200μL，各藥物組加入含不同質(zhì)量濃度PL提取物（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、400μg/mL，以PL提取物質(zhì)量計(jì)）的完全培養(yǎng)基200μL。培養(yǎng)24h，每孔加入0.5%MTT溶液20μL，避光反應(yīng)2h；棄去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜150μL，振搖5min，使用酶標(biāo)儀于490nm波長處檢測各孔的吸光度值，并計(jì)算細(xì)胞存活率（細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的平均吸光度值/對照組細(xì)胞的平均吸光度值×100%），以考察PL提取物對細(xì)胞活力的影響。

2.3.2 H2O2作用濃度篩選

取對數(shù)生長期的IEC-6細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1次后，將其分為空白對照組和H2O2不同濃度組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。對照組加入完全培養(yǎng)基200μL，其余各組分別加入含不同濃度H2O2（參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]設(shè)置，濃度分別為30、40、50、60、70、80μmol/L）的完全培養(yǎng)基200μL。培養(yǎng)24h，按“2.3.1”項(xiàng)下方法檢測各組細(xì)胞存活率，以篩選H2O2的作用濃度。

2.3.3 PL提取物干預(yù)濃度篩選

取對數(shù)生長期的IEC-6細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，以PBS清洗1次后，將其分為空白對照組和PL提取物不同質(zhì)量濃度組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。對照組加入不含H2O2的完全培養(yǎng)基200μL，其余各組分別加入含H2O260μmol/L和PL提取物25、50、100、200μg/mL的完全培養(yǎng)基200μL（H2O2和PL提取物干預(yù)濃度參考“2.3.2”“2.3.1”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置）。培養(yǎng)24h，按“2.3.1”項(xiàng)下MTT法檢測細(xì)胞存活率，以進(jìn)一步篩選后續(xù)實(shí)驗(yàn)PL提取物的干預(yù)濃度。

2.4 鐵死亡抑制劑對H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞活力的影響檢測

取對數(shù)生長期的IEC-6細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100μL，培養(yǎng)。待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，以PBS清洗1次，將其分為空白對照組、Fer-1組、H2O2組、H2O2+Fer-1組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。對照組加入完全培養(yǎng)基200μL，F(xiàn)er-1組加入含F(xiàn)er-11μg/μL的完全培養(yǎng)基200μL，H2O2組加入含H2O260μmol/L的完全培養(yǎng)基200μL，H2O2+Fer-1組加入含F(xiàn)er-11μg/μL、H2O260μmol/L的完全培養(yǎng)基200μL（Fer-1干預(yù)濃度參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]設(shè)置，H2O2干預(yù)濃度參考“2.3.2”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置）。培養(yǎng)24h，按“2.3.1”項(xiàng)下MTT法檢測細(xì)胞存活率，以考察H2O2導(dǎo)致的IEC-6細(xì)胞損傷是否與鐵死亡相關(guān)。

2.5 PL提取物對H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響檢測

取對數(shù)生長期的IEC-6細(xì)胞，按1×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100μL。待細(xì)胞貼壁后，將其分為對照組（Control組）、H2O2組、H2O2+PL25μg/mL組、H2O2+PL50μg/mL組，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。Control組加入完全培養(yǎng)基200μL，H2O2組加入含H2O260μmol/L的完全培養(yǎng)基200μL，H2O2+PL25、50μg/mL組分別加入含H2O260μmol/L和PL提取物25、50μg/mL的完全培養(yǎng)基200μL（H2O2、PL提取物干預(yù)濃度分別參考“2.3.2”“2.3.3”項(xiàng)下結(jié)果設(shè)置）。培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞上清液，按照相應(yīng)試劑盒說明書方法操作，使用酶標(biāo)儀檢測其MDA含量和SOD活性。

按上述方法進(jìn)行細(xì)胞分組、造模、處理。培養(yǎng)24h后，收集各組細(xì)胞，加入ROS試劑盒中BODIPYTM581/591C11試液（以無血清培養(yǎng)基稀釋，終濃度為2μmol/L）1mL，于37℃下孵育30min；棄去上清液，細(xì)胞用PBS1mL清洗2次，加入胰蛋白酶1mL，消化3min后，加入培養(yǎng)基1mL終止消化。收集細(xì)胞懸液，于4℃下以10000r/min離心3min，吸棄培養(yǎng)基，細(xì)胞用預(yù)冷的PBS1mL清洗2次后，再以預(yù)冷的PBS400μL稀釋，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

2.6 PL提取物對H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞線粒體膜電位的影響

按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞分組、造模、處理。培養(yǎng)24h后，收集各組細(xì)胞，加入JC-1熒光探針試液（以二甲基亞砜為溶劑，終濃度為10μg/mL），于37℃下孵育20min；細(xì)胞用PBS輕柔洗滌2次后，再以PBS5mL稀釋，使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)（JC-1聚合物呈紅色熒光，JC-1單體呈綠色熒光），分析每張顯微圖的平均熒光強(qiáng)度并計(jì)算細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrialmembranepotential，MMP；MMP＝紅色平均熒光強(qiáng)度/綠色平均熒光強(qiáng)度），以反映各組細(xì)胞線粒體膜的去極化程度（MMP與去極化程度成反比）。

2.7 PL提取物對H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)mRNA表達(dá)的影響檢測

采用定量RT-PCR法檢測。按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞分組、造模、處理。培養(yǎng)24h后，收集各組細(xì)胞，使用Trizol試劑提取其總RNA，檢測其濃度和純度后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括SYBR?PremixExTaqTM酶（2×）10μL、PCR正/反向引物各0.8μL、cDNA模板2μL和無菌水6.4μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性2s，60℃退火10s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt法分析Nrf2、HO-1、NQO-1、xCT、GPX4、FTHmRNA的表達(dá)水平，結(jié)果以Control組為參照進(jìn)行歸一化處理。PCR引物由蘇州金唯智生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成，具體序列及產(chǎn)物長度見表1。

2.8 PL提取物對H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響檢測

采用Westernblot法檢測。按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞分組、造模、處理。培養(yǎng)24h后，收集各組細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，以BCA法測定蛋白濃度后加熱變性。取變性蛋白適量，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂牛奶封閉1h；洗膜后，加入Nrf2、HO-1、NQO-1、xCT、GPX4、FTH、GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶1000），于4℃下孵育過夜；洗膜后，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例1∶2000），于室溫下孵育2h；使用化學(xué)發(fā)光試劑顯色后置于凝膠成像儀下成像。以GAPDH為內(nèi)參，使用ImageJ軟件量化Nrf2、HO-1、NQO-1、xCT、GPX4、FTH蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果以Control組為參照進(jìn)行歸一化處理。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPadPrism9軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并繪圖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 PL提取物毒性考察及藥物干預(yù)濃度篩選結(jié)果

當(dāng)PL提取物質(zhì)量濃度為200、400μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率（平均值分別為77.85%、36.60%）均較空白對照組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；當(dāng)PL提取物質(zhì)量濃度為25、50、100μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率（平均值分別為100.77%、104.42%、86.25%）與空白對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖1A。

當(dāng)H2O2濃度分別為30、40、50、60、70、80μmol/L時(shí)，細(xì)胞的平均存活率分別為82.68%、73.32%、59.16%、52.04%、34.55%、20.98%。為保證細(xì)胞有足夠的活力進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，本研究選用60μmol/L作為H2O2誘導(dǎo)濃度。結(jié)果見圖1B。

當(dāng)PL提取物質(zhì)量濃度為100、200μg/mL時(shí)，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞存活率呈下降趨勢；當(dāng)PL提取物濃度為25、50μg/mL時(shí)，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率有所升高，提示上述質(zhì)量濃度的PL提取物可抑制H2O2所導(dǎo)致的細(xì)胞存活率降低。因此，本研究選用25、50μg/mL作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)PL提取物的干預(yù)質(zhì)量濃度。結(jié)果見圖1C。

3.2 鐵死亡抑制劑對H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞活力的影響

當(dāng)只加Fer-1時(shí)，細(xì)胞的平均存活率為98.19%，接近于空白對照組，提示此質(zhì)量濃度的Fer-1對細(xì)胞幾乎沒有毒性；當(dāng)在H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞中加入Fer-1后，細(xì)胞的存活率較H2O2組顯著升高（P＜0.01）。由此可見，H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞死亡可能與鐵死亡相關(guān)。結(jié)果見圖2。

3.3 PL提取物對H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與Control組比較，H2O2組細(xì)胞上清液中SOD活性顯著降低，MDA含量、ROS水平均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與H2O2組比較，H2O2+PL50μg/mL組細(xì)胞上清液中SOD活性顯著升高，ROS水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見表2、圖3。

3.4 PL提取物對H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞MMP的影響

與Control組（MMP為2.01±0.21）比較，H2O2組細(xì)胞的紅色熒光明顯減弱，綠色熒光明顯增強(qiáng)，MMP（0.63±0.15）顯著降低（P＜0.01）；與H2O2組比較，H2O2+PL25、50μg/mL組細(xì)胞的紅色熒光有所增強(qiáng)，綠色熒光有所減弱，MMP[1.17±0.15、1.63±0.15]均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。結(jié)果見圖4。

3.5 PL提取物對H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞中鐵死亡相關(guān)mRNA及蛋白表達(dá)的影響

與Control組比較，H2O2組細(xì)胞中Nrf2、NQO-1mRNA及Nrf2、HO-1蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)，xCT、GPX4、FTHmRNA及GPX4、FTH蛋白的表達(dá)均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；與H2O2組比較，各藥物組細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO-1、xCT、GPX4、FTHmRNA及蛋白的表達(dá)均有不同程度上調(diào)，部分指標(biāo)組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)果見表3、表4、圖5。

4 討論

中藥因作用靶點(diǎn)多、價(jià)格低的優(yōu)勢，在慢性疾病治療領(lǐng)域得到了越來越多的關(guān)注和應(yīng)用。研究指出，PL提取物可通過調(diào)節(jié)Jun激酶途徑來抑制T細(xì)胞的活化，從而改善小鼠的特應(yīng)性皮炎[11]；其可提高大鼠口腔潰瘍組織中SOD活性并降低MDA含量，減輕口腔黏膜下層的炎癥細(xì)胞浸潤，對醋酸誘導(dǎo)的口腔潰瘍有一定的改善作用，上述作用可能是通過抗炎和抗氧化而實(shí)現(xiàn)的[4]；此外，PL提取物可通過活化Nrf2/HO-1信號通路來發(fā)揮抗氧化作用，從而減緩阿爾茨海默病的進(jìn)程[12]。研究表明，PL提取物中的黃酮類成分金絲桃苷不僅可直接清除細(xì)胞內(nèi)的ROS、螯合金屬離子，而且可增加GPX4、SOD、HO-1等抗氧化酶的生物活性[13]?？梢姡琍L提取物具有一定的抗炎、抗氧化作用。

鐵死亡與人體生理、病理進(jìn)程密切相關(guān)，特別是在炎癥性、神經(jīng)性、代謝異常等疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用[14]。早有研究表明，使用鐵螯合劑可以緩解UC患者的臨床癥狀，而使用鐵劑則可能加重相關(guān)癥狀[15]。隨后，有學(xué)者指出，過量的鐵會加重腸道炎癥，且人群的高膳食鐵攝入量可促進(jìn)UC的發(fā)展[16―17]。此外有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，UC患者結(jié)腸黏膜中ROS的增加與疾病活動度成正比，而鐵螯合劑可減少ROS的生成，并改善UC的結(jié)腸癥狀[18]。由此可見，鐵死亡與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，抑制鐵死亡的發(fā)生可能對治療UC有益。

氧化應(yīng)激長期被認(rèn)為是UC的重要致病因素。ROS由細(xì)胞線粒體產(chǎn)生，正常情況下具有殺菌作用；但在UC的發(fā)病過程中，腸道炎癥反應(yīng)的發(fā)生可促進(jìn)細(xì)胞過度生成ROS，超過機(jī)體抗氧化緩沖能力，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化、腸道黏膜屏障損傷和炎癥反應(yīng)[19]。SOD、MDA是氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。其中，MDA是ROS誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，也是機(jī)體組織氧化損傷的重要指標(biāo)，MDA水平越高，表明機(jī)體組織損傷越嚴(yán)重；SOD是一種抗氧化酶，能夠清除氧自由基，若機(jī)體對氧自由基的抑制作用減弱，可導(dǎo)致氧自由基在體內(nèi)過量積累，從而增加細(xì)胞膜的通透性，使體內(nèi)炎癥因子水平升高[20]。本研究結(jié)果表明，在50μg/mLPL提取物的作用下，IEC-6細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的ROS水平顯著降低，SOD活性顯著升高，提示PL提取物可抑制H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷。

腸道內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的過度損傷與UC的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，Nrf2/HO-1信號通路是體內(nèi)對抗氧化應(yīng)激的主要防御機(jī)制之一，可影響疾病的轉(zhuǎn)歸[12]。近年研究表明，UC患者體內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)水平顯著低于對照組，但UC相關(guān)結(jié)腸癌患者體內(nèi)Nrf2蛋白的表達(dá)水平顯著高于對照組[21]；此外，有研究顯示，與健康對照組比較，磷酸化的Nrf2蛋白在中/重度UC患者體內(nèi)呈高表達(dá)，但非磷酸化的Nrf2蛋白在中/重度UC患者體內(nèi)的表達(dá)則明顯下調(diào)[22]。上述研究表明，Nrf2蛋白的表達(dá)水平及表達(dá)形式與疾病進(jìn)程有關(guān)?，F(xiàn)有研究表明，中醫(yī)藥治療UC的作用可能與調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生、動力學(xué)平衡等有關(guān)[23]。ROS主要在線粒體中產(chǎn)生，適量的ROS可維持體內(nèi)各通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，而過量的ROS則可能造成MMP降低，從而導(dǎo)致線粒體功能障礙[24]。本研究結(jié)果表明，PL提取物可顯著提高H2O2誘導(dǎo)的IEC-6細(xì)胞的MMP，抑制線粒體去極化的發(fā)生；同時(shí)，PL提取物可激活Nrf2蛋白，上調(diào)下游HO-1、NQO-1、xCT、GPX4、FTH蛋白及mRNA的表達(dá)，從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激和抑制鐵死亡的作用。

綜上所述，PL提取物能減輕H2O2所導(dǎo)致的細(xì)胞線粒體膜損傷、ROS異常堆積，上述作用可能與激活Nrf2/HO-1信號通路從而抑制鐵死亡有關(guān)。