關(guān)鍵詞： N-甲基嘌呤DNA 糖基化酶； 植物腺嘌呤堿基顛換編輯器； 基因組編輯； 水稻

1 引言

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNPs）在植物界中普遍存在，也是作物農(nóng)藝性狀遺傳變異和改良的基礎(chǔ). 利用堿基編輯技術(shù)對(duì)已知的關(guān)鍵SNPs 進(jìn)行堿基替換，或者人工創(chuàng)制能夠用以提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性的新型SNPs，這樣的精準(zhǔn)調(diào)控模式可極大促進(jìn)作物的遺傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新［1， 2］. 目前在植物中CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的胞嘧啶堿基編輯器（Cytosine base editors，CBEs）、腺嘌呤堿基編輯器（Adenine base editors，ABEs）和雙堿基編輯系統(tǒng)相繼被報(bào)道，順利實(shí)現(xiàn)了堿基的轉(zhuǎn)換編輯（A-to-G/C-to-T）

胞嘧啶堿基顛換編輯技術(shù)的開(kāi)發(fā)得益于一類DNA 糖基化酶的作用. 在前期CBE 編輯過(guò)程中檢測(cè)到少量的胞嘧啶堿基顛換編輯C-to-A/G 和inde（l insertion and deletion），這是由于 CBE 結(jié)構(gòu)中的尿嘧啶DNA 糖基化酶抑制劑（uracil DNA glycosylaseinhibitor，UGI）并不能完全抑制尿嘧啶DNA 糖基化酶（Uracil-DNA N-glycosylase，UNG或稱Uracil DNA glycosylase，UDG）的天然活性.而UNG 可糖基化胞嘧啶C 脫氨產(chǎn)生的尿嘧啶U并激發(fā)堿基切除修復(fù)機(jī)制（Base excision repair，BER），實(shí)現(xiàn)靶點(diǎn)處U 的切除并形成無(wú)嘌呤無(wú)嘧啶（Apurinic/Apyrimidinic，AP）位點(diǎn)［3］，進(jìn)一步引發(fā)隨機(jī)修復(fù)，便會(huì)產(chǎn)生C-to-A/G 和indel. 在此基礎(chǔ)上將UGI 替換為人源尿嘧啶DNA 糖基化酶hUNG 或者水稻內(nèi)源尿嘧啶DNA 糖基化酶Os?UNG，在植物中實(shí)現(xiàn)了有效的C-to-G/A 的編輯，特別是OsUNG 融合脫氨酶Anc689（R33A）的堿基編輯工具將水稻中的C-to-G 編輯效率提升至21. 3%［4-6］.

與UNG 一樣，自然界中也存在一類N-甲基嘌呤DNA 糖基化酶（N-methylpurine DNA glycosylase，MPG 或稱Alkyladenine DNA glycosylase，AAG），可結(jié)合多種作用底物并實(shí)現(xiàn)底物的脫氨反應(yīng)，這些底物中就包含次黃嘌呤Ⅰ. 但由于該類糖基化酶活性遠(yuǎn)不及UNG 且底物眾多，在堿基編輯過(guò)程中很難實(shí)現(xiàn)對(duì)I 的糖基化，因此ABE 的編輯產(chǎn)物中幾乎沒(méi)有A-to-T/C 和indel 類型，這也導(dǎo)致植物中的腺嘌呤堿基顛換編輯（A-to-Y，即A-to-T/C）實(shí)現(xiàn)困難. 此前在水稻中也嘗試在ABE 的C 端分別融合人源hMPG 和核酸內(nèi)切酶EndoV 來(lái)實(shí)現(xiàn)腺嘌呤堿基顛換編輯，但結(jié)果分析表明只出現(xiàn)了小片段的缺失，未發(fā)生A-to-Y 編輯［5］. Tong 等［7］對(duì)hMPG 進(jìn)行突變得到對(duì)Ⅰ具高活性的糖基化酶突變體hMPGv3 并順利實(shí)現(xiàn)了人類細(xì)胞中A-to-Y 的編輯. 隨后利用hMPGv3 融合高活性腺嘌呤堿基編輯器在水稻、番茄和玉米中也得以實(shí)現(xiàn)A-to-K即A-to-G/T 編輯和極少量的A-to-C 編輯［8-11］，極大豐富了堿基編輯的類型. 但目前在植物中腺嘌呤堿基顛換編輯器仍存在糖基化酶種類單一、堿基顛換效率較低的問(wèn)題，制約了通過(guò)腺嘌呤堿基顛換編輯對(duì)作物進(jìn)行遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新的進(jìn)程.

在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中hMPG 和mAAG 均表現(xiàn)出良好的A-to-T/C 編輯能力［7，12］，而目前在植物中主要使用的是人源hMPGv3 的密碼子優(yōu)化版本［8-11］. 基于此，本研究測(cè)試了鼠源mAAG 三種突變體、人源hMPGv3-EF 變體和水稻內(nèi)源OsMPG在植物中的A-to-G/T/C 編輯能力. 三種來(lái)源的MPG 均成功實(shí)現(xiàn)腺嘌呤堿基顛換編輯且主要是A變?yōu)門，為進(jìn)一步優(yōu)化腺嘌呤堿基顛換編輯器和提高編輯效率奠定一定基礎(chǔ).

2 材料方法

2. 1 實(shí)驗(yàn)材料

早熟水稻粳稻品種Kitaake（Oryza sativa ssp.geng）、sgRNA 載體pENTR4：sgRNA4、hMPGv3基因片段、腺嘌呤堿基編輯器pUbi：rBE49b 來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室保存，其余載體由本次實(shí)驗(yàn)構(gòu)建，胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂粉、MS 培養(yǎng)基、NAA、6-BA購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，NaCl、蔗糖、山梨醇購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，Hygromycin B（60225ES03）、Timentin（60230ES07）購(gòu)于翌圣生物科技（上海）股份有限公司，各類限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase（EL0021）、T4 DNA Ligase Buffer（B69）、T4 polynucleotidekinase（EK0031）、ATP（R0441）購(gòu)于Thermo Scientific，Gateway? LR ClonaseTM Ⅱ EnzymeMix（11791100）購(gòu)于Invitrogen，TRAN Easy?Pure? HiPure Plasmid MaxiPrep Kit 試劑盒（EM123-01）購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司，PCR 擴(kuò)增高保真酶Phanta Super-Fidelity DNAPolymerase（P501-d1）、ClonExpress Ⅱ One StepCloning Kit（C112-01）、Vazyme FastPure GelDNA Extraction Mini Kit 試劑盒（DC301-01）、2×Rapid Taq Master Mix（P222-01）購(gòu)于南京諾唯贊生物科技股份有限公司.

2. 2 實(shí)驗(yàn)方法

2. 2. 1 sgRNA 設(shè)計(jì)和載體構(gòu)建 本研究用到的水稻內(nèi)源基因靶點(diǎn)見(jiàn)表1. sgRNA 序列由CRISPR-GE（http：//skl. scau. edu. cn/targetdesign/）設(shè)計(jì)，交由公司合成后構(gòu)建到Bsa Ⅰ或BtgZ Ⅰ酶切后的pENTR4：sgRNA4 載體中（圖1a）.

2. 2. 2 堿基編輯載體構(gòu)建 首先按照三種來(lái)源氨基酸序列比對(duì)結(jié)果確定突變位點(diǎn)（ 圖2），mAAG、OsMPG 基因按照水稻密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化后委托公司合成或者以已合成基因?yàn)槟０暹M(jìn)行定點(diǎn)突變PCR 獲得，hMPGv3-EF 在hMPGv3 基礎(chǔ)上定點(diǎn)突變而來(lái). 使用DNA 無(wú)縫克隆試劑與SpCas9-Fg2 組裝，使用BamH Ⅰ和Bcu Ⅰ酶切pUbi：rBE49b 載體得到雙元表達(dá)載體骨架，通過(guò)三片段連接將以上片段分別與TadA9-Sp?Cas9n-Fg1 片段和雙元表達(dá)載體骨架融合構(gòu)建pUbi：rBE118a～（f 圖1b）.

2. 2. 3 水稻堿基編輯器的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化將構(gòu)建成功的堿基編輯載體與pENTR4：sgRNA通過(guò)Gateway LR 反應(yīng)完成體外重組獲得靶向各個(gè)基因位點(diǎn)的堿基編輯載體，再利用凍融法將各編輯載體分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105 中.

2. 2. 4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化 將水稻幼胚進(jìn)行表面消毒后轉(zhuǎn)入MSD 培養(yǎng)基生長(zhǎng)10 d 誘導(dǎo)愈傷組織，去除種皮和胚后繼續(xù)培養(yǎng)4 d. 提前2 d 活化農(nóng)桿菌菌株并將新鮮菌落接種TY 培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)至OD600 達(dá)1. 0～2. 0，將愈傷組織放入OD600 處于0. 15 左右的農(nóng)桿菌懸浮侵染液中浸泡30 min 后進(jìn)行暗培養(yǎng)，3～5 d 后轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1～2 mo，篩選獲得的轉(zhuǎn)基因抗性愈傷進(jìn)一步在再生培養(yǎng)基上可獲得轉(zhuǎn)基因植株. 詳細(xì)步驟參照Wang 等［13］的方法.

2. 2. 5 堿基編輯效率檢測(cè) 獲取轉(zhuǎn)基因材料之后采用CTAB 法提取水稻全基因組DNA，使用特異性引物擴(kuò)增靶序列（見(jiàn)表2），并在每個(gè)樣品PCR產(chǎn)物兩端添加獨(dú)立的barcode 后完成NGS 高通量測(cè)序以獲得各靶點(diǎn)處的編輯類型和編輯效率，測(cè)序原理參照Liu 等［14］的方法.

3 結(jié)果與分析

3. 1 鼠源N- 甲基嘌呤DNA 糖基化酶融合rBE49b 實(shí)現(xiàn)水稻A-to-K 堿基編輯

Chen 等［12］提出大鼠來(lái)源的N-甲基嘌呤DNA糖基化酶mAAG 變體能夠在人類細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)較高效率的腺嘌呤堿基顛換編輯，其多位點(diǎn)組合突變結(jié)果表明AXBE-R165E·Y179F 突變體的A-to-Y編輯效率是A-to-G 的3. 8 倍，而目前為止暫未有mAAG 變體在水稻中發(fā)揮作用的報(bào)道. 在hMPG研究中對(duì)N169 位點(diǎn)進(jìn)行突變并檢測(cè)切除各類脫氧核苷酸的速率得出N169S 對(duì)次黃嘌呤有更快的切除速率［15］，經(jīng)過(guò)人工進(jìn)化篩選發(fā)現(xiàn)融合了G163R、N169S、S198A、K202A、G203A、S206A 和K210A 共7 個(gè)位點(diǎn)的突變體hMPGv3 在人類細(xì)胞中A-to-Y 編輯效率增長(zhǎng)為原來(lái)的4. 78 倍［7］. 為了檢驗(yàn)攜帶不同突變位點(diǎn)的mAAG 在植物中實(shí)現(xiàn)AKBE 的能力，進(jìn)行了如下探索. 通過(guò)人工理性設(shè)計(jì)并以片段合成和PCR 反應(yīng)分別獲得mAAG-EF（R165E·Y179F）、mAAG-EFS（R165E·Y179F·N189S）、mAAGv3-EF（R165E·Y179F·G183R·N189S·N218A·K222A·S223A·G226A·K230A）3種mAAG 變體，將其進(jìn)行融合于rBE49b（TadA9-SpCas9n）的C 端并依次獲得新的堿基編輯工具rBE118a（ TadA9-SpCas9n-mAAG-EF）、rBE118b（TadA9-SpCas9n-mAAG-EFS）和rBE118（c TadA9-Sp Cas9n-mAAGv3-EF），以驗(yàn)證其對(duì)于糖基化活性的調(diào)節(jié)特性乃至在A-to-G/T/C 編輯效率上的影響. 選擇OsGS1、OsEPSPS 和OsALS1 作為內(nèi)源性驗(yàn)證靶點(diǎn)，結(jié)果表明rBE118a、rBE118b 和rBE118c 均展現(xiàn)出A-to-K 編輯能力，而在所有突變類型中只發(fā)現(xiàn)rBE118a 在OsEPSPS 位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了A-to-C 的編輯，編輯效率為3. 23%（圖3a），綜合堿基編輯和indel 數(shù)據(jù)（ 圖3b～3d）可初步得出mAAGv3-EF 在3 個(gè)位點(diǎn)有較穩(wěn)定的pAKBE 編輯活性，同時(shí)其indel 的比例也有所增加. 上述結(jié)果表明基于鼠源mAAG 突變體的pAKBE 工具在水稻中能夠有效地實(shí)現(xiàn)A-to-T/C 編輯，同時(shí)人源hMPGv3 中的7 個(gè)位點(diǎn)變異（G163R、N169S、S198A、K202A、G203A、S206A 和K210A）能有效提升mAGG-EF 的編輯活性.

3. 2 人源N-甲基嘌呤DNA 糖基化酶hMPGv3-EF 融合rBE49b 實(shí)現(xiàn)水稻A-to-K 堿基編輯

7 個(gè)氨基酸變異可以提升鼠源mAGG-EF 的A-to-T/C 編輯活性，我們繼續(xù)探究將鼠源mAAG中的R165E 和Y179F 突變引入到人源hMPGv3，是否可以進(jìn)一步提高h(yuǎn)MPGv3 的A-to-T/C 編輯活性. 對(duì)hMPGv3 進(jìn)行新一輪突變，融入對(duì)應(yīng)的R145E 和Y159F 突變得到hMPGv3-EF，設(shè)計(jì)并構(gòu)建pUbi： rBE118d （TadA9-SpCas9n-hMPGv3-EF），同樣靶向OsGS1、OsEPSPS 和OsALS1，測(cè)試其編輯活性. NGS 高通量測(cè)序結(jié)果顯示，rBE118d 在3 個(gè)靶點(diǎn)處均實(shí)現(xiàn)了較高效率的A-to-K，未檢測(cè)到A-to-C 編輯. 其中，A-to-T 的效率分別為5. 00%、10. 00% 和1. 85%（圖4a～4c），但與pUbi：rBE118（TadA9-SpCas9n-hMPv3）相較沒(méi)有明顯的提升［9］. 上述結(jié)果證實(shí)了該突變體能夠?qū)崿F(xiàn)水稻A-to-Y 編輯，但其編輯能力相較于rBE118 并未得到進(jìn)一步強(qiáng)化.

3. 3 水稻內(nèi)源N- 甲基嘌呤DNA 糖基化酶融合rBE49b 實(shí)現(xiàn)水稻A-to-K 堿基編輯

將hMPG 和mAAG 在水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，僅獲得一個(gè)候選的N-甲基嘌呤DNA 糖基化酶，對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄本為Os02t0774500-01，編碼蛋白為287 個(gè)氨基酸，與mAGG（333 aa）的序列相似度為26. 57%，與hMPG（298 aa）的相似度為27. 36%（圖2），將其命名為OsMPG. 對(duì)水稻內(nèi)源OsMPG 進(jìn)行密碼子優(yōu)化和人工合成，將其融合于rBE49b 的C 端得到rBE118e 以探究其pAKBE 編輯活性. 在已知位點(diǎn)OsGS1 處，rBE118e 檢測(cè)出3. 23% 的A-to-T 編輯，證實(shí)了OsMPG 的堿基編輯活性（圖5a）. 為了進(jìn)一步改良編輯活性引入新的突變，用OsMPG-R169S 替換OsMPG 得到rBE118f 在OsGS1、OsEPSPS 和xa5處完成打靶實(shí)驗(yàn). 結(jié)果顯示相比較rBE118e，rBE118f 在3 個(gè)位點(diǎn)的A-to-G 編輯效率均有明顯下降趨勢(shì)；另外，rBE118f 在OsEPSPS 和xa5 兩個(gè)位點(diǎn)處均實(shí)現(xiàn)了A-to-T 的編輯（ 效率分別為3. 23% 和2. 50%）（圖5b）.

3. 4 rBE118a～f 造成不同類型的靶基因上插入缺失

通過(guò)對(duì)受試編輯工具在四個(gè)靶基因處產(chǎn)生的indel 類型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，如表3 所示，在OsGS1、OsEPSPS、OsALS1 上均發(fā)現(xiàn)了不同類型的缺失，片段大小在2～15 bp 不等，且主要集中于rBE118a～f 的堿基編輯窗口內(nèi)及SpCas9n 切口酶的活性位點(diǎn)之間. 此外，在前3 個(gè)靶基因上還出現(xiàn)了82bp、61 bp 和50 bp 這樣的大片段刪除. 而在OsGS1、OsEPSPS、OsALS1 和xa5 上產(chǎn)生的堿基插入在2～8 bp 不等且插入序列為相鄰序列的重復(fù)片段，如rBE118a 在OsALS1 位點(diǎn)產(chǎn)生了tgggggcg（8 bp）的重復(fù)插入，與TGGGGGCG 完全相同（表4）.

4 討論與結(jié)論

隨著新型堿基編輯技術(shù)的逐步發(fā)展，植物中已經(jīng)順利實(shí)現(xiàn)了A-to-G/T/C 的堿基編輯類型，而目前為止報(bào)道的腺嘌呤堿基顛換均是由hMPGv3融合ABE 堿基編輯器來(lái)完成的.

TadA9 是在TadA8e 基礎(chǔ)上引入V82S·Q154R 得到的腺嘌呤脫氨酶變體，與SpCas9 融合形成rBE49b（TadA9-XTEN-SpCas9n）在多個(gè)位點(diǎn)均展現(xiàn)出穩(wěn)定的、編輯窗口更寬的A-to-G 替換能力且副產(chǎn)物極少［16］. 將人源N-甲基嘌呤DNA 糖基化酶變體hMPGv3 融合在rBE49b 的C 端在水稻中成功實(shí)現(xiàn)了A-to-G/T/C 且主要為A-to-G/T 的編輯，證實(shí)了ABE 系統(tǒng)與DNA 糖基化酶融合實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的pAKBE 的可行性［9］，但仍需提升編輯效率和挖掘更多可用的糖基化酶. 本研究對(duì)鼠源mAAG 突變體蛋白、人源hMPGv3 衍生突變體以及水稻內(nèi)源OsMPG 在水稻A-to-T/C 編輯中的能力進(jìn)行了詳細(xì)評(píng)估，這將有助于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)新類型pAKBE，為提升植物pAKBE 的編輯效率、擴(kuò)展編輯類型奠定基礎(chǔ). 本文成功證實(shí)了上述3 類MPG 蛋白及其突變體蛋白在水稻中的A-to-G/T編輯活性. 鼠源mAAG 進(jìn)行多位點(diǎn)突變所得到的堿基編輯器均能實(shí)現(xiàn)A-to-G/T 的編輯，其中mAAGv3-EF 的編輯能力最穩(wěn)定. 但與動(dòng)物細(xì)胞中的編輯類型不同，這些編輯器并未得到A-to-C類型的陽(yáng)性植株，這可能與動(dòng)植物細(xì)胞自身的DNA 修復(fù)機(jī)理差異有關(guān). 在hMPGv3 變體基礎(chǔ)上加入R145E 和Y159F 突變并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的結(jié)果表明加入新突變位點(diǎn)的hMPG 也可實(shí)現(xiàn)A-to-G/T/C 的編輯且A-to-T/C 顛換編輯的能力優(yōu)于mAAG，但未對(duì)A-to-T/C 的編輯效率起到明顯提升作用. 這可能是因?yàn)閮煞N來(lái)源的蛋白具有不同的構(gòu)象，而R145 與Y159 不處于hMPG 的糖基化酶活性位點(diǎn)所導(dǎo)致的.

hUNG 和OsUNG 均可用于植物C-to-G 堿基編輯，并且C-to-G 編輯效率得到提升［4-6］，在水稻pAKBE 建立過(guò)程中，對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)的突變類型分析可以得出人源和鼠源MPG 變體（在人類細(xì)胞中均展現(xiàn)出較高的A-to-T/C 編輯效率）介導(dǎo)的腺嘌呤堿基顛換編輯并未成為主要編輯事件，可能是由于在水稻中人源和鼠源MPG 突變體糖基化酶活性不足，抑制了AP 位點(diǎn)的形成和BER 修復(fù)途徑.通過(guò)序列比對(duì)、密碼子優(yōu)化得到的OsMPG 及進(jìn)一步突變得到的OsMPG-S 成功在水稻中顯示A-to-T/C 編輯活性，證明了通過(guò)優(yōu)化OsMPG 蛋白來(lái)提升編輯能力的可行性. 此外，Li 等［17］研究發(fā)現(xiàn)水稻OsMPG 及其突變體OsMPG-G162R/N168S 架構(gòu)的pAKBE 也能實(shí)現(xiàn)水稻中的A-to-T/C 編輯活性. 因此，對(duì)OsMPG 蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行深度學(xué)習(xí)預(yù)測(cè)或者飽和進(jìn)化篩選，可能成為未來(lái)改造和提升水稻內(nèi)源OsMPG 編輯活性的研究方向. 同時(shí)，深入優(yōu)化hMPG 和mAAG 在植物中的糖基化酶活性，以及BER 通路相關(guān)基因的加入，也有助于開(kāi)發(fā)提升植物中堿基顛換效率的pAKBE，提升堿基編輯介導(dǎo)的植物遺傳改良進(jìn)程.

與CGBE 在哺乳動(dòng)物B 細(xì)胞中產(chǎn)生的副產(chǎn)物類似，本實(shí)驗(yàn)中也檢測(cè)到了indel. 其中缺失突變主要發(fā)生在堿基突變位點(diǎn)和Cas9 切割位點(diǎn)或者兩者之間，而插入突變大多為臨近堿基重復(fù)序列的插入，據(jù)分析這可能與AP 位點(diǎn)形成后Polλ 和Polθ 在DNA 修復(fù)過(guò)程中所發(fā)揮的作用有關(guān)［18］. 未來(lái)可嘗試將AP 位點(diǎn)保護(hù)蛋白HMCES 優(yōu)化突變體與堿基編輯器融合來(lái)減少副產(chǎn)物，促進(jìn)植物腺嘌呤堿基顛換編輯.

綜上所述，本研究開(kāi)發(fā)了一系列水稻腺嘌呤堿基顛換編輯工具（表5），揭示了鼠源mAAG 突變體和水稻內(nèi)源OsMPG 及其突變體架構(gòu)的水稻腺嘌呤堿基顛換編輯器可有效實(shí)現(xiàn)A-to-T/C 編輯，為植物腺嘌呤堿基顛換編輯技術(shù)的優(yōu)化提供了更多底盤糖基化酶.