關(guān)鍵詞： 熱形態(tài)建成； 轉(zhuǎn)錄因子； ATAF1； NAC 家族； 擬南芥

1 引言

溫度是影響全球植物分布和生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境因素，高溫下植物通過(guò)蛋白質(zhì)變性和活性氧（ROS）積累導(dǎo)致不可逆的損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞器和光合作用的功能故障［1-3］. 一般來(lái)說(shuō)，植物有兩種不同的高溫耐受機(jī)制：第一個(gè)是關(guān)于抗高溫的內(nèi)在能力，通常被稱為基礎(chǔ)耐熱性；第二個(gè)是植物預(yù)先暴露于輕度高溫下誘導(dǎo)對(duì)高溫的適應(yīng)性，這一過(guò)程稱為熱形態(tài)建成［4］. 典型的熱形態(tài)建成反應(yīng)包括下胚軸伸長(zhǎng)、葉片向上運(yùn)動(dòng)、葉柄伸長(zhǎng)、氣孔密度降低和葉片變小、變?。?，6］. 由熱形態(tài)建成形成的開(kāi)放式蓮座結(jié)構(gòu)通過(guò)蒸騰作用有助于增強(qiáng)冷卻能力，并避免太陽(yáng)熱流［7，8］. 高溫引發(fā)的熱脅迫會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)性能，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)減少和產(chǎn)量下降，這與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)尤其相關(guān). 因此了解植物如何感知溫度并將這些信息整合到其發(fā)育中，對(duì)于確定植物適應(yīng)氣候變化機(jī)制以及氣候適應(yīng)型作物的育種非常重要［9］. 植物在高溫下生長(zhǎng)的結(jié)構(gòu)反應(yīng)包括莖和葉柄伸長(zhǎng)［8］. 當(dāng)氣溫上升到 40 ℃以上，植物經(jīng)歷嚴(yán)重的熱脅迫，導(dǎo)致全身性損傷、功能障礙，甚至細(xì)胞死亡［10］. 植物熱形態(tài)發(fā)生的特征主要包括下胚軸和葉柄生長(zhǎng)較快、初生根生長(zhǎng)加快、葉片發(fā)育遲緩、開(kāi)花早、果實(shí)開(kāi)裂加快和產(chǎn)量降低等［11-14］. 在這些性狀中，長(zhǎng)下胚軸的伸長(zhǎng)常被用作植物熱形態(tài)發(fā)生研究的證據(jù)［15］. 通過(guò)增強(qiáng)冷卻能力，熱形態(tài)發(fā)生可以在次優(yōu)溫度條件下實(shí)現(xiàn)最佳性能. 當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時(shí)，可以誘導(dǎo)熱脅迫耐受機(jī)制，使植物能夠在壓力溫度下生存，這通常包括細(xì)胞保護(hù)機(jī)制和對(duì)其的記憶［16］.

NAC 家族是一個(gè)植物特異性轉(zhuǎn)錄家族，在植物對(duì)不同生物和非生物脅迫（包括水分虧缺、鹽度脅迫和溫度脅迫）的響應(yīng)中發(fā)揮重要作用［17，18］. 一些 NACs 已被報(bào)道參與擬南芥和作物的高溫脅迫反應(yīng). 根據(jù)保守的N 端NAC 結(jié)構(gòu)域內(nèi)外的序列相似性，轉(zhuǎn)錄因子NAC 家族被分為幾個(gè)亞家族［19］，其中一個(gè)亞家族被稱為ATAF，已被證明是植物應(yīng)對(duì)病原體攻擊反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子［20，21］.ATAF2 是一種參與創(chuàng)傷、水楊酸、茉莉酸和鹽應(yīng)激反應(yīng)的基因，其過(guò)表達(dá)導(dǎo)致真菌病原體易感性增加，致病相關(guān)基因表達(dá)降低［20］. 擬南芥在干旱和ABA 脅迫下相關(guān)基因的表達(dá)受到NAC 轉(zhuǎn)錄因子ATAF1 的負(fù)調(diào)控［18］，ABA-insensitive（ abi）突變體在萌發(fā)過(guò)程中表現(xiàn)出鹽敏感和干旱敏感的表型，過(guò)表達(dá)ABA 反應(yīng)通路基因（ 如SDIR1、ABF3 和ABF4）的植物，則不耐旱且對(duì)鹽不敏感，而過(guò)表達(dá)ATAF1 的突變體對(duì)干旱耐受性顯著增強(qiáng)，對(duì)鹽脅迫高度敏感［20，22］. ATAF 在單子葉和雙子葉植物滲透調(diào)節(jié)中是保守的［22］，研究發(fā)現(xiàn)ATAF1 參與植物衰老調(diào)控，其中H2O2 作為生理信號(hào)或代謝物.ATAF1 通過(guò)直接調(diào)控關(guān)鍵的光合作用和衰老轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)，將ABA 和H2O2 依賴的信號(hào)通路與衰老整合在一起［17］. 在生長(zhǎng)發(fā)育及鹽脅迫引起的葉片衰老過(guò)程中，ATAF1 的表達(dá)增加［23，24］. 在擬南芥中，應(yīng)激誘導(dǎo)ABA 產(chǎn)生，進(jìn)一步促進(jìn)擬南芥激活A(yù)TAF1/ANAC002 基因的表達(dá). ATAF1 蛋白通過(guò)與擬南芥ORE1/ANAC092 基因直接結(jié)合，誘導(dǎo)衰老調(diào)節(jié)因子ORE1/ANAC092 基因表達(dá)，抑制葉綠體維持因子（GLK1）基因表達(dá)，從而促進(jìn)衰老進(jìn)程，發(fā)揮調(diào)控作用［17］. 此外，研究表明 ATAF1 過(guò)表達(dá)系對(duì)高鹽度、ABA、氧化應(yīng)激和壞死性病原體感染高度敏感［18］.

研究顯示，在本世紀(jì)下半葉，氣候變暖可能會(huì)對(duì)重要主糧作物的產(chǎn)量產(chǎn)生負(fù)面影響，而培育適應(yīng)高溫的作物可以改善這種不利局勢(shì)［25］. 因此了解熱形態(tài)建成背后的分子遺傳通路，對(duì)抵抗環(huán)境溫度的變化至關(guān)重要. 研究表明轉(zhuǎn)錄因子ATAF1同源基因參與了水稻、小麥、玉米熱耐受性的調(diào)控［26-29］，且ATAF1 負(fù)調(diào)控植物的熱記憶應(yīng)答［30］，因此探究ATAF1 在適度高溫下的調(diào)控機(jī)制將為理解龐大的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子NAC 家族的存在意義提供新的證據(jù). 本文探究了 ATAF1 在植物熱形態(tài)建成中的功能，通過(guò)本研究不僅可以拓寬對(duì)NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子的認(rèn)識(shí)，也為理解植物響應(yīng)全球氣候變化調(diào)控?zé)嵝螒B(tài)建成提供新的理論依據(jù).

2 材料方法

2. 1 材料

本研究中使用的擬南芥野生型Col-0（Columbia）以及突變體ataf1-2（ SALK_057618）為本實(shí)驗(yàn)室原有35S：：ATAF1-HA、proATAF1：：GUS 和proATAF1：：ATAF1-GFP 轉(zhuǎn)基因植株通過(guò)根癌農(nóng)桿菌（GV3101）浸染獲得35S：：ATAF1-HA、proATAF1：：ATAF1-GFP ataf1-2 通過(guò)遺傳雜交篩選所得.

2. 2 實(shí)驗(yàn)方法

2. 2. 1 構(gòu)建表達(dá)載體 以野生型的cDNA 為模板采用PCR 擴(kuò)增目的序列，擴(kuò)增采用Takara 公司的PrimeSTAR 高保真酶，將上述反應(yīng)液放入PCR儀，采用三步法擴(kuò)增. DNA 膠回收采用生工公司的SanPrep 柱式DNA 膠回收試劑盒，質(zhì)粒小量提取采用生工公司的SanPrep 柱式質(zhì)粒DNA 小量抽提試劑盒，將提取的質(zhì)粒用Thermo 公司的FastDigest 快切酶進(jìn)行載體線性化處理，線性化后的載體與目的片段用諾唯贊公司的無(wú)縫克隆試劑盒構(gòu)建載體.

2. 2. 2 GUS 染色 對(duì)經(jīng)過(guò)處理的幼苗進(jìn)行避光染色，使用上海生工科技有限公司的GUS 染色液（Sangon Biotech，Cat no. A610085-0025），在37 ℃下染色2 h，隨后使用 75% 乙醇進(jìn)行脫色. 觀察染色結(jié)果，利用熒光顯微鏡采集圖像.

2. 2. 3 數(shù)據(jù)處理 使用GraphPad Prism 9 進(jìn)行顯著性分析和柱狀圖繪制，誤差線表示3 次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差，*表示兩者間有顯著性差異，a、b、c由大到小表示有顯著性差異的平均數(shù)，Plt;0. 05.

2. 2. 4 免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western Blot， WB） 選取擬南芥幼苗部分組織使用液氮將植物組織磨成細(xì)粉，加入2× loading buffer，煮沸后離心，吸取上清液用作植物總蛋白提取物. 使用上海雅酶提供的快速制備試劑盒制備PAGE 凝膠，將蛋白樣品上樣至組裝好并加入電泳緩沖液的電泳裝置中，設(shè)置電泳參數(shù)（恒壓120 V，1 h）；電泳結(jié)束后，使用干轉(zhuǎn)儀進(jìn)行膜轉(zhuǎn)移，設(shè)置轉(zhuǎn)膜參數(shù)（ 恒壓25 V，40 min）；將PVDF 膜轉(zhuǎn)至孵育盒，加入封閉緩沖液后放入搖床封閉（37 ℃ ，90 r/min，1 h）；倒掉封閉液，加入一抗溶液后搖床孵育（37 ℃ ，90 r/min2 h）；倒掉一抗溶液，加入TBST 緩沖液后置于搖床中重復(fù)清洗3 次（37 ℃，90 r/min，10 min）；加入二抗溶液，搖床孵育（37 ℃，90 r/min，1 h）；倒掉二抗溶液，加入TBST 緩沖液后置于搖床中重復(fù)清洗3 次（37 ℃，90 r/min，10 min）；倒掉二抗，加入8mL TBST 緩沖液清洗PVDF 膜，置于搖床清洗（37 ℃ ，90 r/min，10 min），重復(fù)清洗3 次；最后用Bio-Rad 化學(xué)顯影成像系統(tǒng)進(jìn)行顯影. 相關(guān)緩沖液見(jiàn)表1.

3 結(jié)果

3. 1 溫和高溫抑制ATAF1 的轉(zhuǎn)錄

溫度是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因子， 為了適應(yīng)不斷變化的環(huán)境， 植物在高溫下通常會(huì)表現(xiàn)出下胚軸和葉柄伸長(zhǎng)的表型［16］. 有研究表明NACs 家族成員廣泛參與植物生長(zhǎng)代謝的多個(gè)過(guò)程，其中ATAF1 被證明為植物的熱響應(yīng)基因［30］.為了進(jìn)一步探究 ATAF1 在植物熱形態(tài)建成中的功能，本研究首先對(duì)ATAF1 響應(yīng)溫和高溫的表達(dá)模式進(jìn)行了分析. 將Col-0 植株分別放置在22 ℃和28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)5 d，提取幼苗總RNA，通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)下胚軸和葉柄中ATAF1 基因的表達(dá)水平. 研究表明，與對(duì)照組相比，28 ℃幼苗的下胚軸和葉柄中ATAF1 表達(dá)均受到抑制（圖1a）. 另一方面，通過(guò)proATAF1：：GUS 轉(zhuǎn)基因植株的GUS 染色發(fā)現(xiàn)，ATAF1 轉(zhuǎn)錄活性在28 ℃下減弱，且轉(zhuǎn)錄物變化主要發(fā)生在葉柄和下胚軸中（圖1b）.

3. 2 ATAF1 蛋白積累溫和高溫下被抑制

為了進(jìn)一步研究 ATAF1 在溫和高溫下的響應(yīng)機(jī)制，我們構(gòu)建了一系列 ATAF1 相關(guān)材料，包括缺失突變體ataf1-2，回補(bǔ)材料ataf1-2PATAF1：：ATAF1-GFP，過(guò)表達(dá)材料proATAF1：：ATAF1-GFP 以及超表達(dá)轉(zhuǎn)基因材料35S：：ATAF1-HA，并通過(guò)RT-qPCR 和western-blot 檢測(cè)了ATAF1 轉(zhuǎn)錄水平和蛋白積累（圖2），最終獲得符合要求的實(shí)驗(yàn)材料.

接下來(lái)我們探究了在不同溫度生長(zhǎng)的幼苗中ATAF1 蛋白的積累水平. 如圖3a 所示，在內(nèi)源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)的proATAF1：：ATAF1-GFP 植株中，28 ℃ 條件下下胚軸和葉柄中的ATAF1-GFP蛋白量積累明顯低于22 ℃下生長(zhǎng)的植株中的蛋白量. 而在35S 強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的35S：： ATAF1-HA中，ATAF1-HA 蛋白在28 ℃下的積累量顯著低于22 ℃（圖3b）. 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溫和高溫信號(hào)降低ATAF1 蛋白水平.

3. 3 ATAF1 溫和高溫下抑制葉柄和下胚軸伸長(zhǎng)

上述結(jié)果表明溫和高溫下，ATAF1 的轉(zhuǎn)錄水平與蛋白積累量在下胚軸和葉柄中都發(fā)生了變化，我們推測(cè)ATAF1 會(huì)影響擬南芥下胚軸和葉柄在溫和高溫下的生長(zhǎng)發(fā)育. 為了證明這個(gè)猜想，我們觀察了Col-0、ataf1-2、ataf1-2 pATAF1：：ATAF1-GFP 和35S：：ATAF1-HA 分別在22 ℃和28 ℃生長(zhǎng)5d 的幼苗的下胚軸和葉柄表型. 結(jié)果表明：與22 ℃ 相比，在28 ℃ 下35S：：ATAF1-HA 的下胚軸幾乎不伸長(zhǎng)，葉柄也明顯較短；在缺失突變體ataf1-2 中，22 ℃條件下下胚軸和葉柄與野生型沒(méi)有差異，而28 ℃下明顯長(zhǎng)于野生型，回補(bǔ)材料表現(xiàn)出了與 Col-0 一致的表型（圖4a）. 同時(shí)，我們測(cè)定了不同溫度下葉柄和下胚軸的長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)分析顯示缺失突變體ataf1-2 和過(guò)表達(dá)植株35S：：ATAF1-HA 的下胚軸和葉柄長(zhǎng)度在28 ℃下與野生型相比存在顯著性差異（圖4b、4c）. 這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ATAF1 負(fù)調(diào)控溫和高溫下葉柄和下胚軸的伸長(zhǎng).

接下來(lái)，我們?cè)陲@微鏡下觀察不同溫度生長(zhǎng)下的下胚軸和葉柄表皮細(xì)胞長(zhǎng)度. 在正常溫度下，缺失突變體ataf1-2 下胚軸表皮細(xì)胞略長(zhǎng)于野生型，而在28 ℃下，ataf1-2 的細(xì)胞長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于野生型（圖5a、5c）. 葉柄表皮細(xì)胞長(zhǎng)度呈現(xiàn)了與下胚軸一致的變化趨勢(shì)（圖5b、5d）. 以上結(jié)果表明，在溫和高溫下ATAF1 介導(dǎo)了植物的下胚軸和葉柄的伸長(zhǎng)生長(zhǎng).

4 討論

全球溫度加速上升，植物的生長(zhǎng)發(fā)育面臨巨大挑戰(zhàn)，糧食作物面臨營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)減少、產(chǎn)量下降的威脅［9］. 為了適應(yīng)升高的環(huán)境溫度，植物體的下胚軸、葉柄、初生根的生長(zhǎng)狀態(tài)發(fā)生變化［9］. 隨著我們對(duì)于NAC 轉(zhuǎn)錄因子在不同植物中調(diào)控功能的認(rèn)識(shí)不斷加深，我們發(fā)現(xiàn)脅迫響應(yīng)型NAC 轉(zhuǎn)錄因子可作為在逆境條件下高產(chǎn)的耐脅迫轉(zhuǎn)基因植株的候選基因［28，29，31］. 本研究主要探索了NAC 轉(zhuǎn)錄家族ATAF1 轉(zhuǎn)錄因子在熱形態(tài)建成過(guò)程中的功能，由于AFAF1 存在于多個(gè)物種且功能具有相似性，因此闡明ATAF1 的熱應(yīng)答工作機(jī)制，可以為新型耐高溫品種選育提供一定指導(dǎo). ATAF 亞家族在多個(gè)物種中有保守的生物學(xué)功能，ATAF1 及其同源基因在玉米、水稻、小麥、大豆等多個(gè)物種中被證明是熱響應(yīng)基因［27，29，31］. ATAF 亞家族中的ATAF1 在多種生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮作用［32］. 許多NAC 轉(zhuǎn)錄因子在高溫下都有響應(yīng)，并且ANAC042、ATAF1 以及NAC05 負(fù)調(diào)控?cái)M南芥的熱脅迫記憶應(yīng)答［22，33］. 因此探究NAC 轉(zhuǎn)錄因子在熱下的調(diào)控機(jī)制將為理解這個(gè)龐大的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子家族的存在意義提供新的證據(jù). 同樣，熱形態(tài)建成作為植物對(duì)高溫的一種適應(yīng)性生長(zhǎng)，NAC 轉(zhuǎn)錄因子可能也參與對(duì)該進(jìn)程的調(diào)控.

熱形態(tài)建成是一種適應(yīng)性生長(zhǎng)，可能會(huì)減少潛在的有害高溫條件造成的損害［11］. 在擬南芥中，溫暖的環(huán)境變化會(huì)引發(fā)不同的發(fā)育、生理和形態(tài)反應(yīng)，包括對(duì)芽和根的生長(zhǎng)、氣孔分化、開(kāi)花、免疫和產(chǎn)量的調(diào)節(jié)，統(tǒng)稱為熱形態(tài)建成［12，34，35］. 在這些特征中，下胚軸的伸長(zhǎng)發(fā)育通常被用作植物熱形態(tài)建成研究的標(biāo)志性表型. 本研究發(fā)現(xiàn)，28 ℃幼苗的下胚軸和葉柄中ATAF1 表達(dá)均受到抑制. 通過(guò)proATAF1：：GUS 轉(zhuǎn)基因植株的GUS 染色發(fā)現(xiàn)，ATAF1 轉(zhuǎn)錄活性在28 ℃下減弱，且轉(zhuǎn)錄物變化主要發(fā)生在葉柄和下胚軸中. 接下來(lái)，構(gòu)建pro?ATAF1：：ATAF1-GFP 和35S：： ATAF1-HA 突變體，通過(guò)對(duì)比內(nèi)源啟動(dòng)子和35S 強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植株中28 ℃和22 ℃條件下蛋白積累量，得出結(jié)論高溫信號(hào)降低ATAF1 蛋白水平. 進(jìn)一步觀察Col-0、ataf1-2、ataf1-2 pATAF1：：ATAF1-GFP 和35S：：ATAF1-HA 分別在22 ℃和 28 ℃生長(zhǎng)5 d 的幼苗的下胚軸和葉柄表型并測(cè)量長(zhǎng)度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ATAF1 負(fù)調(diào)控溫和高溫下葉柄和下胚軸的伸長(zhǎng). 又通過(guò)顯微鏡觀察不同溫度生長(zhǎng)下的下胚軸和葉柄表皮細(xì)胞長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)下ATAF1 介導(dǎo)了植物的下胚軸和葉柄的伸長(zhǎng)生長(zhǎng). 綜上所述，本文探究了ATAF1 在植物熱形態(tài)建成中的功能，解析了NAC 家族轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的新進(jìn)程.

由于ATAF1 在多物種中的保守性，這將為指導(dǎo)培育耐熱性農(nóng)作物提供新的可能方向. 在高溫脅迫過(guò)程中活性氧和NO 大量產(chǎn)生，半胱氨酸過(guò)氧化、S-亞硝基化等翻譯后修飾也被誘導(dǎo)，這些修飾是植物應(yīng)對(duì)熱環(huán)境的一種重要翻譯后調(diào)控策略，可能也在熱形態(tài)建成進(jìn)程中扮演重要角色［36］. 而真核生物蛋白質(zhì)組中存在兩種最普遍的翻譯后修飾，磷酸化和泛素化修飾，磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要機(jī)制，而泛素化在蛋白降解中發(fā)揮了重要的作用，二者之間的交叉調(diào)控可采取很多形式. 本研究發(fā)現(xiàn)，ATAF1 在熱下蛋白穩(wěn)定性下降從而導(dǎo)致豐度降低，猜測(cè)或許會(huì)受到上述翻譯后修飾的調(diào)控，進(jìn)一步研究ATAF1 在熱形態(tài)建成進(jìn)程中的蛋白穩(wěn)定性變化機(jī)制有助于更全面的認(rèn)識(shí)熱形態(tài)應(yīng)答. 基于本研究的結(jié)果，進(jìn)一步探索溫和高溫誘導(dǎo) ATAF1 蛋白降解的分子機(jī)制將為徹底揭示 NAC 轉(zhuǎn)錄因子在熱下的響應(yīng)機(jī)制提供重要證據(jù)，也可為完善植物熱形態(tài)建成領(lǐng)域的研究提供有益參考，研究熱下ATAF1 的翻譯后修飾將是潛在的突破口. 解析溫度響應(yīng)因子在熱形態(tài)建成中的調(diào)控機(jī)制是理解植物如何響應(yīng)熱環(huán)境來(lái)改變內(nèi)源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、活性以降低高溫?fù)p傷的關(guān)鍵，也可作為分子育種培育耐熱作物的重要參考點(diǎn). 本研究有助于理解植物響應(yīng)全球氣候變化調(diào)控?zé)嵝螒B(tài)建成的機(jī)制，為提高植物的耐熱性和保障糧食安全提供新的理論依據(jù).