關(guān)鍵詞： 蕓薹屬根腫菌； 效應(yīng)蛋白； 植物免疫

1 引言

蕓薹屬根腫菌（Plasmodiophora brassicae）引發(fā)的根腫病（clubroot disease）是一種對(duì)十字花科作物極具破壞性的土傳性疾?。?］，嚴(yán)重影響十字花科經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量. 在極端年份，平均產(chǎn)量損失為20%～30%，田間損失甚至超過(guò)60%［2］. 隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)活動(dòng)的擴(kuò)大，油菜及十字花科蔬菜根腫病的發(fā)病面積正迅速增加，在四川、湖北、云南、安徽等省份尤為嚴(yán)重［3］. 根腫菌的休眠孢子可在土壤中存留20 年仍然具有侵染能力［4］，且根腫菌具有復(fù)雜的生理小種分化［5］，現(xiàn)有的防治措施或效果欠佳，或成本過(guò)高，尋找新的、更有效的抗病基因并培育廣譜抗性品種是現(xiàn)階段根腫病防治的重要任務(wù)［6］，因此更需深入了解根腫菌致病機(jī)理及其與宿主植物互作的關(guān)系［7］.

在植物與病原菌長(zhǎng)期的“ 軍備競(jìng)賽”中，病原菌會(huì)在侵染期間分泌多種不同類型的效應(yīng)分子，包括效應(yīng)蛋白、小RNA、植物激素及其衍生物等進(jìn)入宿主細(xì)胞的不同亞細(xì)胞區(qū)室以干擾各種生物學(xué)過(guò)程. 如大豆疫霉菌和大麗輪枝菌分泌的效應(yīng)蛋白PsIsc1 和VdIsc1 可以水解水楊酸前體異支分酸，抑制宿主體內(nèi)水楊酸介導(dǎo)的先天免疫反應(yīng)［8］.番茄葉霉菌分泌的效應(yīng)蛋白Avr4 可以與真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)結(jié)合，保護(hù)病原菌的細(xì)胞壁不被植物幾丁質(zhì)酶的水解，從而增強(qiáng)了病原菌的致病能力［9， 10］. 黃單胞菌的效應(yīng)蛋白XopJ 靶向宿主細(xì)胞高爾基體并抑制胼胝質(zhì)沉積［11］. 小麥條銹菌分泌的效應(yīng)蛋白PgtSR1 改變了參與寄主防御過(guò)程的sRNA 豐度，促進(jìn)對(duì)多種病原體的易感性，并抑制了部分抗性基因介導(dǎo)的多種防御反應(yīng)［12］. 黑粉病菌侵染玉米時(shí)，通過(guò)分泌Rsp3 效應(yīng)蛋白與菌絲細(xì)胞壁結(jié)合，保護(hù)菌絲不被玉米抗真菌蛋白AFP1 和AFP2 破壞，進(jìn)而抵消植物的防御反應(yīng)［13］. 因此，探究根腫菌分泌蛋白與宿主互作的分子機(jī)制是了解根腫菌的一個(gè)重要層面，同時(shí)也為挖掘根腫病抗病基因和培育廣譜抗性品種夯實(shí)理論基礎(chǔ)［14］. 目前關(guān)于根腫菌效應(yīng)蛋白的鑒定僅有少量報(bào)道，PbBSMT 是目前研究較為深入的根腫菌效應(yīng)蛋白. PbBSMT 是一種甲基轉(zhuǎn)移酶，可以將宿主體內(nèi)的SA 轉(zhuǎn)化為更易揮發(fā)的MeSA，從而降低宿主防御能力，幫助根腫菌入侵和定殖［15］. 另一方面，PbBSMT 也可能消除幾丁質(zhì)誘導(dǎo)的植物防御反應(yīng)［16］. 除此之外，SSPbP53 ［17， 18］、PbZF1［19］、Pb?ChiB4 和PbChiB2［20］等效應(yīng)蛋白也被證實(shí)對(duì)根腫菌發(fā)揮致病能力至關(guān)重要.

PBRA_000499 是前期鑒定的一種具有分泌功能的根腫菌蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)PBRA_000499 包含RING 型結(jié)構(gòu)域，具有E3 泛素連接酶活性［21， 22］. 為了進(jìn)一步探究PBRA_000499 的功能，本研究采用煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)驗(yàn)證其在植物免疫系統(tǒng)中的作用，并將PBRA_000499 在擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)，探究其在根腫菌侵染過(guò)程中發(fā)揮的作用. 以期在根腫菌與寄主的互作關(guān)系中提供新的見(jiàn)解，為根腫菌的致病機(jī)理研究和十字花科病害防治提供一定的理論依據(jù).

2 材料與方法

2. 1 實(shí)驗(yàn)材料

根腫菌：采集于四川省廣漢市西高鎮(zhèn)，根據(jù)SCD（Sinitic clubroot differential）分類系統(tǒng)鑒定為Pb3［23］，于-20 ℃保存?zhèn)溆?

植物材料：擬南芥哥倫比亞型（Arabidopsisthaliana，Col-0）和煙草（Nicotiana benthamiana）由本實(shí)驗(yàn)室提供.

2. 2 實(shí)驗(yàn)方法

2. 2. 1 RNA 提取及重組載體構(gòu)建 取保存的感病植株的腫根，用無(wú)菌水清洗后置于液氮中研磨成粉，用KK 超快植物總RNA 提取試劑盒（莊盟生物）按照說(shuō)明書(shū)提取RNA. 使用TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super?Mix 試劑盒（全式金）按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，所得產(chǎn)物于-20 ℃保存?zhèn)溆?

以根腫菌cDNA 為模板，擴(kuò)增得到PBRA-000499 和PBRA_000499△ sp 基因片段，根據(jù)不同載體的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物（表1），分別構(gòu)建pGR107-PBRA_000499△ sp、PBI221-PBRA_000499-eGFP、pFGC5941-PBRA_000499-FLAG 重組載體；挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒送測(cè)序，于-20 ℃保存測(cè)序正確的質(zhì)粒備用.

2. 2. 2 PBRA_000499 煙草瞬時(shí)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pGR107-PBRA_000499△ sp 轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101 中，經(jīng)培養(yǎng)后挑取陽(yáng)性克隆，繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng). 8000 r/min 離心5 min 收集菌體，用提前配制好的細(xì)胞重懸液（10 mmol/L MgCl2，10 mmol/LMES，0. 15 mmol/L AS）重懸至OD600 為0. 8～1. 0，室溫下黑暗處理2 h；使用1 mL 的注射器吸取菌液，用針頭輕輕地在煙草葉片背面點(diǎn)一個(gè)小口，去掉針頭后，從葉片傷口處將菌液注射到葉片中；將注射后的煙草移入黑暗環(huán)境中培養(yǎng)12 h，然后在正常光周期下培養(yǎng)2. 5～4 d；使用1 cm 的打孔器截取注射位置的煙草，浸泡在5 mL 的ddH2O 中，室溫靜置3 h ，測(cè)量電導(dǎo)率記為E1；100 ℃ 加熱25 min，冷卻至室溫后再次測(cè)定電導(dǎo)率，記為E2；計(jì)算電解質(zhì)滲漏率.

2. 2. 3 亞細(xì)胞定位 選取厚實(shí)且葉脈較少的葉片，蘸取少量金剛砂輕輕地揉搓煙草下表皮絨毛，將葉片切成1 mm 左右細(xì)條，均勻置于酶解液（1. 5% Cellulose R10，0. 4% Macerozyme R10，0. 4 mol/L Mannitol，20 mmol/L MES pH=5. 7，20 mmol/L KCl ，10 mmol/L CaCl2，0. 1% BSA）當(dāng)中；黑暗條件下，30 ℃培養(yǎng)2 h 左右；挑出培養(yǎng)皿中的葉片殘?jiān)半s質(zhì)，緩慢輕柔地加入1 倍體積的預(yù)冷W5 溶液（10 mmol/L MES，125 mmol/LCaCl2，5 mmol/L KCl，154 mmol/L NaCl），使用200 目過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾溶液，并將濾液轉(zhuǎn)移至50 mL 圓底EP 管中；200 r/min 離心3 min，緩慢吸取上清，加入等體積預(yù)冷的W5 溶液；冰浴1 h；200 r/min 離心2 min，吸去上清，沿管壁緩慢加入2 mL MMG溶液（0. 4 mmol/L MES，400 mmol/L Mannitol，15 mmol/L MgCl2）后輕輕混勻；吸取30 μL 質(zhì)粒PBI221-PBRA_000499-eGFP、PBI221-eGFP（ 陽(yáng)性對(duì)照），加至2 mL 無(wú)菌EP 管中，分別向其中加入200 μL 原生質(zhì)體和230 μL 40% PEG4000 溶液，迅速輕柔混勻，室溫條件下轉(zhuǎn)化20 min；加入920 μL 已預(yù)冷的W5 溶液；200 r/min 離心2 min，吸去上清，沿管壁加入1 mL預(yù)冷的W（I 500 mmol/LMannitol，20 mmol/L KCl，0. 4 mmol/L MES）溶液，重懸原生質(zhì)體；將EP 管水平放置，25 ℃黑暗培養(yǎng)16～18 h；200 r/min 離心2 min，緩慢吸去上清，用預(yù)冷的W5 溶液清洗2 次，留存100 μL 原生質(zhì)體；吸取10 μL 原生質(zhì)體制作臨時(shí)玻片，在正置熒光顯微鏡下觀察原生質(zhì)體.

2. 2. 4 擬南芥的培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化 將重組質(zhì)粒pFGC5941-PBRA_000499-FLAG 轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR 鑒定，將正確的單克隆接種至含有Kan 和Rif 的LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，至OD600 為0. 6；4500 g 離心5 min 收集菌體后，用1/2 MS 液體培養(yǎng)基重懸菌體沉淀后再次離心棄上清；用擬南芥花序浸染液（1/2 MS 培養(yǎng)基，5% 蔗糖，0. 03% Silwet L-77）稀釋菌體，至OD600 為0. 8～1，黑暗處理0. 5～2 h；選取長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)良的植株，剪去角果，將花序浸沒(méi)在浸染液中，30～50 s，覆膜保濕，黑暗培養(yǎng)24 h；每隔5～7 d 侵染1 次，重復(fù)3 次；收集成熟種子，即獲得T0代種子；將T0代種子春化3 d 后撒播在土壤基質(zhì)中，至長(zhǎng)出2 片真葉后，早晚各噴灑1 次0. 05%Basta 溶液. 5～7 d 后可觀察到非陽(yáng)性株枯萎死亡，將陽(yáng)性植株轉(zhuǎn)移至新的土壤基質(zhì)中繼續(xù)培養(yǎng).2～3 w 后取適量葉片組織提取RNA 后反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR、RT-qPCR 檢測(cè)，相關(guān)引物見(jiàn)表2. 使用2-△△Ct 法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，選取轉(zhuǎn)錄水平較高的3 個(gè)株系單株收取種子后擴(kuò)繁，直至T3 代獲得純合穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的株系.

2. 2. 5 擬南芥的根腫菌侵染 采集感病植株的根部組織，攪碎成勻漿狀后過(guò)濾，3000 r/min 離心10 min 后棄去上清液；用50%（w/v）蔗糖溶液重懸菌體沉淀，3000 r/min 離心10 min 后棄去上清液；清洗沉淀3～5 次；用2% 的氯胺-T 溶液重懸沉淀，室溫靜置20 min 后加入抗生素（頭孢噻肟鈉、鹽酸萬(wàn)古霉素和硫酸粘桿菌素，終濃度均為0. 1%），25 ℃靜置過(guò)夜；3000 r/min 離心10 min，棄上清；洗滌菌體3～5 遍，加入少量無(wú)菌水，即得到休眠孢子懸浮液，利用血球計(jì)數(shù)板對(duì)稀釋后的懸浮液測(cè)定濃度；種子春化3 d 萌發(fā)后，挑選大小相近的幼苗，單株移栽. 每株擬南芥根部注射1 mL 濃度為1×107 個(gè)/mL 的根腫菌休眠孢子懸浮液，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組為根部注射1 mL ddH2O.

分別記錄不同擬南芥材料接種根腫菌后7 d、14 d、21 d、28 d 的表型，同時(shí)記錄接種后21 d 和28 d 的根部情況. 為了確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可信度，每種擬南芥材料至少種植30 株，進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)；將不同材料置于同一個(gè)育苗托盤(pán)中培養(yǎng)，以減少由于培養(yǎng)條件不同造成的誤差. 計(jì)算病情指數(shù)DI.

DI=100× Σ（發(fā)病等級(jí)數(shù)×各等級(jí)對(duì)應(yīng)擬南芥株數(shù)）/（擬南芥總調(diào)查株數(shù)×最高發(fā)病等級(jí)數(shù)）.

3 結(jié)果與分析

3. 1 PBRA_000499 影響植物細(xì)胞免疫響應(yīng)

小鼠促凋亡因子BAX［24］、卵菌中的激發(fā)子INF1［25］誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡與植物防御相關(guān)的HR 相似. 因此，檢測(cè)BAX、INF1 誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的抑制作用是評(píng)估病原菌效應(yīng)物在抑制植物免疫方面的毒力功能的有效策略. 將構(gòu)建好的pGR107-PBRA_000499△sp 融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，注射本氏煙草進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，結(jié)果如圖1a 所示. 注射PBRA_000499△sp 后并沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞死亡現(xiàn)象，即PBRA_000499 不會(huì)直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡.為了驗(yàn)證PBRA_000499 是否會(huì)抑制植物的免疫反應(yīng)，在注射PBRA_000499△sp 12 h 后，在相同位置分別注射BAX 和INF1，并將單獨(dú)注射eGFP、單獨(dú)注射BAX 或INF1、注射eGFP 12 h 后相同位置再注射BAX 或INF1 作為對(duì)照，7 d 后觀察并記錄葉片注射點(diǎn)狀態(tài). 結(jié)果如圖1b 所示，單獨(dú)注射eGFP 后煙草葉片生長(zhǎng)狀態(tài)良好，而分別單獨(dú)注射INF1、BAX、eGFP-INF1 或eGFP-BAX 的煙草葉片出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞壞死，而注射PBRA_000499△sp-BAX 和PBRA_000499△sp-INF1 的煙草葉片均未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡現(xiàn)象. 在注射第7 d時(shí)對(duì)煙草葉片進(jìn)行電解質(zhì)滲漏率測(cè)定. 結(jié)果表明（圖2），陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照存在極顯著差異，注射PBRA_000499△sp-BAX 和PBRA_000499△sp-INF1 與eGFP-BAX 和eGFP-INF1 之間也存在極顯著差異，這與煙草葉片上所呈現(xiàn)的表型一致.

3. 2 PBRA_000499 亞細(xì)胞定位

為了明確效應(yīng)蛋白PBRA_000499 發(fā)揮功能的具體位置，對(duì)PBRA_000499 進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析. 將表達(dá)載體（pBI221-PBRA_000499-eGFP、pBI221-eGFP 載體）轉(zhuǎn)化至當(dāng)天制備的高質(zhì)量煙草原生質(zhì)體中，黑暗培養(yǎng)后通過(guò)正置熒光顯微鏡觀察拍照，結(jié)果如圖3 所示. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PBRA_000499 在細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中出現(xiàn)明顯的熒光；結(jié)果表明PBRA_000499 是一個(gè)可以靶向植物細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的效應(yīng)蛋白.

3. 3 PBRA_000499 擬南芥穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植株的獲得

以根腫菌總RNA 反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 作為模板，擴(kuò)增得到PBRA_000499 基因片段，利用雙酶切技術(shù)，將目的基因?qū)雙FGC5941 載體中. 使用35S 和ocs-R 引物鑒定重組質(zhì)粒，凝膠電泳顯示，在1077 bp 處有特異條帶，與預(yù)測(cè)大小一致（圖4a）

將測(cè)序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，采用花序浸染的方式轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中. 收取種子后使用Basta 篩選陽(yáng)性株系，即T0 代（圖4b）；通過(guò)半定量結(jié)果可以看出，相較于Col-0，PBRA_000499 過(guò)表達(dá)株系可以擴(kuò)增得到PBRA_000499基因片段（圖4c），說(shuō)明成功構(gòu)建PBRA_000499 轉(zhuǎn)基因擬南芥株系；qPCR 檢測(cè)了各穩(wěn)定轉(zhuǎn)化株系中PBRA_000499 基因的轉(zhuǎn)錄水平（圖4d），選取表達(dá)量最高的3 個(gè)株系，擴(kuò)繁至T3代并保存種子以便后續(xù)實(shí)驗(yàn).

3. 4 PBRA_000499 基因加重?cái)M南芥植株根腫病病情

接種前14 d，PBRA_000499 轉(zhuǎn)基因株系及Col-0 兩種材料都能正常生長(zhǎng)，且相互之間沒(méi)有明顯差異；接種21 d 時(shí)，Col-0 植株普遍矮小，呈現(xiàn)受脅迫表型，葉片發(fā)紫，且葉片邊緣變黃，根部出現(xiàn)腫塊. 35S ∷ PBRA_000499 相較于Col-0，植株更小且受脅迫程度更深，部分側(cè)根腐爛，主根腫大.接種28 d 后，35S∷PBRA_000499 和Col-0 材料大多已經(jīng)萎蔫，根部腫塊變大；但35S ∷ PBRA-000499 情況更甚，地上部分基本枯萎死亡，地下根部側(cè)根腐爛僅保留了腫大的主根，僅有少數(shù)植株保留一定量的側(cè)根（圖5a、5b）. 根據(jù)表型記錄計(jì)算21 d 和28 d 不同材料的病情指數(shù)，在兩個(gè)時(shí)期與Col-0 相比，35S∷PBRA_000499 的病情指數(shù)較高（圖6）. 綜合表型統(tǒng)計(jì)和病情指數(shù)結(jié)果來(lái)看，35S∷PBRA_000499 擬南芥對(duì)根腫病抗性較弱，更易感.

4 討論

效應(yīng)分子在病原菌與寄主互作的過(guò)程中發(fā)揮了重要功能. 生物營(yíng)養(yǎng)型病原菌，如玉米黑粉菌、小麥條形柄銹菌等，分泌效應(yīng)物抑制寄主免疫力，同時(shí)最大程度地減少對(duì)宿主細(xì)胞的損傷，以便病原菌可以在活細(xì)胞中繁殖［26， 27］. 死體營(yíng)養(yǎng)型病原菌在大多數(shù)情況下分泌效應(yīng)物誘導(dǎo)宿主細(xì)胞壞死，便于它們?cè)谒劳鼋M織上增殖，例如灰霉菌和小麥葉斑病菌［26， 28］. 而像稻瘟病菌和禾谷鐮孢菌這樣的半生物營(yíng)養(yǎng)型病原菌則采取多種功能效應(yīng)子組合的方式，在生物營(yíng)養(yǎng)階段抑制寄主先天免疫，在壞死期引發(fā)非特異性細(xì)胞死亡［27， 28］. 關(guān)于病原菌效應(yīng)物與寄主體內(nèi)蛋白互作的研究越來(lái)越多，已經(jīng)成為探究各類病原菌致病機(jī)制的一個(gè)重要方向. 因此，研究鑒定根腫菌的效應(yīng)蛋白功能具有重要的科學(xué)意義. 本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)PBRA_000499 可以抑制BAX、INF1 誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞程序性死亡，表明PBRA_000499 可以抑制煙草的免疫反應(yīng)，推測(cè)PBRA_000499 可能幫助BAX、INF1 逃避了植物的免疫監(jiān)控，沒(méi)有被植物的免疫系統(tǒng)識(shí)別，因此煙草葉片上并沒(méi)有表現(xiàn)出細(xì)胞死亡癥狀.

病原菌效應(yīng)子按其發(fā)揮功能所在的空間位置，分為質(zhì)外體效應(yīng)分子和胞內(nèi)效應(yīng)分子；細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)物還通過(guò)與質(zhì)膜上的不同細(xì)胞成分相互作用靶向植物免疫系統(tǒng)和代謝途徑，細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器，包括葉綠體和線粒體［29-31］，干擾受體介導(dǎo)的防御信號(hào)傳導(dǎo)和植物激素信號(hào)傳導(dǎo)，改變基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，甚至調(diào)節(jié)RNA 干擾、降解和選擇性剪接［32］. 大麥白粉病分泌蛋白CSEP0105作為一種胞質(zhì)效應(yīng)蛋白靶向胞質(zhì)溶膠中的小熱休克蛋白并抑制其伴侶活性以促進(jìn)毒力［33］. 為了確定效應(yīng)蛋白PBRA_000499 分泌進(jìn)入宿主細(xì)胞后的作用位置進(jìn)行了亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示PBRA_000499 在細(xì)胞質(zhì)中，所以PBRA_000499 可能是根腫菌分泌的一種胞質(zhì)效應(yīng)蛋白.

一部分效應(yīng)蛋白可以發(fā)揮自身毒性功能，以不同的方式抑制寄主免疫反應(yīng)，降低寄主的抗病性. 研究發(fā)現(xiàn)條銹菌分泌的PgtSR1 改變了參與寄主防御過(guò)程的sRNA 豐度，促進(jìn)對(duì)多種病原體的易感性，并抑制了部分抗性基因介導(dǎo)的多種防御反應(yīng)［12］. 條銹菌分泌的PstGSRE1 與ROS 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子TaLOL2 相互作用并干擾TaLOL2 的核定位，從而抑制了ROS 爆發(fā)和寄主的抗病能力［34］.大豆疫霉菌分泌的Avr1b 可以抑制BAX 誘導(dǎo)的程序性細(xì)胞死亡，異源表達(dá)該效應(yīng)子后寄主的抗病能力降低［35］. 此外，還有一類效應(yīng)蛋白可以被寄主識(shí)別并激活免疫反應(yīng)，這類效應(yīng)蛋白也被稱為無(wú)毒效應(yīng)子，如曲霉中的酶活性RNase 效應(yīng)子Zt6 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［36］；大豆疫霉菌分泌的XEG1 觸發(fā)寄主細(xì)胞死亡等防御反應(yīng)［37］，稻瘟病菌候選效應(yīng)蛋白MoCDIE2 能誘導(dǎo)非寄主植物細(xì)胞死亡［38］. 我們構(gòu)建了PBRA_000499 轉(zhuǎn)基因擬南芥，觀察根腫菌侵染后的表型，病情調(diào)查結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，35S ∷PBRA_000499 轉(zhuǎn)基因擬南芥相比Col-0，感病程度更高. 根腫菌效應(yīng)蛋白PBRA_000499 可能抑制了寄主的免疫反應(yīng)，降低寄主的抗病能力.

綜上所述，本研究認(rèn)為PBRA_000499 可以作為根腫菌分泌的胞質(zhì)效應(yīng)蛋白，通過(guò)調(diào)節(jié)寄主免疫反應(yīng)進(jìn)而調(diào)控根腫病的發(fā)生. 但具體的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究，之后將利用酵母文庫(kù)、雙分子熒光互補(bǔ)、GST-pull down 等方法進(jìn)篩選寄主植物中與PBRA_000499 互作蛋白，探究PBRA_000499 在根腫菌侵染和定殖過(guò)程中發(fā)揮的作用，進(jìn)一步解析根腫菌的致病機(jī)制.