摘要

2021年在河南金銀花Lonicera japonica Thunb.產(chǎn)區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)了一種金銀花葉部病害。本研究采用組織分離法和葉片接種進(jìn)行病原菌分離和致病性測(cè)定，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察和多序列（ITS、EF-1α及β-tubulin）聯(lián)合分析對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并進(jìn)一步就病原菌生物學(xué)特性及其殺菌劑篩選開(kāi)展了研究。結(jié)果表明，引起河南金銀花葉斑病的病原菌為多主棒孢Corynespora cassiicola，代表菌株JYH1的最適生長(zhǎng)培養(yǎng)基為PDA，可利用多種碳源和氮源，菌絲生長(zhǎng)最適溫度為28℃，最適pH為6，全光照條件下菌絲生長(zhǎng)最優(yōu)，菌絲的致死條件為57℃，10 min。室內(nèi)殺菌劑篩選結(jié)果表明，咯菌腈對(duì)菌株JYH1的毒力最強(qiáng)，EC50為0.14 μg/mL;其次為戊唑醇和甲基硫菌靈。研究結(jié)果為金銀花棒孢葉斑病的發(fā)生規(guī)律及防治研究提供了重要參考。

關(guān)鍵詞

金銀花;" 葉斑病;" 多主棒孢;" 生物學(xué)特性;" 殺菌劑

中圖分類號(hào)：

S 435.67

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

DOI：" 10.16688/j.zwbh.2024012

收稿日期：" 20240105""" 修訂日期： "20240327

基金項(xiàng)目：

國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-21）；河南省中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（HARS-22-11-Z1）；河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院新興學(xué)科發(fā)展專項(xiàng)（2024XK06）

致" 謝：" 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

* 通信作者

E-mail：

秦艷紅qinyanhong6040@163.com；王飛yunfeiren@163.com

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為并列第一作者

Identification and biological characteristics of pathogen causing leaf spot disease of Lonicera japonica in Henan province， and laboratory fungicide screening

LI Xuemeng，" LI Shaojian，" YANG Jin，" GAO Suxia，" WEN Yi，" QIN Yanhong*，LIU Yuxia，" LU Chuantao，" WANG Fei*

（Institute of Plant Protection， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou" 450002， China）

Abstract

In 2021， a new leaf spot disease on Lonicera japonica Thumb. was observed in Henan province. In this study， the pathogen was isolated and purified by conventional tissue isolation， and a pathogenicity test was carried out through leaf inoculation. The pathogen was identified by morphological observation and multi-sequence analysis （ITS， EF-1α and β-tubulin）. The biological characteristics and fungicides for its control were further studied. The results indicated that the pathogen causing leaf spot of L.japonica was Corynespora cassiicola. The most suitable mycelial growth medium for the virulent isolate JYH1 was PDA， and the isolate could utilize a variety of carbon and nitrogen sources. The optimum growth temperature was 28℃， and the optimum pH was six. Full light was more favorable for mycelium growth. The lethal condition for mycelia was 57℃ for 10 min. The results of laboratory fungicide screening showed that fludioxonil had the strongest toxicity against isolate JYH1， with EC50 values of 0.14 μg/mL， followed by tebuconazole and thiophanate-methyl. These results could provide an important reference for research on occurrence regularity and control method of leaf spot disease on Lonicera japonica.

Key words

Lonicera japonica;" leaf spot disease;" Corynespora cassiicola;" biological characteristics;" fungicide

金銀花Lonicera japonica Thunb.隸屬忍冬科Caprifoliaceae忍冬屬Lonicera，俗稱二寶花、雙花、銀花等，以干燥的花蕾或帶初開(kāi)的花入藥，具有清熱解毒、抑菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽和提高免疫等藥理作用［1］，是我國(guó)確定的70種名貴藥材之一［23］，被譽(yù)為“廣譜抗菌素”，在三分之一的中醫(yī)方劑中可用到金銀花，金銀花配伍的中成藥有200余種。河南省金銀花常年種植面積達(dá)2萬(wàn)hm2，干花年產(chǎn)量超1.3萬(wàn)t，約占全國(guó)總產(chǎn)量的45%［4］。然而，多種病害如白粉病［5］、褐斑病［6］、葉斑?。?］和根腐?。?］等的發(fā)生嚴(yán)重影響了金銀花的產(chǎn)量和品質(zhì)，極大制約了金銀花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。其中，多主棒孢引起的葉斑病于2016年在四川被首次發(fā)現(xiàn)［7］，2020年我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)也報(bào)道了該病的發(fā)生［9］，該病田間癥狀表現(xiàn)為初期病斑呈褐色小點(diǎn)，逐漸發(fā)展成圓形或不規(guī)則的斑點(diǎn)，邊緣病健交界處呈淡黃色。2021年在對(duì)河南省金銀花產(chǎn)區(qū)進(jìn)行病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)，金銀花葉斑病在各大產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍，田間病情指數(shù)高達(dá)13.57，發(fā)病率可達(dá)80%以上，為精準(zhǔn)防治該病害，本研究對(duì)河南省金銀花產(chǎn)區(qū)采集的葉斑病樣品進(jìn)行了病原菌分離純化、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并進(jìn)一步開(kāi)展了病原菌生物學(xué)特性和殺菌劑篩選研究，旨在為金銀花葉斑病防治提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1" 材料與方法

1.1" 田間病害樣品采集與病原菌分離純化

2021年8月-9月于河南淅川縣、澠池縣和禹州市金銀花種植基地采集葉斑病樣品，采用組織分離法［10］進(jìn)行病原菌分離純化。發(fā)病葉片經(jīng)無(wú)菌水沖洗3次，晾干后于病健交界處剪取5 mm×5 mm大小的組織塊，依次用75%乙醇消毒30 s，5%次氯酸鈉消毒1 min，無(wú)菌水沖洗3次，放置于無(wú)菌濾紙上吸干水分，接種在含有硫酸鏈霉素（50 mg/L）的PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）平板上，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，從菌落邊緣挑取單菌絲純化2～3次后將菌株保存于25%甘油中，-80℃冰箱保存待用。

1.2" 致病性測(cè)定

1.2.1" 離體葉片接種菌塊

選取健康金銀花葉片，無(wú)菌水沖洗3次，放在鋪有吸水紙的托盤(pán)中;從預(yù)先培養(yǎng)好的真菌分離物菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅接種于葉片上，用濕潤(rùn)無(wú)菌脫脂棉包裹葉柄處保濕，每個(gè)真菌分離物接

種9個(gè)葉片，以接種空白PDA瓊脂塊為對(duì)照，將托盤(pán)封上保鮮膜保濕，置于28℃培養(yǎng)箱（光周期L∥D=16 h∥8 h，相對(duì)濕度60%）中恒溫培養(yǎng)5 d，觀察記錄侵染發(fā)病情況。

1.2.2" 離體葉片接種孢子懸浮液

將分離菌株接種于PDA平板上，待長(zhǎng)滿平板后加入滅菌水沖洗收集孢子，制成1×106個(gè)/mL的分生孢子懸浮液;選取健康金銀花葉片，無(wú)菌水沖洗3次晾干待用，將孢子液噴灑于金銀花葉片上，葉片放在鋪有吸水紙的托盤(pán)中，封上保鮮膜保濕。每處理接種9個(gè)葉片，以接種等體積的無(wú)菌水做對(duì)照，28℃培養(yǎng)10 d，觀察記錄侵染發(fā)病情況。

1.2.3" 盆栽金銀花接種孢子懸浮液

分生孢子懸浮液制備方法同1.2.2。將金銀花枝條扦插于花盆中培養(yǎng)90 d，待長(zhǎng)出新鮮葉片后，將濃度為1×106個(gè)/mL的孢子液均勻噴灑于金銀花葉片上，每處理接種6片，以接種等體積的無(wú)菌水為對(duì)照。接種后套袋保濕，28℃培養(yǎng)10 d，觀察記錄侵染發(fā)病情況。

1.3" 病原菌鑒定

1.3.1" 形態(tài)學(xué)鑒定

選擇致病性最強(qiáng)的菌株進(jìn)行鑒定。將

菌株接種于直徑9 cm的PDA平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，觀察記錄菌落培養(yǎng)性狀，光學(xué)顯微鏡下觀察記錄分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)、大小及色澤特征，并參照《植物病原真菌屬分類圖索》［11］對(duì)金銀花葉斑病病原菌的種類進(jìn)行初步鑒定。

1.3.2" 分子生物學(xué)鑒定

采用CTAB法［12］提取菌株的基因組DNA，分別利用真菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物（ITS1/ITS4）、翻譯延長(zhǎng)因子基因特異引物（EF728F/EF986R）和微管蛋白基因特異引物（Bt2a/Bt2b）（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增［13］。擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序后，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）中進(jìn)行同源性分析。下載同屬真菌對(duì)應(yīng)基因的序列，應(yīng)用Geneious Prime對(duì)菌株的rDNA-ITS、EF-1α和β-tubulin基因序列串聯(lián)，用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，系統(tǒng)樹(shù)各分支置信度（bootstrap）均進(jìn)行1 000次的重復(fù)檢驗(yàn)。

1.4" 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.4.1" 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）、馬鈴薯胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（PCA）、胡蘿卜瓊脂培養(yǎng)基（CA）、燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）、玉米粉瓊脂培養(yǎng)基（CMA）和水瓊脂培養(yǎng)基（WA）等7種供試培養(yǎng)基。用打孔器在活化好的病原菌菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，分別接種于上述7種培養(yǎng)基中央，每處理重復(fù)3次。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.2" 碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

用等質(zhì)量的乳糖、果糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖醇、D-甘露醇和可溶性淀粉替代查氏培養(yǎng)基中的蔗糖作為碳源，用等質(zhì)量的胰蛋白胨、牛肉浸粉、甘氨酸、硫酸銨、硝酸鉀和氯化銨替代查氏培養(yǎng)基中的硝酸鈉作為氮源，配成不同碳、氮源的培養(yǎng)基。接種病原菌后，置于28℃培養(yǎng)箱恒溫暗培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.3" 溫度、酸堿度和光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

將菌餅接種于PDA平板上，分別置于溫度為5、10、15、20、25、28、30℃和35℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng);用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液將PDA平板的pH值調(diào)為4、5、6、7、8、9、10和11共8個(gè)梯度，接種菌餅后置于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng);將菌餅接種于PDA平板上，分別置于光暗交替（L∥D=12 h∥12 h）、全黑暗（L∥D=0 h∥24 h）和全光照（L∥D=24 h∥0 h）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng);上述處理均于7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

1.4.4" 菌絲致死溫度的測(cè)定

打取直徑5 mm的菌餅，置于提前預(yù)熱的裝有無(wú)菌水的2 mL離心管中，分別在35、40、45、50、55、60、65℃水浴鍋中各處理10 min，取出后迅速冷卻，將菌餅取出置于PDA平板上于28℃恒溫培養(yǎng)，5 d后觀察有無(wú)菌落生長(zhǎng)。獲得菌絲致死溫度范圍后，以1℃溫度差設(shè)置溫度梯度，明確菌絲的致死溫度。每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.5" 室內(nèi)殺菌劑篩選

采用菌絲生長(zhǎng)速率法［14］測(cè)定殺菌劑對(duì)金銀花葉斑病菌的毒力，選擇6種常用化學(xué)殺菌劑原藥： 97%戊唑醇、70%甲基硫菌靈、96%嘧菌酯、80%代森錳鋅、98%咯菌腈和95%噻呋酰胺。將預(yù)先配制好的藥劑母液用無(wú)菌水稀釋后，各濃度藥液與PDA培養(yǎng)基以1∶9（V/V）的體積比混勻，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果制成含不同終濃度藥劑的平板（表2）。從預(yù)先培養(yǎng)的病原菌菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，接種到含藥平板上，28℃暗培養(yǎng)，以不加藥劑的PDA平板為陰性對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。待對(duì)照培養(yǎng)基上病原菌長(zhǎng)滿平板時(shí)（直徑9 cm），測(cè)量所有處理菌落直徑，計(jì)算各殺菌劑的抑菌率。

抑菌率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-5）×100%。

分析各藥劑濃度對(duì)數(shù)值（x）和對(duì)應(yīng)菌絲生長(zhǎng)抑菌率的幾率值（y），根據(jù)不同殺菌劑對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的毒力回歸方程y=a+bx，計(jì)算各供試藥劑對(duì)病原菌的抑制中濃度EC50。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 田間病害樣品采集與病原菌分離純化

金銀花葉斑病5月中下旬零星發(fā)生，7月份隨雨季到來(lái)發(fā)生趨重，8月-9月為發(fā)病盛期;一般先由下部葉片開(kāi)始發(fā)病，逐漸向上發(fā)展，高溫、多雨、潮濕條件有利于發(fā)病，植株生長(zhǎng)衰弱時(shí)發(fā)生嚴(yán)重;發(fā)病初期在葉片上呈現(xiàn)暗褐色小點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大呈圓形或橢圓形病斑，病斑邊緣黑褐色，中央黑色，病斑邊緣具明顯黃色暈圈;發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，數(shù)個(gè)病斑擴(kuò)展聯(lián)合成片，造成葉片組織變脆干枯，提早落葉（圖1）。從3個(gè)金銀花種植基地采集的葉斑病9個(gè)樣品上共計(jì)分離純化出80株真菌，形態(tài)學(xué)初步鑒定為棒孢屬真菌26株（JYH1～JYH26），鏈格孢屬真菌24株（JYH27～JYH50），鐮刀屬真菌19株（JYH51～JYH69），炭疽菌屬真菌11株（YH70～JYH80）。選取代表性菌株JYH1、JYH10、JYH17、JYH27、JYH51和JYH70

進(jìn)行致病性測(cè)定。

2.2" 致病性測(cè)定

2.2.1" 離體葉片接種菌餅

利用病原菌菌餅分別接種金銀花離體葉片，接

種3 d后，病斑從接種部位輻射狀向四周擴(kuò)展，接種

5 d后病斑即擴(kuò)散至葉片邊緣位置，菌株JYH1、

JYH10、JYH17發(fā)病率依次分別為100%、83.33%和66.67%（圖2b～d），對(duì)照未發(fā)?。▓D2a），菌株JYH27、JYH51和JYH70未發(fā)病。以致病力最強(qiáng)的菌株JYH1進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2.2" 離體葉片接種孢子懸浮液

金銀花離體葉片接種菌株JYH1孢子懸浮液5 d

后，葉片上出現(xiàn)深褐色小點(diǎn)開(kāi)始發(fā)病，接種10 d后逐漸擴(kuò)大為圓形或橢圓形病斑，病斑周圍產(chǎn)生黃色

暈圈（圖2f）;對(duì)照未發(fā)病（圖2e）。

2.2.3" 活體葉片接種孢子懸浮液

金銀花活體葉片接種菌株JYH1孢子懸浮液5 d后，金銀花葉片上開(kāi)始發(fā)病出現(xiàn)深褐色小點(diǎn)，接種10 d后逐漸擴(kuò)大為圓形或橢圓形病斑，邊緣有明顯的黃色暈圈，且病斑處葉片組織變脆，與田間葉斑病癥狀相似（圖2h）。對(duì)照組金銀花生長(zhǎng)正常，葉片無(wú)病斑（圖2g）。

從發(fā)病部位進(jìn)行病原菌再分離，可分離到與JYH1形態(tài)特征完全一致的病原菌，完成金銀花葉斑病的柯赫氏法則驗(yàn)證，確定菌株JYH1為金銀花葉斑病的病原菌。

2.3" 病原菌鑒定

2.3.1" 形態(tài)學(xué)鑒定

菌株JYH1在PDA平板上培養(yǎng)6 d，菌落圓形，邊緣整齊，菌絲灰褐色，呈絨毛狀（圖3a）。顯微鏡下觀察菌絲呈透明或半透明，有橫隔;分生孢子梗直、長(zhǎng)，著生于菌絲頂端，無(wú)分枝（圖3b）。分生孢子圓柱狀或倒棍棒狀，直或稍彎曲，頂端鈍圓，具0～7個(gè)隔膜，單生或串生，大小為（11.23～127.23）μm×（3.81～10.73）μm（圖3c）。依據(jù)菌落及分生孢子形態(tài)特征將菌株JYH1鑒定為棒孢屬真菌。

2.3.2" 分子生物學(xué)鑒定

利用ITS、EF-1α和β-tubulin引物對(duì)菌株JYH1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，菌株JYH1的ITS序列與已報(bào)道的多主棒孢Corynespora cassiicola一致性在99%以上，其EF-1α序列與C.cassiicola一致性為97%以上，β-tubulin序列與C.cassiicola一致性為98%以上，將上述所測(cè)序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)分別為：OR750480、OR734784、OR734785。選取分離自辣椒Capsicum annuum、茄子Solanum melongena、番茄S.lycopersicum、煙草Nicotiana tabacum、黃瓜Cucumis sativus、金葉女貞Ligustrum × vicaryi和草莓Fragaria × ananassa的C.cassiicola菌株，與金銀花葉斑病菌菌株JYH1進(jìn)行多序列聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示來(lái)自8個(gè)寄主植物上的多主棒孢菌株形成6個(gè)分支，分離自同一寄主植物的病原菌以較高的置信度聚在一支，其中菌株JYH1在進(jìn)化關(guān)系上與黃瓜植株上分離的C.cassiicola菌株親緣關(guān)系最近（圖4）。結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定將菌株JYH1鑒定為Corynespora cassiicola。

2.4" 病原菌生物學(xué)特性

2.4.1" 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

病原菌菌株JYH1在供試7種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d菌落直徑（圖5）從大到小依次為PDA（7.07 cm）gt;OMA（7.05 cm）gt;PSA（6.85 cm）gt;PCA（6.73 cm）gt;CA（5.60 cm）gt;CMA（5.18 cm）gt;WA（5.12 cm），菌株JYH1的最適培養(yǎng)基為PDA，菌絲生長(zhǎng)最致密;其次為OMA培養(yǎng)基，菌絲生長(zhǎng)密，稍厚;在CMA和WA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度最慢，且菌絲稀疏。

2.4.2" 碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

菌株JYH1在供試8種碳源和7種氮源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，但對(duì)不同碳、氮源的利用程度不同。其在以D-甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，培養(yǎng)7 d菌落直徑最大，為7.47 cm;其次是以蔗糖、葡萄糖和木糖醇為碳源的培養(yǎng)基上，菌落生長(zhǎng)較快，直徑

依次為7.38、7.32 cm和7.22 cm;以果糖為碳源的培養(yǎng)基上菌落

直徑最小，為5.83 cm（圖6a）。不同氮源中，菌株JYH1在以胰蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，

菌落直徑大于以硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基，且菌絲旺盛;在以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑最小，為6.05 cm（圖6b）。

2.4.3" 溫度、酸堿度和光照條件對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

病原菌菌株JYH1在5～35℃均能生長(zhǎng)，5～10℃低溫生長(zhǎng)速度緩慢，當(dāng)溫度為25～30℃時(shí)，較適宜菌絲生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d菌落直徑顯著大于其他溫度下的菌落直徑。最適生長(zhǎng)溫度是28℃，菌落直徑最大，為7.07 cm（圖7a）。病原菌JYH1在pH 4～11間均能生長(zhǎng)，且在pH為6時(shí)生長(zhǎng)最好（圖7b）。病

原菌JYH1在光暗交替、全光照和全黑暗下均能良好生長(zhǎng)，培養(yǎng)7 d時(shí)全光照與全黑暗條件下菌落直徑和菌落生長(zhǎng)速率差異不顯著，顯著高于光暗交替下的菌落直徑和菌落生長(zhǎng)速率（表3）。

2.4.4" 病原菌菌絲致死溫度

將分別在35～65℃的恒溫水浴鍋內(nèi)處理10 min的菌餅接種在PDA平板上，置于28℃下黑暗培養(yǎng)5 d后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)35～55℃處理后，菌絲能夠生長(zhǎng)且能夠形成新的菌落，而在60℃及以上條件下菌絲不生長(zhǎng)。進(jìn)一步以1℃為梯度設(shè)置5個(gè)溫度處理，發(fā)現(xiàn)56℃處理10 min后能形成新的菌落，57℃及以上條件下處理后不能形成新菌落。說(shuō)明病原菌JYH1菌絲在57℃下，持續(xù)處理10 min會(huì)完全死亡。

2.5" 室內(nèi)殺菌劑篩選

室內(nèi)殺菌劑篩選結(jié)果表明，供試的6種化學(xué)殺菌劑對(duì)金銀花葉斑病病原菌的毒力大小順序?yàn)椋嚎┚妫疚爝虼迹炯谆蚓`＞噻呋酰胺＞嘧菌酯＞代森錳鋅。其中，咯菌腈對(duì)病原菌菌株JYH1的毒力最強(qiáng)，EC50為0.14 μg/mL;其次為戊唑醇和甲基硫菌靈，EC50分別為0.375 μg/mL和7.193 μg/mL;代森錳鋅的毒力最低，EC50為34.778 μg/mL（表4）。

3" 結(jié)論與討論

金銀花作為我國(guó)傳統(tǒng)的大宗藥材，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其病害的報(bào)道相對(duì)較少。本研究首次報(bào)道了引起河南省金銀花葉斑病的病原菌為多主棒孢C.cassiicola，該葉斑病的癥狀表現(xiàn)為發(fā)病初期在葉片上呈現(xiàn)暗褐色小點(diǎn)，后逐漸擴(kuò)大呈圓形或橢圓形病斑，病斑邊緣黑褐色，中央黑色，病斑邊緣具明顯黃色暈圈;發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，數(shù)個(gè)病斑擴(kuò)展聯(lián)合成片，造成葉片組織變脆干枯，提早落葉。不同于金銀花炭疽病可出現(xiàn)層紋形狀，后期葉片表面或散生黑色小點(diǎn)［15］;也區(qū)別于多喙莖點(diǎn)霉Phoma multirostrata引起的忍冬褐斑病在高濕環(huán)境時(shí)葉片會(huì)產(chǎn)生灰黑色霉?fàn)钗?，?dǎo)致葉片破碎，穿孔［16］。

多主棒孢是一種寄主范圍廣泛的植物病原真菌，已被報(bào)道可引起大戟科、茄科、葫蘆科、芝麻科、唇形科等多種寄主作物的葉斑?。?721］;Huang等［7］和Chang等［9］曾先后報(bào)道了四川和臺(tái)灣地區(qū)由C.cassiicola引起的金銀花葉斑病。薛制國(guó)等［22］的研究發(fā)現(xiàn)分離自冀東地區(qū)旱黃瓜上的多主棒孢存在培養(yǎng)性狀多樣性，供試菌株在菌落顏色、氣生菌絲致密程度上均表現(xiàn)出差異，本研究中菌株JYH1的菌落形態(tài)特征與旱黃瓜上的棒孢菌BBCL20052502相似，且兩個(gè)菌株的生長(zhǎng)最適培養(yǎng)基均為PDA。Dixon等［23］針對(duì)采集自不同寄主植物的多主棒孢C.cassiicola的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，該病原菌存在豐富的種內(nèi)遺傳多樣性，且表現(xiàn)出一定程度的寄主特異性?；诙嘈蛄新?lián)合分析，本研究選取分離自不同寄主植物的多主棒孢菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示所有棒孢菌株可分為6個(gè)分支，且來(lái)自同一寄主植物的分離物以較高的置信度聚在一支，其中菌株JYH1與黃瓜上分離的C.cassiicola菌株聚在一支，表明金銀花與黃瓜上分離的C.cassiicola菌株親緣關(guān)系最近。高葦?shù)鹊难芯勘砻鱽?lái)自黃瓜、番茄及茄子的多主棒孢菌株，其寄主來(lái)源與致病力分化之間具有顯著相關(guān)性，從而證明多主棒孢種內(nèi)存在寄主?；蕴卣鳎?4］，本研究中菌株JYH1是否可侵染其他寄主植物即是否具有寄主?；蕴卣鬟€有待后續(xù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究中多主棒孢菌株JYH1可利用多種碳源和氮源，最適碳源和氮源分別為D-甘露醇和胰蛋白胨，這與已報(bào)道的分離自其他寄主植物的多主棒孢菌株不盡相同，如張笛等［25］報(bào)道的分離自黑龍江黃瓜上的多主棒孢最適碳源同為D-甘露醇，最適氮源為甘氨酸；王樹(shù)和等［26］報(bào)道的分離自洛陽(yáng)金葉女貞上的多主棒孢最適碳源為麥芽糖，最適氮源為蛋白胨，說(shuō)明分離自不同寄主植物的多主棒孢菌株利用碳、氮源的種類和能力均存在差異，這可能與其寄主來(lái)源和環(huán)境差異有關(guān)。另外，由于不同報(bào)道間所選取試驗(yàn)用碳、氮源種類存在差異，分離自不同寄主植物的多主棒孢菌株利用碳、氮源的能力和種類差異還需要進(jìn)一步深入研究。多主棒孢JYH1的適宜生長(zhǎng)溫度范圍為25～30℃，最適溫度是28℃，全光照有利于其菌絲生長(zhǎng)，與孫會(huì)杰等［27］報(bào)道的芝麻多主棒孢根腐病菌的結(jié)果一致，與本研究團(tuán)隊(duì)前期調(diào)查田間金銀花葉斑病病情結(jié)果相吻合，高溫高濕可加重該病害的流行。多主棒孢JYH1的最適培養(yǎng)基為PDA，對(duì)酸堿度反應(yīng)不敏感，酸性和堿性條件下都能生長(zhǎng)，但pH為6時(shí)菌落直徑最大，這與河南省草莓棒孢葉斑病病原菌的研究結(jié)果相似［28］。該菌株菌絲57℃、10 min完全死亡，表明菌絲對(duì)溫度有較強(qiáng)耐受力。

本研究中篩選出來(lái)的對(duì)金銀花葉斑病菌毒力最強(qiáng)的殺菌劑為咯菌腈（EC50為0.14 mg/L），孫圣楠［29］對(duì)煙草棒孢葉斑病菌進(jìn)行了殺菌劑室內(nèi)篩選研究，雖然所選用藥劑種類與本研究不盡相同，但咯菌腈EC50（0.108 9 mg/L）及其抑制效果優(yōu)于其他11種殺菌劑的結(jié)果與本研究一致;而本研究中代森錳鋅對(duì)金銀花葉斑病菌的毒力最弱（EC50為34.778 mg/L），與李晗［30］在測(cè)定重慶煙草棒孢葉斑病菌對(duì)10種殺菌劑的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn)代森錳鋅的毒力大?。‥C50為1.940 mg/L）差別較大。因此，針對(duì)不同寄主來(lái)源的病原菌甚至同一寄主的不同病原菌菌株都有必要開(kāi)展針對(duì)性的殺菌劑篩選工作，以更好保證科學(xué)的精準(zhǔn)防控。本研究中篩選毒力最強(qiáng)的藥劑咯菌腈是基于室內(nèi)的平板篩選，其對(duì)金銀花棒孢葉斑病的田間防治效果如何還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)特征與多序列聯(lián)合分析相結(jié)合，鑒定出河南省金銀花葉斑病病菌為多主棒孢，并對(duì)其開(kāi)展了生物學(xué)特性和殺菌劑篩選研究，研究結(jié)果可為金銀花葉斑病的診斷以及田間化學(xué)用藥的合理選用提供重要依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）