關(guān)鍵詞：單克隆抗體；聚集；斷裂；脫酰胺；氧化

聚集和斷裂被認(rèn)為是評估蛋白類藥物純度和完整性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性[1-2]，它們會(huì)減弱蛋白質(zhì)的生物活性，并影響藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)特性和免疫原性[3-5]。聚集和斷裂是抗體藥物中常見的現(xiàn)象，許多因素會(huì)影響其聚集和斷裂。因此，對抗體藥物的聚集和斷裂行為進(jìn)行檢測和分析，在抗體藥物的開發(fā)、生產(chǎn)和儲存過程中具有重要意義。

翻譯后修飾（Post-TranslationalModifications，PTMs）在蛋白質(zhì)加工和成熟中起著關(guān)鍵作用，它們可以改變蛋白質(zhì)的物理和化學(xué)性質(zhì)，并影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象、疏水性和穩(wěn)定性[6]。一些非理想的PTMs，如氧化和脫酰胺修飾，在抗體藥物的發(fā)酵、純化、制備和儲存過程中很容易發(fā)生，其對產(chǎn)品的質(zhì)量和功能產(chǎn)生很多負(fù)面影響[7-8]。甲硫氨酸（Met）和色氨酸（Trp）殘基的氧化會(huì)導(dǎo)致抗體藥物結(jié)構(gòu)完整性、構(gòu)象穩(wěn)定性、安全性的變化[9]。研究表明，單克隆抗體（Monoclonalantibodies，mAbs）的Fc區(qū)和互補(bǔ)決定區(qū)（ComplementarityDeterminingRegion，CDR）中Met或Trp殘基的氧化會(huì)導(dǎo)致分子空間占用增加和穩(wěn)定性下降，從而引起聚集和斷裂的發(fā)生[10-11]。天冬酰胺（Asn）的脫酰胺是生物制藥生產(chǎn)和儲存中最常見、最難控制的PTMs之一，它會(huì)改變蛋白質(zhì)的親水性和表面電荷分布，造成折疊結(jié)構(gòu)的變化和疏水殘基的暴露，從而影響抗體的聚集行為[12-13]。此外，CDR的脫酰胺可能引起抗體-抗原相互作用，導(dǎo)致免疫原性問題[14]。

尺寸排阻色譜法（SizeExclusionChromatography，SEC）為生物制藥工業(yè)檢測藥物中聚體和碎片的常用方法，其原理是根據(jù)分子大小和形狀分離樣品。盡管SEC廣泛應(yīng)用于抗體藥物分子大小變異體的定量分析，但它仍然存在部分局限性。首先，SEC在分析過程中存在蛋白質(zhì)和色譜柱之間的非特異性相互作用[15]；其次，SEC分析過程中不可避免地涉及樣品的稀釋，這可能會(huì)使弱可逆相互作用形成的聚體解離而形成單體[16]；最后，較大的聚體也可能在色譜過程中被過濾掉[17]。

目前美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）要求使用正交方法來分析抗體藥物的分子大小變異體，用以彌補(bǔ)當(dāng)前SEC的局限性，從而對抗體藥物進(jìn)行更全面的分析[18]。分析型超速離心法（Analyticalultracentrifugation，AUC）是分析溶液中大分子的一種通用方法，它廣泛用于抗體藥物聚集的表征分析[19]、制劑篩選[20]、批次一致性分析[21]、可逆相互作用分析[22]以及小分子和治療蛋白篩選[23]等。沉降速率（SedimentationVelocity，SV）模式在高離心力場下測量樣品的不同SV來確定樣品的組成，基于樣品中不同組分的分子質(zhì)量和形狀差異，可以形成一個(gè)獨(dú)特的邊界，并以特有的速度沉降，它可以在不受溶劑或基質(zhì)干擾的條件下測定蛋白質(zhì)的分子量、純度、聚集狀態(tài)和分子相互作用，以獲得最接近自然條件的樣品組成[24-25]?？傊?，AUC中SV分析模式（AUC-SV）在表征抗體藥物方面比SEC具有顯著優(yōu)勢。

本文旨在通過SEC、AUC的聯(lián)用，對兩種處于研發(fā)階段的新型mAbs（ZG154和ZG187）在加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（40℃）中產(chǎn)生的聚集與斷裂現(xiàn)象進(jìn)行正交檢測分析，并且利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LCMS）、圓二色光譜（CircularDichroism，CD）、動(dòng)態(tài)光散射和示差掃描熒光技術(shù)等從多個(gè)方面探究造成ZG154和ZG187產(chǎn)生分子大小變異體的原因。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)原料

本研究使用的ZG154和ZG187抗體屬于IgG1類，由上海臻格生物技術(shù)有限公司提供，樣品通過標(biāo)準(zhǔn)色譜過程進(jìn)行純化，在40℃的培養(yǎng)箱中避光放置。氯化鈉（NaCl）、二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二硫蘇糖醇（DTT）、碘代乙酰胺（IAM）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、鹽酸胍、尿素，美國Sigma-aldrich公司；胰蛋白酶（Trypsin），普洛麥格生物技術(shù)有限公司；乙腈（ACN）、超純水和甲酸（FA），美國賽默飛世爾科技公司。所有試劑均為分析純，未經(jīng)純化直接使用。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1SEC測定分子大小變異體純度 采用Agilent1260型液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）進(jìn)行分析：樣品用流動(dòng)相稀釋至2mg/mL后進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為30μL，使用TSKgelG3000SWXL凝膠色譜柱（7.8mm×300mm×5μm）；流動(dòng)相為50mmol/LNaH2PO4，300mmol/LNaCl，pH7.0；流速為0.5mL/min，等度洗脫，洗脫時(shí)間為35min，柱溫箱溫度為25℃，紫外檢測波長為280nm。

1.2.2AUC測定分子大小變異體純度 對樣品ZG154和ZG187（質(zhì)量濃度2mg/mL）進(jìn)行SV分析。在20℃下平衡2h后，使用An-60Ti型轉(zhuǎn)子在OptimaAUC型離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）中以40000r/min和20℃條件下分析。吸收光學(xué)系統(tǒng)在280nm的波長條件下以120s的間隔掃描260次。數(shù)據(jù)分析使用軟件SEDFIT15.01b，分布模型使用Continuousc（s），分析置信水平（F-ratio）為0.68。ZG154的溶劑密度設(shè)定為1.0097g/mL，溶劑黏度為1.069mPa·s；ZG187的溶劑密度為1.0287g/mL，溶液黏度為1.256mPa·s；SEC流動(dòng)相密度為1.0166g/mL，黏度為1.067mPa·s。

1.2.3蛋白質(zhì)PTMs測定方法 取樣品500μg，加入變性緩沖液（8mol/L鹽酸胍，250mmol/LTris，pH7.5±0.2）188μL、500mmol/LDTT8μL，加超純水使體積至250μL，混勻，37℃水浴30min。待水浴完成后在樣品中加入500mmol/LIAM25μL進(jìn)行烷基化，混勻，室溫避光反應(yīng)30min。隨后使用NAP-5柱對樣品進(jìn)行脫鹽處理。取NAP-5柱收集液100μL加入Trypsin酶（0.5mg/mL）8μL，吹打混勻，37℃水浴4h。水浴完成后加入1μLFA終止反應(yīng)后上樣分析。采用Q-Exactive型液質(zhì)聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾科技公司）進(jìn)行樣品分析，使用電噴霧離子源（ESI）、靜電場軌道離子阱質(zhì)量分析器（Orbitrap），ACQUITYUPLCPeptideBEHC18色譜柱（186003687；1.7μm，2.1×150mm），流動(dòng)相A為FA/H2O（FA體積分?jǐn)?shù)為0.1%），流動(dòng)相B為FA/ACN（FA體積分?jǐn)?shù)0.1%）。采用梯度洗脫模式，90min內(nèi)流動(dòng)相B從2%到40%，流速為0.3mL/min，柱溫為60℃。在正離子模式下分析樣品，并使用BioPharmaFinder4.1進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4蛋白質(zhì)二級與三級結(jié)構(gòu)測定方法 采用ChirascanTMVX型圓二色光譜儀（英國應(yīng)用光物理有限公司）在室溫下對樣品的圓二色性進(jìn)行測定：將樣品稀釋到0.2mg/mL后加入到0.5mm比色皿中進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)測定，將樣品稀釋到5mg/mL后加入到1.0mm比色皿中進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)檢測；遠(yuǎn)紫外光譜測量范圍為190～260nm，近紫外光譜測量范圍為250～340nm，步進(jìn)為1nm，設(shè)置單個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)采樣時(shí)間為1.0s。溶劑圓二色光譜（CD）信號和樣品CD信號重復(fù)測定3次取平均值，減去溶劑CD信號后得到最終結(jié)果。

1.2.5蛋白質(zhì)熔融溫度檢測方法 采用PrometheusNT.PlexDSF型蛋白穩(wěn)定性分析儀（德國諾坦普科技有限公司）對樣品熔解溫度（Tm）進(jìn)行測定：使用毛細(xì)管吸取樣品至完全充盈，且毛細(xì)管中部區(qū)域無明顯氣泡，調(diào)節(jié)熒光激發(fā)強(qiáng)度使樣品的最高峰值在15000處；起始溫度為20℃，終止溫度為95℃，加熱速率為1.0℃/min；通過分析熒光相對于溫度的一階導(dǎo)數(shù)來確定蛋白質(zhì)的Tm。

1.2.6蛋白質(zhì)擴(kuò)散相互作用系數(shù)檢測方法 使用制劑緩沖液將樣品分別稀釋到5、4、3、2、1mg/mL，在11000r/min下離心5min，離心后將樣品加入384孔板中，每個(gè)微孔中加入樣品40μL。使用PlateReaderⅢ型高通量動(dòng)態(tài)光散射儀（美國懷雅特技術(shù)公司）對樣品擴(kuò)散系數(shù)進(jìn)行測定，25℃時(shí)在每秒產(chǎn)生約1×106次計(jì)數(shù)的激光功率下測量10s。每個(gè)樣品平行測定3次，并取平均值，根據(jù)公式（1），計(jì)算出樣品的擴(kuò)散相互作用系數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1SEC分析樣品聚集與斷裂行為

40℃時(shí)樣品聚體和碎片含量變化如圖1所示。由圖1（a）可得，ZG154樣品中高分子量物質(zhì)（HMW）隨放置時(shí)間的延長明顯增加，由峰面積計(jì)算可得，ZG154樣品在初始時(shí)刻（ZG154-T0）、40℃放置一個(gè)月后（ZG154-40℃-1M）和40℃放置兩個(gè)月后（ZG154-40℃-2M）的聚體含量分別為0.4%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、1.1%和2.2%，低分子量物質(zhì)（LMW）含量分別為0.1%、3.4%和5.2%。值得注意的是，ZG154樣品的聚集與斷裂行為在40℃放置下同時(shí)發(fā)生。由圖1（b）可得，在40℃放置一個(gè)月后ZG187樣品（ZG187-40℃-1M）的HMW含量變化可忽略不計(jì)（ZG187-T0樣品為1.3%，ZG187-40℃-1M樣品為1.4%）。然而，在相同的持續(xù)時(shí)間內(nèi)，LMW含量卻從0.2%增加到2.1%，表明ZG187分子在40℃放置下只發(fā)生斷裂行為。上述結(jié)果發(fā)現(xiàn)了兩種mAbs對40℃環(huán)境的反應(yīng)存在差異。因此，AUC-SV的后續(xù)分析對于更全面了解蛋白的聚集和斷裂行為至關(guān)重要。

2.2AUC-SV分析樣品的聚集與斷裂行為

相較于SEC，AUC-SV更有助于對樣品的原生狀態(tài)進(jìn)行表征，測試結(jié)果如圖2所示。由圖可得，ZG154樣品在40℃放置時(shí)不僅聚體含量明顯增加，同時(shí)聚體沉降系數(shù)逐漸降低，特別是在40℃放置過程中二聚體沉降系數(shù)從9.969S下降到9.140S，最終達(dá)到8.675S（圖2（a）、（b）、（c）），這可能是由于ZG154分子的聚集行為發(fā)生了變化，形成聚體的結(jié)構(gòu)不同導(dǎo)致的[26]。ZG187樣品在40℃下放置一個(gè)月后，ZG187樣品的聚體含量幾乎沒有變化，而ZG187-40℃-1M樣品的AUC-SV分析未檢測到任何片段（圖2（e））。將ZG187樣品在SEC流動(dòng)相中測試，如圖2（f）和2（g）所示，發(fā)現(xiàn)ZG187樣品在SEC流動(dòng)相中的沉降系數(shù)分布顯著變寬，同時(shí)ZG187-40℃-1M樣品中出現(xiàn)了相關(guān)碎片峰（圖2（g））。這一現(xiàn)象是由于SEC流動(dòng)相的高鹽濃度會(huì)導(dǎo)致蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化[15]，從而影響ZG187分子的沉降行為和碎片之間的非共價(jià)相互作用。此外，通過AUC-SV測量的ZG154和ZG187的聚體含量都超過了SEC法測定的結(jié)果，該現(xiàn)象是由于SEC分析中使用的流動(dòng)相會(huì)在色譜過程中引起樣品稀釋而導(dǎo)致聚體的解離[18]。

2.3蛋白翻譯后修飾變化

蛋白質(zhì)的PTMs變化通常是導(dǎo)致其發(fā)生聚集和斷裂行為的重要因素，為了更深入地探究ZG154和ZG187抗體在40℃放置過程中表現(xiàn)出不同聚集和斷裂行為的原因，對其PTMs進(jìn)行了分析。如表1所示，在40℃放置1個(gè)月后，ZG154分子重鏈（HeavyChain，HC）上Asn329位點(diǎn)發(fā)生脫酰胺修飾的比例僅增加了17.6%，發(fā)生相對較少的脫酰胺修飾可能不足以說明其對ZG154樣品聚集與斷裂行為的影響，因此對ZG154樣品進(jìn)行了為期2個(gè)月的加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，在40℃放置2個(gè)月后，HC上Asn329位點(diǎn)發(fā)生脫酰胺修飾的比例增加了30.7%。此外，在40℃放置過程中HC上Asn388和Asn393位發(fā)生脫酰胺的比例也有所增加，輕鏈（Lightchain，LC）上天冬氨酸（Asp）155位點(diǎn)以及HC上Asp109和284位點(diǎn)也發(fā)生少量的異構(gòu)化修飾。脫酰胺會(huì)引起蛋白質(zhì)的疏水性變化，許多發(fā)生脫酰胺的抗體藥物更容易產(chǎn)生聚集行為[13，27]。同時(shí)ZG154分子的脫酰胺是在接近中性的條件下發(fā)生（樣品緩沖液pH值為6.8），該反應(yīng)首先形成中間體琥珀酰亞胺，隨后迅速水解為Asp和異天冬氨酸（iso-Asp）[28]，琥珀酰亞胺親水性低于Asn和Asp，從而容易引發(fā)蛋白質(zhì)聚集。此外，琥珀酰亞胺的存在也會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)斷裂[29]。然而對于ZG187樣品的PTMs變化（表2），在40℃放置一個(gè)月后，ZG187分子HC上Met430位點(diǎn)發(fā)生氧化修飾的比例增加了36.9%，Met430位點(diǎn)氧化修飾比例的大量增加足以滿足接下來探究其對ZG187樣品斷裂行為的影響。此外，HC上Met81位點(diǎn)也發(fā)生了少量氧化修飾。Met氧化通常會(huì)導(dǎo)致mAbs的構(gòu)象穩(wěn)定性發(fā)生變化，許多研究均表明Met氧化對mAbs聚集與斷裂有顯著影響，造成抗體分子間形成共價(jià)結(jié)合以及鄰近修飾位點(diǎn)的抗體斷裂，但其對不同mAbs的影響具有特異性[12，30]。

2.4不同修飾對蛋白二級與三級結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的二級與三級結(jié)構(gòu)的變化通常會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水區(qū)域暴露，造成蛋白質(zhì)聚集行為的發(fā)生。CD通過蛋白質(zhì)對左右圓偏振光的吸收差來分析溶液中蛋白質(zhì)的二級與三級結(jié)構(gòu)。有研究表明，Asn脫酰胺的主要產(chǎn)物iso-Asp，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)局部結(jié)構(gòu)更靈活，從而暴露埋藏在蛋白質(zhì)中的疏水殘基，致使蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生輕微變化[27]。而氧化修飾通常會(huì)影響mAbs的CH2結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，從而改變mAbs的二級與三級結(jié)構(gòu)，但其取決于蛋白質(zhì)的糖基化狀態(tài)[31]。相較于因發(fā)生脫酰胺或氧化修飾導(dǎo)致二級與三級結(jié)構(gòu)的變化的抗體藥物，在本研究中40℃條件下放置前后的ZG154和ZG187樣品的CD圖譜沒有發(fā)生明顯變化（圖3），說明ZG154分子Asn329位點(diǎn)的脫酰胺修飾和ZG187分子Met430位點(diǎn)發(fā)生的氧化修飾沒有導(dǎo)致分子二級和三級結(jié)構(gòu)的變化。ZG154和ZG187分子的N-糖基化修飾在40℃放置過程中也基本沒有發(fā)生變化，其對蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定維持起著重要的作用，表明ZG154和ZG187分子在40℃放置中發(fā)生的聚集與斷裂行為不是由于蛋白二級和三級結(jié)構(gòu)變化引起的。

2.5不同修飾對蛋白穩(wěn)定性的影響

Tm是衡量蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)，mAbs的不同結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)不同的Tm，一般Tm值越高，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性越好。脫酰胺和氧化修飾可能通過破壞蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)定性來加速蛋白質(zhì)聚集和斷裂[14，27]。結(jié)果表明，在40℃放置后，ZG154分子的各個(gè)結(jié)構(gòu)域Tm值基本沒有發(fā)生變化（圖4（a）），然而ZG187分子的Tm1卻顯著下降（ZG187-T0樣品Tm1為66.3℃，ZG187-40℃-1M樣品Tm1為58.6℃），Tm2未發(fā)生明顯變化。這些結(jié)果表明ZG154分子在40℃放置時(shí)發(fā)生的聚集和斷裂行為不取決于結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性的變化，進(jìn)一步證明其斷裂行為的發(fā)生與琥珀酰亞胺的形成有關(guān)。相反，ZG187分子在Met430位點(diǎn)發(fā)生的氧化修飾會(huì)顯著降低ZG187分子單個(gè)結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性，造成ZG187分子斷裂行為的發(fā)生。

2.6不同修飾對蛋白分子間相互作用的影響

kD是描述溶液中溶質(zhì)分子之間相互作用力的一個(gè)度量，蛋白質(zhì)的聚集行為通常是由于蛋白質(zhì)分子間相互吸引的作用所引起的。如圖5所示，根據(jù)式（1）計(jì)算出ZG154-T0、ZG154-40℃-1M和ZG154-40℃-2M樣品的kD值分別為?1.34×10?2、?1.51×10?2mL/mg和?1.72×10?2mL/mg；ZG187-T0和ZG187-40℃-1M樣品的kD值分別為2.36×10?2mL/mg和2.25×10?2mL/mg。ZG154樣品的kD值為負(fù)，表明ZG154分子間存在相互吸引作用，其在40℃下放置發(fā)生的聚集行為與分子間相互吸引作用有關(guān)，同時(shí)Asn329位點(diǎn)的脫酰胺修飾通過化學(xué)殘基的變化來改變蛋白質(zhì)疏水性，從而增加了蛋白分子間相互吸引作用，加速了ZG154分子的聚集，并且致使聚體結(jié)構(gòu)變化，造成ZG154樣品在40℃放置過程中二聚體沉降系數(shù)變小。然而，ZG187分子的kD值為正值，并且在Met430位點(diǎn)發(fā)生氧化修飾后，ZG187分子的kD仍顯示出高度正值，說明在40℃放置過程中，ZG187分子間總是表現(xiàn)出相互排斥的作用，因此ZG187分子沒有發(fā)生聚集行為。

3結(jié)論

ZG154分子HC上Asn329位點(diǎn)發(fā)生脫酰胺修飾的比例增加了30.7%，脫酰胺修飾增加了ZG154分子間相互吸引作用，加速了分子聚集，并因琥珀酰亞胺的產(chǎn)生而導(dǎo)致斷裂的發(fā)生。而ZG187分子HC上Met430位點(diǎn)發(fā)生氧化修飾的比例增加了36.9%，氧化修飾導(dǎo)致ZG187分子單個(gè)結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定性下降，使其發(fā)生了斷裂行為，但ZG187分子間始終呈現(xiàn)相互排斥作用，因而未發(fā)生聚集行為。該研究為ZG154和ZG187抗體的進(jìn)一步分子優(yōu)化設(shè)計(jì)和制劑篩選提供了理論依據(jù)。