項(xiàng)岳暉　盧玲玲　涂斐佩等

[摘要] 目的 采用雜交瘤技術(shù)制備糖化血紅蛋白的單克隆抗體并對(duì)其進(jìn)行鑒定，為開發(fā)糖化血紅蛋白ELISA 試劑盒提供特異性材料。 方法 通過用順丁烯二酰亞胺法制備免疫抗原，通過BALB/c小鼠進(jìn)行多層次免疫，通過細(xì)胞培養(yǎng)融合，HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞，使用G蛋白層析法、硫酸銨鹽析法等對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化。單抗亞類鑒定采用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒。 結(jié)果 通過細(xì)胞融合、培養(yǎng)、篩選、克隆等，最后篩選出1株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為N5B4；細(xì)胞培養(yǎng)上清液體效價(jià)為1∶5000，腹水效價(jià)為1∶100萬；通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人糖化血紅蛋白的濃度為99.2%。 結(jié)論 經(jīng)過篩選獲得高特異性、高靈敏度的KET單克隆抗體細(xì)胞株。

[關(guān)鍵詞] 糖化血紅蛋白；單克隆抗體；糖尿病黃斑水腫

[中圖分類號(hào)] R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2015）11-0022-03

[Abstract] Objective Using hybridoma technique and screened hybridoma cell strains stably， efficiently secreted anti glycosylated hemoglobin monoclonal antibody to provide specific material for the development of glycosylated hemoglobin ELISA kit. Methods The immune antigen was prepared by maleimide method， multi-level immune mice by BALB/c， through cell culture fusion， screening of hybridoma cell culture medium HAT， ammonium sulfate salting out method and G protein chromatography. Monoclonal antibody subclasses were identified by monoclonal antibody subtype identification Kit operation. Results Through cell fusion， screening and cloning culture， etc.， the final selection screened 1 strain stably secreting specific antibody hybridoma cell line， named N5B4； cell culture supernatant liquid was 1∶5000， ascites titer was 1∶100 million； a standard curve to calculate the concentration in the sample human glycated hemoglobin was 99.2%. Conclusion After KET monoclonal antibody cell line to obtain a high specificity and high sensitivity of screening.

[Key words] Glycosylated hemoglobin； Monoclonal antibody； Diabetic macular edema

糖化血紅蛋白（HbA1c）是一種非酶糖化產(chǎn)物，其對(duì)氧的親和力明顯高于正常的血紅蛋白，血液中HbA1c水平增高會(huì)阻礙氧在組織中擴(kuò)散，導(dǎo)致組織缺氧壞死。HbA1c水平增高也會(huì)加重視網(wǎng)膜缺氧狀態(tài)，進(jìn)一步加重毛細(xì)血管擴(kuò)張，滲漏明顯增加，最終導(dǎo)致CSME加重和治療效果不佳[1，2]。研究表明，DME治療效果僅與HbA1c水平有關(guān)，血糖水平的高低對(duì)其無明顯影響，這可能與HbA1c的水平反映測(cè)定前8～12周血糖的平均水平，血糖濃度的波動(dòng)對(duì)其影響不大，因此，是一項(xiàng)評(píng)估糖尿病控制效果的重要指標(biāo)[3]。因此檢測(cè)HbA1c的水平，對(duì)于臨床治療糖尿病性黃斑水腫有極其重要的意義。本研究利用雜交腫瘤技術(shù)制備并篩選出高特異性、高靈敏度的KET單克隆抗體細(xì)胞株，為開發(fā)糖化血紅蛋白ELISA 試劑盒提供特異性材料，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

試驗(yàn)動(dòng)物為BLAB/c小鼠20只，均購自上海中科院下屬單位上海斯萊克試驗(yàn)動(dòng)物中心，周齡8～10周，雌雄各10只。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備 多肽鏈N末端纈氨酸上的氨基與葡萄糖C1 發(fā)生糖基化。Cys（SH）用于偶聯(lián)載體蛋白，用順丁烯二酰亞胺法分別偶聯(lián)KLH和BSA，制備出我們所需要的免疫抗原。

1.2.2 動(dòng)物免疫 取8～10周齡BALB/c小鼠20只，將免疫抗原采用多層次動(dòng)物免疫方法進(jìn)行免疫，融合前3 d進(jìn)行1次強(qiáng)化免疫，增加劑量，不要使用佐劑。

1.2.3 細(xì)胞融合 細(xì)胞融合過程中應(yīng)注意幾個(gè)問題：①細(xì)胞的比例：骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從1∶2～1∶10不等。常用1∶4。②反應(yīng)時(shí)間。③培養(yǎng)液的成分。實(shí)驗(yàn)具體操作如下：將Sp2/o細(xì)胞和脾細(xì)胞混合，離心，取上清，輕輕搖散底部細(xì)胞，慢慢加入PEG（150%，0.7 mL）加完后迅速加入25 mL不含血清的培養(yǎng)基以稀釋PEG（37℃水浴進(jìn)行），PEG可以造成細(xì)胞膜一定程度的損傷，使細(xì)胞易于相互黏連而融合在一起，800 rpm/min離心7 min，棄上清，加入HAT培養(yǎng)基，再加到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板內(nèi)，100 μL/孔，5%CO2、37℃培養(yǎng)。

1.2.4 雜交瘤細(xì)胞篩選及克隆化培養(yǎng) 采用間接ELISA法對(duì)融合后的細(xì)胞進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞篩選，將篩選出來的細(xì)胞進(jìn)一步使用有限稀釋法進(jìn)行克隆，然后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，收集并凍存，對(duì)其進(jìn)行鑒定。

1.2.5 單克隆抗體的制備及效價(jià)測(cè)定 選擇20只小鼠，使用1 mL注射器將0.5 mL液體石蠟注入小鼠腹腔，培養(yǎng)1周后，將雜交瘤細(xì)胞注射進(jìn)入小鼠腹腔，劑量為（1～2）×106個(gè)/只，1周后觀察小鼠腹腔腹水生成情況，使用注射器抽取1～2 mL腹水，離心，取上清液。采用間接ELISA法測(cè)定效價(jià)，以A值大于陰性的2.1倍的稀釋比例的倒數(shù)為該抗體效價(jià)，-20℃凍存腹水。

1.2.6 單克隆抗體的純化及亞類鑒定 使用硫酸銨鹽析法和G蛋白層析法對(duì)小鼠腹水進(jìn)行純化，按照小鼠單克隆抗體亞型試劑盒說明書進(jìn)行操作鑒定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS21.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞融合及篩選

通過細(xì)胞融合、培養(yǎng)、篩選、克隆等，最后篩選出1株能穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為N5B4。見表1。

2.2單抗的最大稀釋度和腹水效價(jià)的測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)上清液體效價(jià)為1∶5000，腹水效價(jià)為1∶100萬。

2.3單克隆抗體鑒定

用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定吸光度OD值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人糖化血紅蛋白的濃度為99.2%，不同濃度樣品存放-20℃放置3個(gè)月穩(wěn)定性較高，見表2。

3 討論

HbA1c是人體血液中紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物，在血液中的濃度與血糖濃度呈正比，且不能進(jìn)行可逆性結(jié)合，其隨著紅細(xì)胞消亡而消失，通過檢查HbA1c可以評(píng)估采血前2～3個(gè)月血糖的平均水平。HbA1c與人體內(nèi)的代謝有密切關(guān)系，當(dāng)其濃度升高時(shí)，可影響紅細(xì)胞對(duì)氧的親和力，其與氧結(jié)合能力較強(qiáng)，容易引起組織與細(xì)胞缺氧，導(dǎo)致組織與毛細(xì)血管壞死，加速心腦血管并發(fā)癥的形成。HbA1c濃度升高可引起腎小球增厚，引發(fā)糖尿病腎病。另外其還能引起血脂和血粘滯度增高，增加心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。因此監(jiān)測(cè)HbA1c在糖尿病患者病情控制、并發(fā)癥預(yù)測(cè)、糖尿病患者篩選等方面具有非常重要的作用。國際上已經(jīng)明確將HbA1c作為糖尿病監(jiān)測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，由于檢測(cè)方法尚未完全統(tǒng)一，我國還未將其作為糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。目前臨床上對(duì)確診的糖尿病患者進(jìn)行HbA1c檢測(cè)，主要目的在于了解患者近期血糖控制效果，為臨床治療提供參考。將HbA1c檢測(cè)結(jié)果作為糖尿病病情控制的指標(biāo)，對(duì)糖尿病高危人群開展HbA1c檢測(cè)，可以早期發(fā)現(xiàn)糖尿病患者，并對(duì)其進(jìn)行早期治療。

本研究通過采用雜交瘤技術(shù)制備糖化血紅蛋白的單克隆抗體并對(duì)其進(jìn)行鑒定，為開發(fā)糖化血紅蛋白ELISA 試劑盒提供特異性材料[4]。本實(shí)驗(yàn)所制備的1株糖化血紅蛋白單克隆抗體具有較強(qiáng)的特異性，經(jīng)腹水效價(jià)測(cè)定和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法試驗(yàn)，結(jié)果提示本研究制備篩選出來的HbA1c單克隆抗體具有較好的特異性和敏感性。

本研究采用混合多層次免疫方法（快速免疫佐劑+“油包水”佐劑+脾臟增強(qiáng)），即第一次采用快速免疫佐劑保護(hù)免疫原并使抗原快速吸收[5]；第二次采用“油包水”免疫有利于抗原在體內(nèi)存在時(shí)間；第三次采用抗原直接注射脾臟，使短時(shí)間內(nèi)滴度達(dá)到最大效果。通過試驗(yàn)證明，采用混合多層次免疫具有極大的優(yōu)勢(shì)：①免疫周期短，與常規(guī)免疫相比可以節(jié)省3～5周免疫時(shí)間[5，6]；②抗原用量少，僅為傳統(tǒng)免疫方法的1/3；③不破壞抗原天然構(gòu)象，易獲得針對(duì)天然構(gòu)象的抗體；④抗體達(dá)到的滴度高，有利于得到高靈敏度的單克隆抗體細(xì)胞株[7，8]。本項(xiàng)目中通過自制抗原，采用混合多層次免疫方法進(jìn)行動(dòng)物免疫，經(jīng)過雜交瘤融合、單克隆篩選、交叉抑制等等一系列試驗(yàn)[9，10]，得到的單克隆雜交瘤細(xì)胞株應(yīng)及時(shí)凍存，以防止這些細(xì)胞的染色體丟失，發(fā)生變異。經(jīng)過大量的小鼠試驗(yàn)，我們選擇了以甘油為誘導(dǎo)劑、細(xì)胞注射密度5×106為最佳的腹水生產(chǎn)方案[5-7，11]，得到的HbA1c單克隆抗體抗體靈敏度可達(dá)99%以上，特異性達(dá)98%以上。

總之，本課題制備特異性好、靈敏度高、穩(wěn)定性好的糖化血紅蛋白單克隆抗體，為開發(fā)糖化血紅蛋白ELISA 試劑盒及其他檢測(cè)方法提供特異性蛋白原料。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Yang W，Lu J，Weng J，et al. Prevalence of diabetes among men and women in China[J]. New England Journal of Medicine，2010，362（12）：1090-1101.

[2] 謝榮榮，潘素芳，于湄. 離子交換HPLC法和親和層析HPLC法檢測(cè)糖化血紅蛋白結(jié)果的比較和分析[J]. 中國實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，10（13）：384-386.

[3] 陳鐵軍，何云霄. 糖化血紅蛋白測(cè)定診斷妊娠糖尿病的臨床意義[J]. 中國基層醫(yī)藥，2013，（22）：3130.

[4] Manley SE，Sikaris KA，Lu ZX. Validation of an algorithm combining haemoglobin A（1c） and fasting plasma glucose for diagnosis of diabetes mellitus in UK and Australian populations[J]. Diabetic Medicine，2009，（2）：115-121.

[5] Linlin QR，Li Qiurong，Jiang Haitao，et al. Effect of anti-Mou CD52 monoclonal antibody on mouse intestinal pithelial lymphocyles[J]. Transplantation，2009，88：766-772.

[6] Na Young Ji，Mi Young Park，Yun Hee Kang，et al. Evaluation of annexin Ⅱ as a potentialserum marker for hepatecellular carcinoma using a developed sandwich ELISA method[J]. International Jourhal of Molecular Medicine，2009，24：765-771.

[7] Hung Song，Robert FH，Ravy Vajravelu，et al. Radioimmunotherapy of breast cancer metastases with ot-particle emitter 225Ac：Comparing Emcacy with 213Bi and 90Y[J]. Cancer Research，2009，69（23）：8941-8948.

[8] 索艷. 糖化血紅蛋白測(cè)定方法及影響因素的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2010，（2）：210-213.

[9] 梁霄. 糖化血紅蛋白與空腹血糖聯(lián)合檢測(cè)的臨床意義及相關(guān)性探討[J]. 臨床誤診誤治，2011，27（11）：87-88.

[10] 國秀芝，邱玲. 保存溫度和時(shí)間對(duì)全血及血清中腺苷脫氨酶穩(wěn)定性的影響[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，（5）：106-110.

[11] Song EY，Qu CF，Rizvi SM，et al. Bismuth-213 radioimmunotherapy with C595 anti-MUC1 monoclonal antibody in an ovarian cancer ascites model[J]. Cancer Biol Ther，2008，7（1）：76-80.

（收稿日期：2014-10-15）