〔摘要〕 目的 研究牛大力醇提物對(duì)四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠的治療作用及機(jī)制。方法 采用腹腔注射40% CCl4橄欖油溶液（0.1 mL/100 g）建立肝纖維化SD大鼠模型，2次/周，連續(xù)12周。將肝纖維化大鼠隨機(jī)分為模型組，牛大力醇提物低、中、高劑量（3.5、7、14 g/kg）組及陽(yáng)性對(duì)照秋水仙堿（0.12 mg/kg）組，另設(shè)正常組大鼠，各組均為8只。各給藥組于造模第9周按設(shè)定劑量灌胃相應(yīng)藥物干預(yù)，1次/d，連續(xù)4周。正常組與模型組大鼠每天灌胃等體積的生理鹽水。末次給藥24 h后，測(cè)定大鼠肝脾指數(shù);檢測(cè)各組血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、透明質(zhì)酸（HA）、層粘連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（PCⅢ）、Ⅳ型膠原（Ⅳ-C）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）及白細(xì)胞介素-6（IL-6）的水平;HE染色和Masson染色觀察肝組織病理學(xué)變化;Western blot測(cè)定大鼠肝臟中Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keapl）、核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2， Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）和醌氧化還原酶1（NQO1）的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與正常組相比，模型組大鼠反應(yīng)遲鈍，肝脾指數(shù)、血清ALT、AST、MDA、LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1、IL-1β、IL-8及IL-6水平顯著升高（Plt;0.01），SOD表達(dá)水平顯著下降（Plt;0.01）;肝組織呈現(xiàn)明顯纖維化;肝組織Keap1蛋白含量明顯升高（Plt;0.01），Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)水平顯著降低（Plt;0.01）。與模型組比較，牛大力各劑量組均能明顯改善大鼠狀態(tài)，肝脾指數(shù)及血清ALT、AST、MDA、LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1、IL-1β、IL-8及IL-6水平顯著下調(diào)（Plt;0.05，Plt;0.01），SOD的表達(dá)水平明顯增加（Plt;0.01）;有效改善大鼠肝組織病理學(xué)損傷和纖維增生;肝組織中Keap1 表達(dá)被顯著抑制（Plt;0.01），Nrf2、HO-1和NQO1蛋白含量明顯升高（Plt;0.05，Plt;0.01）。與秋水仙堿組相比，牛大力醇提物高劑量組對(duì)上述指標(biāo)的調(diào)控作用更強(qiáng)，且改善作用隨著牛大力醇提物劑量的增加而增強(qiáng)。結(jié)論 牛大力醇提物具有明顯的抗肝纖維化作用，其作用機(jī)制可能與抗氧化、抑制炎癥因子表達(dá)、調(diào)控Keap1/Nrf2信號(hào)通路相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕 牛大力;醇提物;肝纖維化;抗氧化;炎癥因子;Keap1/Nrf2信號(hào)通路

〔中圖分類號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.01.003

Improvement effects of ethanol extract from Zhuang medicine Millettia speciosa Champ. on carbon tetrachloride-induced hepatic fibrosis in rats

HOU Ling1，2，3， QIN Ni3， LU Shiyin3*， CHEN Qiugui3， MO Yiling1，3， XU Minli3， LU Xianyun3，

HE Ye3， ZHANG Hongping1，3

1. Graduate School， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning， Guangxi 530000， China; 2. Department of Pharmacy， Liuzhou Municiple Liutie Central Hospital， Liuzhou， Guangxi 545000， China; 3. Key Laboratory of Research and Development of Chinese Medicine （Zhuang amp; Yao Medicine） Preparations， Liuzhou Traditional Chinese Medicine Hospital （Liuzhou Hospital of Zhuang Medicine）， Liuzhou， Guangxi 545026， China

〔Abstract〕 Objective To investigate the therapeutic effects and mechanism of Millettia speciosa Champ. ethanol extract （MCEE） on carbon tetrachloride （CCl4）-induced hepatic fibrosis （HF） in rats. Methods An SD rat model with HF was established by intraperitoneal injection of 40% CCl4 olive oil solution （0.1 mL/100 g） twice a week for 12 consecutive weeks. HF rats were randomly divided into model group， low-， medium-， and high-dose MCEE （3.5， 7， 14 g/kg） groups， positive control colchicine （0.12 mg/kg） group， and normal group， with eight rats in each group. Each medication group was given the corresponding drug intervention by gavage at the set dose since the 9th week of modeling， once a day for four consecutive weeks. The normal group and model group were given an equal volume of normal saline by gavage every day. The liver and spleen indexes of rats were measured 24 hours after the last administration; serum levels of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， malondialdehyde （MDA）， superoxide dismutase （SOD）， hyaluronic acid （HA）， laminin （LN）， type Ⅲ procollagen （PC Ⅲ）， collagen Ⅳ （Ⅳ-C）， transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， interleukin-1β （IL-1β）， interleukin-8 （IL-8）， and interleukin-6 （IL-6） were determined; HE staining and Masson staining were used to observe the pathological changes in liver tissue; Western blot was used to measure the protein levels of Kelch-like ECH-associated protein-1 （Keap1）， nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， heme oxygenase-1 （HO-1）， and quinone oxidoreductase 1 （NQO1） in rat liver. Results Compared with the normal group， rats in the model group showed delayed response， significantly increased liver and spleen indexes， and serum levels of ALT， AST， MDA， LN， HA， PC Ⅲ， Ⅳ-C， TGF-β1， IL-1β， IL-8， and IL-6 （Plt;0.01）， as well as significantly decreased SOD levels （Plt;0.01）; they also exhibited obvious fibrosis in liver tissue， significantly increased Keap1 protein content in liver tissue （Plt;0.01）， and significantly decreased protein levels of Nrf2， HO-1， and NQO1 （Plt;0.01）. Compared with the model group， the condition of rats in MCEE groups with all doses was significantly improved， with significant reductions in the liver and spleen indexes and serum levels of ALT， AST， MDA， LN， HA， PCIII， Ⅳ-C， TGF-β1， IL-1β， IL-8， and IL-6 （Plt;0.05， Plt;0.01）， and a significant increase in SOD expression （Plt;0.01）; the pathological damage and fibrosis in rat liver tissue were effectively alleviated; the expression of Keap1 in liver tissue was significantly inhibited （Plt;0.01）， while the protein content of Nrf2， HO-1， and NQO1 significantly increased （Plt;0.05， Plt;0.01）. Compared with the colchicine group， the high-dose MCEE group had a stronger regulatory effect on the above indicators， and the improvement effects were enhanced with increasing MCEE dosage. Conclusion MCEE has a significant anti-HF effect， and its mechanism of action may be related to antioxidant activity， inhibition of inflammatory cytokine expression， and regulation of the Keap1/Nrf2 signaling pathway.

〔Keywords〕 Millettia speciosa Champ.; ethanol extract; hepatic fibrosis; antioxidation; inflammatory factors; Keap1/Nrf2 signaling pathway

肝纖維化（hepatic fibrosis， HF）是許多慢性肝病病情發(fā)展的共同病理特征，是各種致病因素導(dǎo)致肝內(nèi)結(jié)締組織異常增生的肝內(nèi)彌散性細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix， ECM）過(guò)度沉積的病理過(guò)程，若未采取及時(shí)有效的治療將會(huì)導(dǎo)致肝硬化、肝癌的發(fā)生[1-3]。壯醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，HF由于蠱病日久，濕毒熱毒漸消，蠱毒停滯于龍路火路所致[4]。結(jié)合中醫(yī)基礎(chǔ)理論“肝腎同源，腎生髓、髓生肝”，若遵循“理氣、補(bǔ)腎、化瘀解毒”的治療原則，則可更好地協(xié)同抗HF作用，修復(fù)損傷的肝細(xì)胞，抑制炎癥因子表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體免疫，從而改善HF。壯藥牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤（Millettia speciosa Champ.）的干燥根，又名大力薯、金鐘根、山蓮藕、九龍串珠等，被收載于《壯藥學(xué)》，主要生長(zhǎng)在廣西、廣東及海南等南方地區(qū)[5-6]。牛大力性平，味甘，其作為嶺南地區(qū)藥食同源的特色植物藥具有潤(rùn)肺強(qiáng)腎、活筋通絡(luò)、健脾益氣等功效[7-8]。牛大力在臨床上常用于治療腰肌勞損、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性肝炎、慢性支氣管炎、咳嗽、遺精等疾病，其臨床應(yīng)用價(jià)值日益受到人們的重視[9-10]。現(xiàn)代藥理研究表明，牛大力具有抗炎鎮(zhèn)痛[11]、抗氧化[12]、保肝[13]等作用。目前研究表明，牛大力可以保肝護(hù)肝、改善肝臟功能[14]，然而，有關(guān)其抗HF的作用與機(jī)制鮮見(jiàn)報(bào)道。為此，基于前期的研究基礎(chǔ)[15]，本研究以秋水仙堿為陽(yáng)性對(duì)照藥物，采用CCl4誘導(dǎo)建立大鼠HF模型，初步探討牛大力醇提物（Millettia speci?osa Champ. ethanol extract）對(duì)大鼠的抗HF作用及其可能機(jī)制，為牛大力抗HF藥物的研究和開(kāi)發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1" 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠54只，體質(zhì)量120～140 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于通風(fēng)條件良好，12 h光照晝夜循環(huán)，溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～55%的環(huán)境中。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK湘2019-0004，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK桂2019-0001。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批號(hào)：GXMU?2010032418。自由攝食標(biāo)準(zhǔn)飼料與滅菌注射用水。

1.2" 藥物與試劑

牛大力藥材（廣西仙茱中藥科技有限公司，批號(hào)20201101），經(jīng)柳州市中醫(yī)醫(yī)院張洪平主任中藥師鑒定為豆科植物美麗崖豆藤（Milletia speciosa Champ.）的干燥根。秋水仙堿片（西雙版納版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20181108）;橄欖油（山東魯花集團(tuán)商貿(mào)有限公司，批號(hào)20190711）;四氯化碳（CCl4，天津博迪生化股份有限公司，批號(hào)20210422）;丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase， ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase， AST）、丙二醛（malondiald?ehyde， MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase， SOD）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20210419、20210417、20210418、20210420）;4%多聚甲醛（廣州賽國(guó)生物科技有限公司，批號(hào)21235935）;HE染色液、Masson染色液（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為20210419、20210707）;透明質(zhì)酸（hyaluronic acid， HA）、層粘連蛋白（laminin， LN）、Ⅲ型前膠原（type Ⅲ procollagen， PCⅢ）、Ⅳ型膠原（collagen Ⅳ， Ⅳ-C）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)均為20210310）;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β， IL-1β）、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8， IL-8）及白細(xì)胞介素-6（interleukin-6， IL-6）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，批號(hào)均為202104）;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3" 儀器

Bio-Rad iMark酶標(biāo)儀（上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，型號(hào)：Bio-Rad 680）;電熱恒溫水浴鍋（寧波新芝生物科技股份有限公司，型號(hào)：SC-20）;高速低溫離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘銳離心機(jī)有限公司，型號(hào)：TGD-20MC）;電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：JY2002）;制冰機(jī)（常熟雪科制冷設(shè)備有限公司，型號(hào)：IMS-130）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器公司，型號(hào)：RE-52）;熒光成像系統(tǒng)[賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：Invitrogen EVOS M5000];臺(tái)式離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司，型號(hào)：TD5）;超純水器（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，型號(hào)：GWB-1）。

2 方法

2.1" 牛大力醇提物的制備

取牛大力藥材3.0 kg，加70%乙醇水溶液30.0 L，待浸泡0.5 h后，加熱至沸騰，保持微沸狀態(tài)回流提取1.5 h，雙層200目濾布過(guò)濾取醇提液，同法重復(fù)提取濾渣1次，合并所得濾液，真空濃縮并定容質(zhì)量濃度為5.0 g/mL（以生藥量計(jì)）的藥液，置于-20 ℃冰箱分裝保存?zhèn)溆?，臨用前稀釋至相應(yīng)濃度。取秋水仙堿片進(jìn)行研磨，加純化水進(jìn)行溶解配制成秋水仙堿混懸液。

2.2" 分組、造模及給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，除正常組大鼠腹腔注射橄欖油（0.1 mL/100 g）外，其余大鼠腹腔注射40% CCl4橄欖油混合液（0.1 mL/100 g）以制備HF模型[16]，2次/周，連續(xù)12周。分別于造模第6、7、8周隨機(jī)選取2只大鼠進(jìn)行肝臟病理學(xué)檢查，以驗(yàn)證肝纖維化形成，當(dāng)肝組織出現(xiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、廣泛致密藍(lán)色膠原沉積、纖維組織增生及膠原纖維束時(shí)判定造模成功。于造模第9周開(kāi)始分組給藥，將大鼠隨機(jī)分為模型組，牛大力醇提物低、中、高劑量（以生藥量計(jì)，3.5、7、14 g/kg）組[9]和秋水仙堿（陽(yáng)性對(duì)照，0.12 mg/kg）組，每組8只。另設(shè)正常組大鼠8只。各給藥組灌胃給予相應(yīng)藥物，連續(xù)4周，1次/d;正常組、模型組大鼠灌胃給予等體積的生理鹽水。給藥期間各組大鼠繼續(xù)同法造模，同時(shí)觀察大鼠生命體征及體重的變化。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由攝食飲水，每天觀察各組大鼠活動(dòng)情況，所有大鼠末次給藥后，禁食同時(shí)自由飲水24 h，經(jīng)3%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，3 500 r/min離心（半徑5 cm）15 min，取血清，于-80 ℃超低溫冰箱保存待檢。采集血樣后頸椎脫臼處死大鼠，取出肝臟和脾臟并用預(yù)冷生理鹽水清洗后，濾紙拭干，稱重，計(jì)算肝（脾）臟指數(shù)，肝（脾）臟指數(shù)（%）=肝（脾）臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%[16]。取適量肝組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，其余肝臟置于-80 ℃超低溫冰箱保存待用。

2.3" 肝組織病理學(xué)觀察

取肝臟組織右葉同一位置約1 cm3大小，以4%多聚甲醛液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片（厚度約為3 μm），經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇常規(guī)逐級(jí)脫水，分別行HE染色和Masson染色，隨后乙醇常規(guī)逐級(jí)脫水，二甲苯透明后采用中性樹(shù)膠封片，采用電子顯微鏡下觀察并記錄肝組織病理學(xué)變化。

2.4" 大鼠血清相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)

取分離好的大鼠血清，采用比色法檢測(cè)血清中ALT、AST、MDA、SOD的含量，采用ELISA檢測(cè)血清中LN、HA、PCⅢ、Ⅳ-C、TGF-β1、IL-1β、IL-8及IL-6的水平。上述指標(biāo)均嚴(yán)格遵照檢測(cè)試劑盒指南步驟操作并于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定。

2.5" Western blot法檢測(cè)Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Kelch-like ECH-associated protein1， Keapl）/核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2， Nrf2）信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)取適量大鼠肝組織，研磨后加入RIPA裂解液置于冰上提取總蛋白，調(diào)整蛋白濃度加入loading buffer于沸水浴中加熱10 min，采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，PVDF膜轉(zhuǎn)移蛋白，封閉液室溫條件下封閉1 h。與相應(yīng)一抗于4 ℃環(huán)境中孵育過(guò)夜，洗膜液洗滌后于二抗中孵育1 h。ECL顯影。通過(guò)ImageJ軟件測(cè)量蛋白質(zhì)條帶的灰度值。

2.6" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料通過(guò)“x±s”表示。所有資料均作正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，滿足正態(tài)分布，多組間比較當(dāng)滿足方差齊性時(shí)采用單因素方差分析檢驗(yàn)，各組間均數(shù)多重比較采用Tukey檢驗(yàn);當(dāng)方差不齊時(shí)，采用Welch和Dunnett's T3檢驗(yàn)，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 牛大力醇提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)HF大鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的作用

正常組大鼠毛色、精神狀態(tài)、攝食、排便在實(shí)驗(yàn)期間均正常。與正常組相比，模型組大鼠毛發(fā)有輕微脫落且明顯變黃，精神衰弱，食欲不振，排便稀爛。而牛大力醇提物各劑量組和秋水仙堿組大鼠毛色、精神狀態(tài)、攝食相比模型組明顯改善。相比于正常組，模型組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度較小（Plt;0.01）、肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著升高（Plt;0.01）;與秋水仙堿組比較，牛大力醇提物高劑量組體質(zhì)量有上升趨勢(shì)（Plt;0.05），表明牛大力醇提物不影響大鼠的正常生長(zhǎng)。與模型組比較，牛大力醇提物各劑量組及秋水仙堿組能顯著降低大鼠肝臟指數(shù)與脾臟指數(shù)（Plt;0.05，Plt;0.01），牛大力醇提物中劑量組與秋水仙堿組相當(dāng)，且牛大力醇提物高劑量組優(yōu)于秋水仙堿組（Plt;0.01）。詳見(jiàn)表1。

3.2" 牛大力醇提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)HF大鼠血清生化指標(biāo)的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清中ALT、AST和MDA水平明顯上升（Plt;0.01），SOD水平顯著下降（Plt;0.01）;相較于模型組，牛大力醇提物各劑量組和秋水仙堿組均能明顯下調(diào)大鼠血清中ALT、AST及MDA含量（Plt;0.05，Plt;0.01），并能顯著提高SOD水平（Plt;0.05，Plt;0.01）。此外，相較于秋水仙堿組，牛大力醇提物中劑量組、牛大力醇提物高劑量組對(duì)ALT、AST、SOD與MDA調(diào)控作用更強(qiáng)（Plt;0.05，Plt;0.01），且牛大力醇提物組間呈劑量相關(guān)性。詳見(jiàn)表2。

3.3" 牛大力醇提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HF大鼠血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C表達(dá)的調(diào)控作用

與正常組比較，模型組血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C 水平顯著升高（Plt;0.01）;與模型組比較，經(jīng)牛大力醇提物干預(yù)后，各組血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C含量明顯下降（Plt;0.05，Plt;0.01）。詳見(jiàn)表3。

3.4" 牛大力醇提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)HF大鼠血清促炎因子與促纖維因子的調(diào)節(jié)作用

與正常組比較，模型組大鼠血清促纖維因子TGF-β1，促炎因子IL-1β、IL-8和IL-6水平顯著提高（Plt;0.01）;與模型組相比較，經(jīng)牛大力醇提物干預(yù)均能顯著抑制TGF-β1、IL-1β、IL-8和IL-6的表達(dá)（Plt;0.05，Plt;0.01）。此外，與秋水仙堿組比較，牛大力醇提物高劑量組對(duì)TGF-β1、IL-1β、IL-8 和IL-6的下調(diào)作用更明顯（Plt;0.01）。詳見(jiàn)表4。

3.5" 牛大力醇提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)HF大鼠肝組織病理變化的影響

HE染色顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)均勻完整，肝細(xì)胞排列清晰整齊，未見(jiàn)小膽管及纖維組織增生。模型組大鼠肝小葉出現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)損傷，細(xì)胞排列紊亂，肝細(xì)胞局灶點(diǎn)狀壞死增加、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維化明顯。牛大力醇提物各劑量組及秋水仙堿組對(duì)CCl4所致大鼠肝組織中肝小葉結(jié)構(gòu)完整性、炎癥壞死及纖維化病變均呈現(xiàn)不同程度改善，且牛大力醇提物干預(yù)作用效果隨著劑量增加而加強(qiáng)，其中牛大力醇提物高劑量組較于秋水仙堿組改善效果更為顯著。詳見(jiàn)圖1。

Masson染色顯示，正常組大鼠肝組織未出現(xiàn)染成藍(lán)色的纖維，未發(fā)現(xiàn)病理性改變，而模型組可見(jiàn)明顯的廣泛致密藍(lán)色膠原沉積，肝臟匯管區(qū)和中央靜脈周圍纖維組織增生明顯，且纖維間隔增厚，局部可見(jiàn)假小葉及膠原纖維束。與模型組比較，牛大力醇提物各劑量組膠原纖維增生范圍明顯減少，其改善作用隨著劑量的增加而增強(qiáng)，其中以牛大力醇提物高劑量組治療效果最佳。詳見(jiàn)圖2。

3.6" 牛大力醇提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)HF大鼠肝組織Keap1/Nrf2信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肝組織Keap1蛋白表達(dá)顯著升高，Nrf2、血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）和醌氧化還原酶1（quinone oxidoreductase 1， NQO1）蛋白表達(dá)明顯減少（Plt;0.01）。與模型組相比，經(jīng)牛大力醇提物干預(yù)后，各劑量組大鼠肝組織Keap1蛋白表達(dá)顯著降低，Nrf2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)明顯增加（Plt;0.05，Plt;0.01）。與秋水仙堿組比較，牛大力醇提物高劑量組對(duì)Keap1、Nrf2、HO-1和NQO1蛋白調(diào)控作用更強(qiáng)（Plt;0.01）。詳見(jiàn)圖3。

4 討論

ALT、AST常用于肝損傷評(píng)價(jià)指標(biāo)[17]，MDA與SOD反應(yīng)機(jī)體抗氧化應(yīng)激水平[18]。本研究造模12周后，病理組織學(xué)顯示模型組大鼠肝臟出現(xiàn)了明顯的損傷與纖維化特征，血清ALT、AST及MDA含量顯著升高，SOD水平顯著下降。給予牛大力醇提物或秋水仙堿治療后，上述血清生化指標(biāo)、肝組織病理?yè)p傷及纖維化病變均具有不同程度的改善，而且牛大力醇提物的改善效果隨著劑量的增加而增強(qiáng)，提示調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善肝脂質(zhì)過(guò)氧化損傷以及提高抗氧化酶活性是牛大力醇提物保肝作用的機(jī)制之一。多數(shù)肝病的發(fā)展進(jìn)程中均涉及不同程度的氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激反應(yīng)可引起炎癥因子（如IL-1β、IL-8和IL-6等）的大量釋放，刺激HSC的活化與增殖[19];而活化后的HSC導(dǎo)致ECM過(guò)度形成與沉積，并會(huì)產(chǎn)生促HF因子，誘導(dǎo)肝纖維化進(jìn)展[20]。本研究表明，模型組大鼠相較于正常組其肝組織中IL-1β、IL-8和IL-6的表達(dá)水平均明顯增加，證實(shí)了HF與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。與模型組比較，牛大力醇提物各劑量組和秋水仙堿組大鼠肝組織中IL-1β、IL-8和IL-6的水平均顯著下降，同時(shí)牛大力醇提物的抑制效果隨著劑量增加而增強(qiáng)，說(shuō)明牛大力醇提物可通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子的表達(dá)而發(fā)揮抗HF的作用。此外，TGF-β1作為極具代表性的促HF因子，在HSC的激活和HF進(jìn)展過(guò)程中擔(dān)當(dāng)重要作用;高水平的TGF-β1可調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄引起ECM過(guò)度表達(dá)并沉積，誘導(dǎo)或加速HF發(fā)展，故有效抑制TGF-β1表達(dá)是逆轉(zhuǎn)HF形成的重要手段之一[21]。

血清HA、LN、PCⅢ及IV-C含量與纖維化嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[22]，其含量常作為HF的診療指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，牛大力醇提物干預(yù)可有效降低HF大鼠血清中HA、LN、PCⅢ和Ⅳ-C水平，且隨著劑量的增加對(duì)上述指標(biāo)抑制作用越強(qiáng)，提示牛大力醇提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的大鼠HF具有良好的抑制作用。

Keap1/Nrf2通路與機(jī)體氧化應(yīng)激密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞氧化還原與代謝穩(wěn)態(tài)的維持，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞毒性反應(yīng)中具有重要調(diào)控作用。Keap1與Nrf2耦聯(lián)后可抑制后者活性;當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，Nrf2與Keap1解耦聯(lián)后重新恢復(fù)活性并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核中，再經(jīng)系列反應(yīng)后激活其下游的抗氧化基因（如HO-1、NQO1、SOD）表達(dá)，以維持氧化還原穩(wěn)態(tài)[23]。由此認(rèn)為，通過(guò)激活Nrf2是阻滯氧化應(yīng)激、抗HF的有力手段。本研究發(fā)現(xiàn)，CCl4明顯提高了大鼠肝組織中Keap1的水平，抑制了Nrf2及下游抗氧化物酶HO-1、NQO1的表達(dá)，牛大力醇提物顯著抑制了大鼠肝組織Keap1的表達(dá)，促進(jìn)Nrf2、HO-1、NQO1蛋白的表達(dá)，且牛大力對(duì)上述蛋白的調(diào)節(jié)強(qiáng)度與劑量相關(guān)，表明牛大力醇提物可能是通過(guò)調(diào)控Keap1/Nrf2信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，進(jìn)而發(fā)揮改善HF的作用。

綜上所述，牛大力醇提物對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HF模型大鼠具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、改善脂質(zhì)過(guò)氧化損傷、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)、抑制炎癥因子及促纖維因子TGF-β1表達(dá)等相關(guān)。牛大力主要分布于我國(guó)南方區(qū)域，臨床常用于潤(rùn)肺強(qiáng)腎、活筋通絡(luò)、健脾益氣。近年研究發(fā)現(xiàn)，牛大力具有保肝及改善肝功能之功效，但是其抗HF的作用研究尚不充分，其開(kāi)發(fā)程度有待進(jìn)一步提高。本研究采用多項(xiàng)指標(biāo)探討了牛大力醇提物對(duì)HF模型大鼠的改善調(diào)節(jié)作用，同時(shí)還對(duì)其機(jī)制進(jìn)行了較為全面的考察，為牛大力抗HF的開(kāi)發(fā)利用奠定了科學(xué)依據(jù)，但其具體作用機(jī)制仍有待后續(xù)深入研究。

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〔收稿日期〕2024-08-16

〔基金項(xiàng)目〕廣西中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2020MS055）;柳州市科技攻關(guān)與新產(chǎn)品試制（2020NBAA0802）。

〔通信作者〕*陸世銀，男，碩士，副主任藥師，E-mail：1175463199@qq.com。