〔摘要〕 目的 研究從肝治心組方對(duì)心肌缺血再灌注損傷（MIRI）大鼠心肌保護(hù)作用及核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（DMT1）和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白（Heph）表達(dá)的影響。方法 將60只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、從肝治心組方組[5.32 g/（kg·d）]、麝香保心丸組[10.27 mg/（kg·d）]、地爾硫[艸][卓]組[6.86 mg/（kg·d）]，每組10只。通過(guò)結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈30 min后再灌注120 min，構(gòu)建MIRI大鼠模型，術(shù)后連續(xù)灌胃給藥14 d后取材。采用HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化，普魯士藍(lán)染色觀察心肌組織鐵沉積情況，透射電子顯微鏡檢測(cè)心肌組織超微結(jié)構(gòu)，RT-PCR、Western blot檢測(cè)Nrf2、HO-1、DMT1、Heph mRNA和蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 與正常組和假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌纖維排列紊亂，纖維瘢痕組織增生，鐵沉積水平高，線粒體結(jié)構(gòu)異常，線粒體內(nèi)脊模糊，Nrf2、HO-1、Heph mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)（Plt;0.05），DMT1 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)（Plt;0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠心肌組織病理?yè)p傷改善，鐵沉積水平降低，線粒體和內(nèi)脊結(jié)構(gòu)較完整，Nrf2、HO-1、Heph mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)（Plt;0.05），DMT1 mRNA和蛋白表達(dá)下調(diào)（Plt;0.05）。結(jié)論 從肝治心組方可能是通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路，上調(diào)Heph的表達(dá)，下調(diào)DMT1的表達(dá)，減輕心肌組織鐵沉積，發(fā)揮改善MIRI的作用。

〔關(guān)鍵詞〕 心肌缺血再灌注損傷;從肝治心組方;核因子E2相關(guān)因子2;血紅素加氧酶-1;膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白;二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1;鐵代謝失衡

〔中圖分類號(hào)〕R256.2" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2025.01.004

Effects of Conggan Zhixin Formula on Nrf2， HO-1， and iron transport-related proteins in myocardial ischemia-reperfusion injury in rats

WANG Xinqiang1， HE Piao1， PIAO Meihong2， XIE Lihua1，2， ZENG Yang1，2， WANG Jinxi1，

ZHANG Chengcheng2， HU Guoheng1， CHEN Ya1*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China

〔Abstract〕 Objective To study the myocardial protective effects of Conggan Zhixin Formula on myocardial ischemia-reperfusion injury （MIRI） in rats and its influence on the expressions of nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， heme oxygenase-1 （HO-1）， divalent metal transporter 1 （DMT1）， and hephaestin （Heph）. Methods Sixty male SPF-grade SD rats were randomly divided into normal group， sham-operated group， model group， Conggan Zhixin Formula group [5.32 g/（kg·d）]， Shexiang Baoxin Pill group [10.27 mg/（kg·d）]， and diltiazem group [6.86 mg/（kg·d）]， with ten rats in each group. A MIRI rat model was established by ligating the left anterior descending coronary artery for 30 minutes followed by 120 minutes of reperfusion. Samples were collected after 14 consecutive days of gavage administration post-surgery. HE staining was used to observe the morphological changes in myocardial tissue， Prussian blue staining was employed to assess iron deposition in the myocardial tissue， and transmission electron microscopy was utilized to examine the ultrastructure of myocardial tissue. RT-PCR and Western blot were performed to examine the mRNA and protein expressions of Nrf2， HO-1， DMT1， and Heph. Results Compared with the normal group and sham-operated group， the model group exhibited disordered arrangement of myocardial fibers， fibrous scar tissue hyperplasia， high levels of iron deposition， abnormal mitochondrial structure with blurred cristae， and downregulated mRNA and protein expressions of Nrf2， HO-1， and Heph （Plt;0.05）， as well as upregulated mRNA and protein expression of DMT1 （Plt;0.05）. Compared with the model group， the rats in each drug-administered group showed reduced morphological damage in the myocardial tissue， reduced levels of iron deposition， more intact mitochondrial and cristae structures， more intact mitochondrial and cristae structures， upregulated mRNA and protein expressions of Nrf2， HO-1， and Heph （Plt;0.05）， and downregulated mRNA and protein expression of DMT1 （Plt;0.05）. Conclusion Conggan Zhixin Formula may exert its effects on reducing MIRI by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway， upregulating Heph expression， downregulating DMT1 expression， and reducing iron deposition in myoc?ardial tissue.

〔Keywords〕 myocardial ischemia-reperfusion injury; Conggan Zhixin Formula; nuclear factor-erythroid 2-related factor 2; heme oxygenase-1; membrane iron transporter accessory protein; divalent metal transporter 1; iron metabolism imbalance

隨著人口老齡化發(fā)展和現(xiàn)代生活壓力的增大，我國(guó)心肌梗死發(fā)病率不斷上升，加重了社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemic reperfusion injury， MIRI）是指心肌梗死后缺血區(qū)域心肌組織恢復(fù)血流后可能出現(xiàn)比之前更嚴(yán)重的損傷，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與細(xì)胞凋亡、壞死、鐵死亡、氧化應(yīng)激損傷、線粒體功能障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等有關(guān)，目前缺乏有效的治療手段[1]。

近年來(lái)，鐵死亡作為MIRI機(jī)制受到廣泛關(guān)注。鐵死亡是二價(jià)鐵超載導(dǎo)致的超氧化應(yīng)激反應(yīng)，特點(diǎn)是鐵代謝失衡和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物增多，活性氧（reactive oxygen species，ROS）大量堆積在細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞膜崩潰、細(xì)胞死亡[2]。鐵死亡的發(fā)生與氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間的平衡失調(diào)密切相關(guān)，細(xì)胞內(nèi)的鐵沉積可以導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷，核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2， Nrf2）是抗氧化系統(tǒng)中重要的轉(zhuǎn)錄因子，血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1， HO-1）是其下游因子，具有抗炎、抗凋亡作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2/HO-1信號(hào)通路不僅能抗氧化應(yīng)激損傷，還對(duì)鐵代謝失衡有調(diào)節(jié)作用，成為研究抗鐵代謝失衡藥物的熱點(diǎn)[4]。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧/復(fù)氧損傷的H9c2心肌細(xì)胞中，Nrf2/HO-1信號(hào)通路被抑制，線粒體膜電位水平下降，ROS水平升高，與鐵死亡有著密切關(guān)系，從肝治心組方可以抑制缺氧/復(fù)氧損傷H9c2心肌細(xì)胞鐵死亡[5]。本研究以鐵代謝失衡可能是MIRI發(fā)生機(jī)制為切入點(diǎn)，探討MIRI模型大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)輔助蛋白（hephaestin， Heph）和二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal-ion transporter 1，DMT1）的表達(dá)變化，以及從肝治心組方發(fā)揮MIRI保護(hù)作用的具體機(jī)制。

1 材料

1.1" 動(dòng)物

雄性SPF級(jí)SD大鼠60只，體質(zhì)量250～280 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004]。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK（湘）2019-0009]，環(huán)境溫度保持在（24±2） ℃，濕度保持在60%±10%，明/暗光線12 h交替，自由攝食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審查批號(hào)：LL2021101201。

1.2" 藥物

從肝治心組方組成：紅參10 g，當(dāng)歸10 g，丹參10 g，柴胡10 g，姜黃10 g，郁金10 g，白芥子5 g，九香蟲(chóng)5 g。水煎劑，濾液蒸發(fā)濃縮至含生藥1.5 g/mL，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。麝香保心丸（國(guó)藥準(zhǔn)字：Z31020068，批號(hào)：210109，規(guī)格：22.5 mg/丸，上海和黃藥業(yè)有限公司）;鹽酸地爾硫[艸][卓]緩釋膠囊（Ⅱ）（國(guó)藥準(zhǔn)字：H12020126，批號(hào)：2101155，規(guī)格：90 mg/粒，天津田邊制藥有限公司）。

1.3" 主要試劑

HE染色試劑盒、普魯士藍(lán)染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1120、G1428）;超純總RNA提取試劑盒（杭州Simgen生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：5003050）;RT-PCR反應(yīng)專用反轉(zhuǎn)錄試劑、擴(kuò)增試劑（日本TaKaRa公司，批號(hào)：RR047A、RR820A）;Nrf2抗體、HO-1抗體、DMT1抗體（武漢Proteintech生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：16396-1-AP、27282-1-AP、20507-1-AP）;Heph抗體、β-Tubulin（美國(guó)Affinity Bio?sciences生物科技有限公司，批號(hào)：DF13057、AF7011）;彩色預(yù)染蛋白Marker、ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑盒（合肥Biosharp生物科技有限公司，批號(hào)：BL712A、BL523B）;Western快速轉(zhuǎn)膜液、Western快速封閉液（上海Beyotime生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：P0575-1 L、P0252-100 mL）。

1.4" 主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號(hào)：RE-2000B，鞏義中天科技儀器有限公司）;數(shù)字心電圖機(jī)（型號(hào)：ECG-2303B，廣州三銳電子科技有限公司）;小型動(dòng)物呼吸機(jī)（型號(hào)：RWD407，深圳瑞沃德生命科技有限公司）;病理切片機(jī)（型號(hào)：RM2016，德國(guó)Leica儀器有限公司）;光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：TS100，日本Nikon公司）;透射電子顯微鏡（型號(hào)：FEI TECNAI G2 20 TWIN，美國(guó)FEI公司）;核酸蛋白濃度測(cè)定儀（型號(hào)：BioDrop Ulite，英國(guó)Biochrom公司）;多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)：Enspire，美國(guó)Perkinelmer公司）;熒光定量PCR儀（型號(hào)：Roche LightCycler480 Ⅱ，瑞士Roche公司）;蛋白印跡系統(tǒng)、化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)（型號(hào)：Bio-Rad、CheemiDoc XRS+Imager，美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1" MIRI模型的制備

大鼠術(shù)前禁食12 h、禁飲1 h，2%戊巴比妥鈉0.3 mL/100 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉。氣管插管，呼吸機(jī)輔助呼吸，連接數(shù)字心電圖機(jī)，記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，開(kāi)胸暴露心臟，找到左心耳與肺動(dòng)脈圓錐之間的左前降支冠狀動(dòng)脈（left anterior descending coronary artery， LAD），在左心耳下離根部2～3 mm，以6-0號(hào)帶線縫合針結(jié)扎。術(shù)中監(jiān)測(cè)心肌缺血成功標(biāo)志：局部心肌顏色變紫色或灰色，Ⅱ?qū)?lián)心電圖持續(xù)ST段抬高或倒置呈弓背向上抬高。持續(xù)30 min后打開(kāi)結(jié)扎線再灌注120 min，再灌注成功標(biāo)志：左前降支結(jié)扎以下缺血心肌顏色由紫色、灰色變鮮紅色，抬高的ST段下降gt;50%，或高尖的T波下降。迅速?gòu)?fù)位心臟，關(guān)閉胸腔，腹腔注射青霉素10萬(wàn)U預(yù)防感染。脫離呼吸機(jī)后，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后拔管，放回鼠籠，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵循無(wú)菌操作的要求。正常組不作處理，假手術(shù)組僅開(kāi)胸而不結(jié)扎，其余手術(shù)過(guò)程與造模相同。

2.2" 分組及給藥方法

60只大鼠隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、從肝治心組方組、麝香保心丸組、地爾硫[艸][卓]組，每組10只。正常組不作處理，假手術(shù)組只開(kāi)胸不結(jié)扎LAD，其余各組制備MIRI模型大鼠。術(shù)后第1天各組開(kāi)始干預(yù)，正常組、假手術(shù)組、模型組給予等體積蒸餾水灌胃;正常人一天服用從肝治心組方劑量為70 g，依據(jù)體型系數(shù)法[6]進(jìn)行人與大鼠藥物劑量換算，大鼠用藥劑量為5.32 g/（kg·d）;麝香保心丸正常人一天服用劑量為135 mg，換算得大鼠給藥劑量為10.27 mg/（kg·d）;鹽酸地爾硫[艸][卓]緩釋膠囊（Ⅱ）正常人一天服用劑量為90 mg，換算得大鼠給藥劑量為6.86 mg/（kg·d）。灌胃14 d后處死各組大鼠，留取心肌組織行指標(biāo)檢測(cè)。

2.3" HE染色觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化

將大鼠心肌組織用4%多聚甲醛固定24 h以上，梯度脫水，石蠟包埋后固定位置切片（厚度約為3～5 μm），脫蠟水化后HE染色，梯度脫水透明，封片后在光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)變化。

2.4" 普魯士藍(lán)染色觀察心肌組織鐵沉積情況

將大鼠心肌組織制備成石蠟切片，脫蠟水化后普魯士藍(lán)染色工作液染色，孵育、復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，封片后行顯微鏡觀察心肌組織鐵沉積情況。

2.5" 透射電子顯微鏡檢測(cè)心肌組織超微結(jié)構(gòu)

將新鮮的大鼠心肌組織用電鏡固定液4 ℃固定2～4 h，沖洗后用1%四氧化鋨固定2 h，再?zèng)_洗后用丙酮梯度脫水，100%環(huán)氧樹(shù)脂中60 ℃包埋過(guò)夜。用Leica UC7切片（厚度為70 nm）后3%乙酸鈾和檸檬酸鉛37 ℃下各染色15 min。沖洗晾干后，用透射電子顯微鏡觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)。

2.6" RT-PCR檢測(cè)Nrf2、HO-1、DMT1、Heph mRNA表達(dá)

取適量大鼠缺血再灌注區(qū)域心肌組織研磨勻漿，超純總RNA提取試劑盒提取總RNA，測(cè)定RNA濃度，合成cDNA后使用RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)。參照www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank設(shè)計(jì)引物，北京擎科生物科技有限公司合成引物，引物序列信息詳見(jiàn)表1，使用2-ΔΔct的算法定量分析。

2.7" Western blot檢測(cè)Nrf2、HO-1、DMT1、Heph蛋白表達(dá)

取適量大鼠缺血再灌注區(qū)域心肌組織研磨勻漿，RIPA裂解液4 ℃裂解30 min，4 ℃低溫離心（12 000 r/min，10 min，離心半徑6 cm）后收集上清液。檢測(cè)各樣本蛋白濃度，SDS變性后-20 ℃保存。制膠上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗Nrf2（1∶2 000）、HO-1（1∶3 000）、DMT1（1∶1 000）、Heph（1：2 000）、β-Tubulin（1∶5 000）4 ℃孵育過(guò)夜。次日PBST洗膜4次，二抗IgG HRP（1∶5 000）常溫孵育1 h，PBST清洗4次，避光配制ECL顯色液，孵育盒用錫紙包裹好，將PVDF膜正面朝下置于ECL顯色液中避光孵育3 min后，正面朝上置于儀器中顯色，導(dǎo)出圖片并用Image J軟件分析灰度值。

2.8" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。多樣本計(jì)量資料以“x±s”表示，符合正態(tài)分布和方差齊性者，進(jìn)行單因素方差分析，兩組之間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);方差不齊者，兩組之間比較用Dunnett's T3法。均以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1" 各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化

正常組大鼠心肌纖維規(guī)律排列，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰，細(xì)胞間質(zhì)正常;假手術(shù)組心肌細(xì)胞之間少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞核大致正常;模型組可見(jiàn)心肌纖維排列紊亂稀疏，肌纖維斷裂，偶可見(jiàn)心肌細(xì)胞發(fā)生斑片狀壞死，細(xì)胞核皺縮甚或消失，細(xì)胞間質(zhì)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，纖維瘢痕組織增生;與模型組比較，各給藥組心肌組織形態(tài)學(xué)明顯改善，肌纖維排列相對(duì)有序，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。詳見(jiàn)圖1。

3.2" 各組大鼠心肌組織鐵沉積情況

正常組和假手術(shù)組心肌組織鐵沉積不顯著;模型組鐵沉積增多;各給藥組相較于模型組，鐵沉積減少。詳見(jiàn)圖2。

3.3" 各組大鼠心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察結(jié)果

正常組和假手術(shù)組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，心肌纖維排列規(guī)則，線粒體豐富，內(nèi)脊結(jié)構(gòu)完整;模型組心肌細(xì)胞形態(tài)上有差異，可見(jiàn)壞死心肌細(xì)胞，心肌纖維斷裂，排列紊亂，線粒體分布不均，線粒體內(nèi)脊模糊，自噬體形成;相比模型組，各給藥組病理形態(tài)改善，心肌細(xì)胞形態(tài)差異小，心肌纖維排列相對(duì)規(guī)則，線粒體內(nèi)脊排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)較清晰。詳見(jiàn)圖3。

3.4" 各組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、DMT1、Heph mRNA的表達(dá)情況

與正常組比較，假手術(shù)組Nrf2、HO-1、DMT1、Heph mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）;與正常組和假手術(shù)組比較，模型組Nrf2、HO-1、Heph mRNA表達(dá)減少（Plt;0.05），DMT1 mRNA表達(dá)增加（Plt;0.05）;與模型組比較，各給藥組Nrf2、HO-1、HephmRNA表達(dá)增加（Plt;0.05），DMT1 mRNA表達(dá)減少（Plt;0.05）。詳見(jiàn)表2。

3.5" 各組大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、DMT1、Heph蛋白的表達(dá)情況

與正常組比較，假手術(shù)組Nrf2、HO-1、DMT1、Heph蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）;與正常組和假手術(shù)組比較，模型組Nrf2、HO-1、Heph蛋白表達(dá)減少（Plt;0.05），DMT1蛋白表達(dá)增加（Plt;0.05）;與模型組比較，各給藥組Nrf2、HO-1、Heph蛋白表達(dá)增加（Plt;0.05），DMT1蛋白表達(dá)減少（Plt;0.05）。詳見(jiàn)圖4、表3。

4 討論

隨著人口老齡化發(fā)展，我國(guó)心血管疾病的發(fā)病率和死亡率逐年上升，并且呈年輕化的趨勢(shì)。其中，急性心肌梗死（acute myocardial infarction， AMI）是心血管死亡事件發(fā)生的主要原因，AMI是指因冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊急性破裂，繼發(fā)冠狀動(dòng)脈血流中斷或閉塞導(dǎo)致心肌急性壞死，同時(shí)具備心肌損傷和至少一項(xiàng)心肌缺血的臨床證據(jù)[7]?？焖倩謴?fù)梗死部位血液灌注是治療AMI的關(guān)鍵，急診溶栓和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療是目前常用的再灌注治療方法，但是心肌組織恢復(fù)灌注后可能出現(xiàn)比之前更為嚴(yán)重的損傷，即MIRI，主要表現(xiàn)為致死性心肌再灌注損傷、心肌頓抑、微血管阻塞以及心律失常，目前缺乏有效的治療手段[8]。故MIRI的預(yù)防和改善逐漸成為心血管疾病研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

MIRI根據(jù)其癥狀表現(xiàn)，歸屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”范疇。追溯中醫(yī)經(jīng)典，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載“氣郁”為心病的重要病因病機(jī)?！妒颐劁洝るp治法》提出“心病調(diào)肝”之說(shuō)：“如人病心痛，不可只治心痛，必須兼治肝……蓋心氣之傷，由于肝木之不足，補(bǔ)其肝而心君安其位矣?！薄妒颐劁洝て畏ā吩疲骸叭瞬⌒耐?，不治心而偏治肝?！弊匪莘剿幱涊d，最早體現(xiàn)“心病調(diào)肝”之說(shuō)的是《金匱要略》中的橘枳姜湯[9]。全國(guó)名中醫(yī)王行寬認(rèn)為，“肝心同治法”的理論基石主要有兩方面：一是心、肝共主血脈，兩者協(xié)調(diào)則肝有所藏，心血充盈;二是神、魂共主七情，心、肝各司神魂，共主七情，以行情志。從肝治心組方為心痛靈基礎(chǔ)上增加疏肝解郁之品而成，是王行寬“心病治肝，肝心同治”學(xué)術(shù)思想的體現(xiàn)。該方中當(dāng)歸補(bǔ)血活血，紅參大補(bǔ)元?dú)?、通血脈，二者共奏補(bǔ)養(yǎng)氣血、活血化瘀之功，共為君藥;丹參行氣活血、益氣養(yǎng)血，又入心、肝二經(jīng)，攻補(bǔ)兼?zhèn)洌窈柰ǜ文?、宣暢氣血，姜黃、郁金行氣破瘀、宣降氣機(jī)，四者共為臣藥;白芥子豁痰開(kāi)胸利氣，為佐藥;九香蟲(chóng)理胸膈之凝滯，為諸藥先鋒使者。此外，柴胡、郁金疏肝氣，當(dāng)歸、紅參養(yǎng)肝血，能解郁和肝。諸藥合用，共奏補(bǔ)氣活血、疏肝解郁之功。

鐵從食物中攝取，由腸道吸收，通過(guò)血液遍布全身，主要儲(chǔ)存在紅細(xì)胞內(nèi)[10]。鐵對(duì)人體至關(guān)重要，作為血紅蛋白和肌紅蛋白的組成元素，參與氧氣運(yùn)輸，也是機(jī)體中很多酶類的組成部分，參與機(jī)體能量代謝和過(guò)氧化氫生產(chǎn)過(guò)程，而心臟作為泵血器官，易發(fā)生鐵超載類疾病[11]。生理情況下，鐵的攝取和流失是平衡的，當(dāng)MIRI時(shí)血流瘀滯，血紅蛋白結(jié)構(gòu)損傷，釋放大量游離鐵，心肌細(xì)胞內(nèi)鐵超載，鐵離子進(jìn)入線粒體，導(dǎo)致線粒體內(nèi)鐵沉積，鐵離子蓄積后在H2O2的催化下發(fā)生芬頓反應(yīng)和Haber-Weiss反應(yīng)，形成過(guò)量ROS和脂質(zhì)過(guò)氧化物，引起細(xì)胞膜和線粒體膜崩潰，導(dǎo)致心肌細(xì)胞鐵死亡[12]。

心肌細(xì)胞線粒體鐵含量比其他細(xì)胞高50%，心肌梗死區(qū)域紅細(xì)胞大量溶解，細(xì)胞膜損傷，血紅蛋白中鐵釋放并沉積，導(dǎo)致心肌細(xì)胞鐵死亡，引發(fā)MIRI的病理事件[13]。本研究構(gòu)建MIRI大鼠模型，結(jié)果顯示，MIRI大鼠心肌纖維排列紊亂，纖維瘢痕組織增生，鐵沉積水平高，線粒體結(jié)構(gòu)異常，線粒體內(nèi)脊模糊。從肝治心組方能夠改善大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)改變，減少心肌細(xì)胞核皺縮、壞死，減少細(xì)胞間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，改善纖維瘢痕組織增生，減少心肌組織中鐵沉積，降低線粒體損傷程度。多項(xiàng)研究表明，鐵死亡與MIRI的發(fā)生密切相關(guān)，抑制鐵死亡的發(fā)生可以減輕MIRI[10，14-16]。Nrf2是參與脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中控制細(xì)胞內(nèi)氧化穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[17]。在正常條件下，Nrf2和Kelch樣Ech相關(guān)蛋白1（Kelch like Ech associated protein 1， Keap1）結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中，在氧化應(yīng)激下，分布在細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2從Keap1解聚，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合，上調(diào)幾種抗氧化的下游靶基因表達(dá)，包括HO-1、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶等，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。其中，HO-1啟動(dòng)子包含核心抗氧化反應(yīng)原件堿基序列，而Nrf2可以優(yōu)先結(jié)合這些序列來(lái)誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。Nrf2/HO-1信號(hào)通路參與鐵死亡、細(xì)胞自噬、程序性細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡的預(yù)防，可作為動(dòng)脈硬化、心律失常和心肌梗死的潛在治療靶點(diǎn)[18]。Nrf2已被證明可以通過(guò)對(duì)抗鐵代謝失衡誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激來(lái)抑制鐵死亡，也可以預(yù)防鐵死亡激活劑引起的鐵死亡[19]。Nrf2也能調(diào)控鐵調(diào)素表達(dá)，以控制細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)和抗氧化系統(tǒng)[20]。HO-1參與鐵代謝，可以將血紅素降解為Fe2+、CO及膽綠素，當(dāng)MIRI時(shí)，HO-1過(guò)表達(dá)促進(jìn)鐵沉積[21]。DMT1廣泛表達(dá)，負(fù)責(zé)機(jī)體的鐵吸收，鐵超載時(shí)介導(dǎo)Fe2+進(jìn)入細(xì)胞[22]。Heph是含銅的亞鐵氧化酶，通過(guò)將Fe2+氧化成Fe3+來(lái)減輕鐵過(guò)載誘發(fā)的氧化應(yīng)激損傷[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，MIRI大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Heph mRNA和蛋白表達(dá)減少，DMT1 mRNA和蛋白表達(dá)增加，而從肝治心組方使MIRI大鼠心肌組織Nrf2、HO-1、Heph mRNA和蛋白表達(dá)增加，DMT1 mRNA和蛋白表達(dá)減少，改善了MIRI大鼠心肌細(xì)胞鐵死亡。

綜上所述，從肝治心組方可能通過(guò)促進(jìn)Nrf2/HO-1通路表達(dá)、上調(diào)Heph的表達(dá)以減輕鐵過(guò)載誘發(fā)的氧化損傷，抑制DMT1的表達(dá)以減少具有氧化還原活性的Fe2+的吸收，維持鐵代謝穩(wěn)定，進(jìn)而抑制了因鐵離子價(jià)態(tài)不穩(wěn)定導(dǎo)致芬頓反應(yīng)和Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生的ROS及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物引起的心肌細(xì)胞鐵死亡，從而對(duì)MIRI的心肌組織發(fā)揮保護(hù)作用。

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〔收稿日期〕2023-05-01

〔基金項(xiàng)目〕全國(guó)名老中醫(yī)藥專家傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（國(guó)中醫(yī)藥函人教函〔2022〕75號(hào)）;湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2021JJ40418）;湖南省衛(wèi)生健康委員會(huì)科研計(jì)劃項(xiàng)目（202203074417）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)藥傳承創(chuàng)新專項(xiàng)（2024XYLH363）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)科研項(xiàng)目（Z2023XJYB25）;湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)世界一流培育學(xué)科（2023）。

〔通信作者〕*陳" 亞，女，碩士，副主任醫(yī)師，E-mail：310532@hnucm.edu.cn。