摘 " "要：【目的】對(duì)VlCKX5基因進(jìn)行克隆及生物信息學(xué)、表達(dá)特異性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析，探究其在葡萄坐果中的調(diào)控作用?！痉椒ā靠寺lCKX5基因及其啟動(dòng)子，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)、表達(dá)特異性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析。使用GUS組織化學(xué)染色法分析VlCKX5啟動(dòng)子的活性。使用PlantTFDB、CIS-BP和JASPAR數(shù)據(jù)庫對(duì)VlCKX5的轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系進(jìn)行預(yù)測(cè)分析并篩選出關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。使用亞細(xì)胞定位、實(shí)時(shí)熒光定量（RT-qPCR）、酵母單雜交和雙熒光素酶驗(yàn)證VlAGL6a對(duì)VlCKX5的調(diào)控作用?！窘Y(jié)果】VlCKX5具有CKX家族典型特征的FAD結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞分裂素結(jié)合位點(diǎn)。VlCKX5在葡萄根和葉中高表達(dá)，其次是在花序中，CPPU處理后VlCKX5的表達(dá)量顯著降低。VlCKX5響應(yīng)CPPU激素的處理。VlAGL6a是VlCKX5的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，定位于細(xì)胞核中。VlAGL6a在花序中高表達(dá)，在CPPU處理后的表達(dá)模式與VlCKX5的一致。VlAGL6a可以與VlCKX5相互作用，并促進(jìn)其表達(dá)?！窘Y(jié)論】葡萄VlCKX5基因響應(yīng)CPPU的信號(hào)，轉(zhuǎn)錄因子VlAGL6a特異性結(jié)合VlCKX5基因的啟動(dòng)子并促進(jìn)VlCKX5的轉(zhuǎn)錄，為進(jìn)一步解析葡萄坐果機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：葡萄；CPPU；VlCKX5；VlAGL6a轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào)：S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980（2025）01-0016-14

Expression characteristics and transcriptional regulation analysis of VlCKX5 gene in grape

LIU Yiting1， 2， WANG Ruxin1， 2， ZHANG Haimeng1， 2， JING Pengwei1， 2， SHI Qiaofang1， 2， ZHAO Xiao-chun1， 2， YU Yihe1， 2*

（1College of Horticulture and Plant Protection， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023， Henan， China; 2Henan Provincial Engineering Research Center on Characteristic Berry Germplasm Innovation amp; Utilization， Luoyang 471023， Henan， China）

Abstract： 【Objective】 Grapes （Vitis vinifera L.） are an economically important fruit crop in the world， and severe berry drop can affect grape yield and quality. The synthetic cytokinin analog N-（2-chloro-4-pyridyl）-N'-phenylurea （CPPU） is known to enhance berry set in grapes. Cytokinin oxidase/dehydrogenase （CKX） enzymes， which are responsible for the irreversible degradation of cytokinin， are pivotal in modulating plant growth and development. In the present investigation， the cytokinin oxidase/dehydrogenase 5 （VlCKX5） gene and its promoter were cloned， and bioinformatic analysis， expression specificity and transcriptional regulation were performed to illustrate its role in grape berry setting. 【Methods】 In this study， we conducted experiments using Kyoho grapes （V. vinifera L. × V. labrusca L.） as the experimental material. The young berries were treated with 10 mg·L-1 of cytokinin-like growth regulator CPPU 5 days after anthesis. The treated berries were sampled at 1， 2， 4 and 8 days after treatment. Furthermore， at 13th day after anthesis， we systematically harvested roots， stems， leaves， inflorescences， tendrils and young berries from grapevines for subsequent tissue-specific analysis. The VlCKX5 gene region was amplified via polymerase chain reaction （PCR）. Bioinformatic analysis of the VlCKX5 protein sequence， including various physicochemical properties， was performed using the Expasy web tool. The identification of conserved domains within VlCKX5 was conducted through the InterPro database. Furthermore， the phylogenetic relationship among VlCKX5 and its homologs was examined using MEGA software. Protein domain architecture of VlCKX5 and its orthologous proteins was examined utilizing the GeneDoc 2.7. Expression levels of VlCKX5 in grapevine tissues， including roots， canes， leaves， inflorescences， tendrils and young berries under natural growth conditions， as well as in young berries following treatment with the CPPU， were quantified using real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction （RT-qPCR）. The activity of the VlCKX5 promoter was evaluated through histochemical staining with β-glucuronidase （GUS）. To predict the transcriptional regulatory interactions involving VlCKX5， we utilized the PlantTFDB， CIS-BP and JASPAR databases to identify potential key transcription factors that may modulate its expression. The coding sequence （CDS） of VlAGL6， with the termination codon excised， was cloned into the 101LYFP vector. The construct was then transformed into Agrobacterium Competent Cells （GV3101）， which were subsequently mixed with a selection marker and used to infiltrate Nicotiana benthamiana plants. At 72 hours post-transformation， the subcellular localization of fluorescence within N. benthamiana leaf cells was analyzed using laser scanning confocal microscopy. RT-qPCR was used to analyze the expression pattern of VlAGL6a in grape tissues after CPPU treatment. A fragment of the VlCKX5 promoter containing the VlAGL6a binding site， designated as P， was cloned into the pAbAi vector， generating the recombinant bait plasmid pAbAi-proVlCKX5/P. This plasmid was then transfected into the Y1HGold yeast strain. Subsequently， the VlAGL6a gene was cloned into the pGADT7 vector to create the recombinant prey plasmid pGADT7-VlAGL6a， which was transfected into a yeast strain positive for the bait genome to perform yeast one-hybrid （Y1H） interaction detection. A 1566 base pair segment of the VlCKX5 promoter， located in upstream of the ATG start codon， was cloned into the pGreenII0800-LUC vector to create a reporter construct. The VlAGL6a CDS was subcloned into the pSAK277 vector to produce an effector construct. Agrobacterium tumefaciens strains carrying these constructs were co-infiltrated into N. benthamiana leaves. The luciferase activity in the infiltrated samples was measured 48 hours post-infiltration using a dual-luciferase reporter assay system. 【Results】 VlCKX5 was 1641 bp in length and encoded 546 amino acids. The molecular weight of VlCKX5 was 61.516 62 ku， the isoelectric point was 8.36， the instability index was 36.64， the fat coefficient was 94.27， and the protein structure was stable. VlCKX5 had the closest homology to CKX amino acids in Chinese kiwifruit， and had a FAD domain and cytokinin binding site （CK-binding）， belonging to a typical CKX family. VlCKX5 was highly expressed in roots and leaves， followed by inflorescences， and the expression of VlCKX5 was significantly reduced at 1， 2， 4 and 8 d after CPPU treatment. Prediction of the cis-acting elements of the VlCKX5 promoter revealed elements containing hormones responsive to IBA， SA and ABA. GUS chemical tissue staining test results showed that VlCKX5 activated its promoter activity in response to the treatment of CPPU， SA， IBA and ABA. Transcriptional regulation analysis showed that BPC， DOF， MADS and FLC family transcription factors may be involved in the transcriptional regulation of VlCKX5， and VlAGL6a was a key candidate transcription factor for VlCKX5. Subcellular localization assay verified that VlAGL6a was localized in the nucleus. The results of fluorescence quantification showed that VlAGL6a was the highest in inflorescences， followed by berries and tendrils， and the lowest in roots， stems and leaves. The RT-qPCR results after CPPU treatment showed that the expression levels of VlAGL6a were significantly reduced on the 1st， 2nd， 4th and 8th days， which was consistent with the expression pattern of VlCKX5. Y1H and double luciferase assay showed that VlAGL6a could interact with VlCKX5 and promote its expression. 【Conclusion】 The VlCKX5 gene of grape responded to the signal of CPPU， and the transcription factor VlAGL6a was specifically bound to the promoter of VlCKX5 gene and promoted the transcription of VlCKX5， which affected grape berry setting by regulating the level of cytokinin， which provides a theoretical basis for further analysis of the mechanism of grape berry set.

Key words： Grape; CPPU; VlCKX5; VlAGL6a transcription factor

葡萄（Vitis vinifera L.）作為重要的經(jīng)濟(jì)水果作物，果實(shí)中富含花青素、黃酮醇及白藜蘆醇等多種生物活性成分有利于人體健康[1-2]。在葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，大多數(shù)幼果在開花后9～10 d發(fā)生嚴(yán)重的脫落[3]。坐果過程是決定葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵階段，是由內(nèi)部特定基因的調(diào)控和植物激素水平的變化共同驅(qū)動(dòng)的[4]。細(xì)胞分裂素處理可以顯著提高坐果率和產(chǎn)量[5-7]。氯吡苯脲（CPPU）是一種細(xì)胞分裂素類的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，已被證實(shí)能夠通過提高果實(shí)中碳水化合物水平來促進(jìn)鱷梨坐果[8]，此外CPPU還可以通過降低呼吸代謝和維持較高的能量電荷水平來促進(jìn)葡萄果實(shí)坐果[9]。CPPU處理還可以促進(jìn)甜瓜坐果和提高產(chǎn)量[10]。然而，關(guān)于CPPU促進(jìn)葡萄果實(shí)坐果的分子機(jī)制尚不清楚。因此，深入研究CPPU在葡萄坐果中的作用機(jī)制，對(duì)提升葡萄果實(shí)的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

CKX是一種不可逆降解細(xì)胞分裂素為腺嘌呤/腺苷的黃素酶，是細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中降解分支的關(guān)鍵酶[11-12]。CKX酶具有N端FAD和C端細(xì)胞分裂素結(jié)合位點(diǎn)（CK-binding）兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[13]。CKX基因家族成員不僅可以調(diào)控對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)[14]、根的形成[15]和果實(shí)發(fā)育[16]，還可以調(diào)控植物細(xì)胞分裂素水平進(jìn)而影響產(chǎn)量[17]。在水稻中，沉默OsCKX11可以提高旗葉中的細(xì)胞分裂素水平，增加分蘗數(shù)和穗粒數(shù)從而提高產(chǎn)量[18]。同樣，沉默OsCKX2可以增加水稻花序分生組織中細(xì)胞分裂素含量，提高鹽脅迫條件下的產(chǎn)量[19]。油菜中突變CKX3CKX5使細(xì)胞分裂素濃度增加，花和胚珠增加，產(chǎn)量提高[20]。然而VlCKX5基因在葡萄中的功能尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

VlAGL6a也稱為VlMADS3，是MADS-box基因家族中的成員之一[21]。MADS-box基因分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型MADS-box基因被分為3個(gè)不同的進(jìn)化群：Mα、Mβ和Mγ，Ⅱ型MADS-box基因包括動(dòng)物和酵母中的MEF2-like基因以及植物中特有的MIKC型基因[22-23]。MIKC型基因又分為MIKCC型和MIKC*型，植物中大多數(shù)MIKC型基因?yàn)镸IKCC型，包括12個(gè)亞家族SVP、FLC、TM3、AP1/FUL、SEP、AGL6、AG、AGL12、ANR1、AP3/PI、AGL15、BS[24-25]。MADS-box在植物發(fā)育中發(fā)揮重要作用，在番茄中異源過表達(dá)VvMADS45基因會(huì)使花、果和種子變大，而沉默其同源基因SlAGL104會(huì)使花、果實(shí)和種子變小[26]。在擬南芥中AGL6可以抑制FLC/MAF基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控開花時(shí)間[27]。FveSEP3在草莓花發(fā)育中起主要作用，F(xiàn)veSEP3可以抑制單性果實(shí)生長(zhǎng)和促進(jìn)正常授粉的果實(shí)成熟[28]。HvMADS1直接調(diào)控細(xì)胞分裂素降解酶HvCKX3基因進(jìn)而保持細(xì)胞分裂素的穩(wěn)態(tài)，在高溫下維持無分支的穗結(jié)構(gòu)[29]。

筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑CPPU處理降低了葡萄內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量，顯著提高葡萄坐果率[30]，但其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。本研究在巨峰葡萄基因組中克隆VlCKX5基因及其啟動(dòng)子，通過生物信息學(xué)分析、表達(dá)特異性分析、GUS組織化學(xué)染色、亞細(xì)胞定位、酵母單雜交和雙熒光素酶分析等方法，對(duì)VlCKX5的功能以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式進(jìn)行初步探索，為后續(xù)進(jìn)一步研究VlCKX5調(diào)控細(xì)胞分裂素水平進(jìn)而影響葡萄坐果的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料處理

植物材料取自中國河南省洛陽市偃師葡萄種植區(qū)種植的10年生巨峰葡萄（Vitis vinifera L.×Vitis labrusca L.）。在盛花后5 d，使用10 mg·L-1的CPPU溶液（含0.03% Silwet-L77表面活性劑）浸蘸葡萄幼果10 s，蒸餾水（含0.03% Silwet-L77表面活性劑）處理作為對(duì)照，具體處理參考Sun等[31]的方法。在CPPU處理和蒸餾水處理后1、2、4和8 d選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的整串葡萄幼果進(jìn)行采樣。在盛花后13 d時(shí)，采集自然發(fā)育的根（1年生）、莖（1年生）、葉（1年生枝條從基部數(shù)起的第4至6枚葉）、花序（1年生枝上）、卷須（1年生枝上）和幼果（1年生枝上），用于基因的組織特異性表達(dá)分析。本氏煙草（Nicotiana benthamiana）在25 ℃培養(yǎng)室中生長(zhǎng)，光照16 h/黑暗8 h。

1.2 序列分析

使用在線網(wǎng)站Ensembl Plants（https：//plants.ensembl.org/index.html）查詢VlCKX5（Vitvi13g01614）的編碼序列（CDS）和蛋白質(zhì)序列。使用在線網(wǎng)站Expasy（https：//web.expasy.org/protparam/）查詢VlCKX5蛋白序列的各種物理和化學(xué)參數(shù)。使用在線網(wǎng)站Interpro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）查詢VlCKX5的保守結(jié)構(gòu)域。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫中下載VlCKX5的同源氨基酸序列，使用MEGA11軟件對(duì)VlCKX5及其同源氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，生成系統(tǒng)發(fā)育樹。利用GeneDoc 2.7對(duì)VlCKX5同源物進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)。

1.3 RNA提取與VlCKX5克隆

使用RNA提取試劑盒（諾唯贊，南京）提取巨峰葡萄的RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（雅禮，江蘇）獲得葡萄的全長(zhǎng)cDNA，并以此為模板通過PCR擴(kuò)增VlCKX5的編碼序列（CDS），擴(kuò)增引物為pSAK277-VlCKX5-F：TAGTGGATCCAAAGAATTCCATGTTGAGGGGCTTCTGTCTTTGG，pSAK277-VlCKX5-R：CGAGAAGCTTTTTGAATTCGATCACAAGAA-

GGGTGTCGCCTTTC。使用膠回收試劑盒（康為世紀(jì)，北京）回收目標(biāo)片段。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)（Trans5α），使用質(zhì)粒提取試劑盒（聚合美，北京）提取pSAK277-VlCKX5質(zhì)粒，并送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序得到pSAK277-VlCKX5序列。測(cè)序結(jié)果正確后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌感受態(tài)（GV3101）中。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量（RT-qPCR）

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（雅禮，江蘇）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲取片段cDNA，經(jīng)內(nèi)參基因Ubiqutin1（GenBank：CA808925）檢測(cè)后在-20 ℃保存?zhèn)溆?。采?-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，并使用Excel 2016和Graphpad Prism 8軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。構(gòu)建載體所用引物序列為VlCKX5-F：GCATTCGTTTC-

ATAGCAAGC，VlCKX5-R：AATGCCCGTCAACA-

GAAAGT；VlAGL6a-F：ACTTTCTGTGCTTTGTGATGCT，VlAGL6a-R：TGATACCGCTCTAGGGT-

TTTG。

1.5 啟動(dòng)子的克隆與GUS組織化學(xué)染色

使用DNA提取試劑盒（雅禮，江蘇）提取葡萄果實(shí)的DNA。使用添加同源臂的引物以DNA為模板使用高保真酶Primer STAR Max Premix（TaKaRa，大連）克隆VlCKX5的5′端上游1566 bp序列，連接GUS載體，獲得pC0390-GUS-proVlCKX5質(zhì)粒。將其質(zhì)粒轉(zhuǎn)到GV3101中，獲得農(nóng)桿菌菌液。使用PlantCARE網(wǎng)站（https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測(cè)VlCKX5啟動(dòng)子的順式作用元件。使用真空滲透方法進(jìn)行煙草葉片的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化，GUS組織化學(xué)染色試驗(yàn)的具體方法參考GUS染色試劑盒（酷來搏，北京）的說明書。使用生長(zhǎng)素（IBA）（100 μmol·L-1）、水楊酸（SA）（100 μmol·L-1）、脫落酸（ABA）（100 μmol·L-1）、氯吡苯脲（CPPU）（40 μmol·L-1）和茉莉酸甲酯（MeJA）（100 μmol·L-1）溶液噴施浸染pC0390-GUS-proVlCKX5菌液后的煙草葉片，噴施葉片的正反面，用濕潤的脫脂棉包裹住葉柄，放入托盤中正常光照培養(yǎng)24 h。以pC0390-GUS載體為陰性對(duì)照，帶有35S啟動(dòng)子的GUS載體作為陽性對(duì)照。將培養(yǎng)好的煙草葉片放進(jìn)一次性培養(yǎng)皿中，加入GUS染色劑，使葉片完全浸入，放在37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，其間使用封口膜將容器封閉避免GUS染色液揮發(fā)，使用70%乙醇脫色2～3次，至綠色完全脫去，肉眼或顯微鏡下觀察到白色背景上的藍(lán)色小點(diǎn)即為GUS表達(dá)位點(diǎn)。觀察GUS染色情況并拍照記錄。構(gòu)建載體所用引物序列為GUS-proVlCKX5-F：TGGGCCCGGCGCGCCAAGCTTG-

GGAGCCACCTTGAGCATCTC，GUS-proVlCKX5-R：GGTGGACTCCTCTTAGAATTCCATGGGTCTA-

GGGAAAGGAGCAG。

1.6 靶向VlCKX5的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控預(yù)測(cè)

通過CIS-BP數(shù)據(jù)庫（https：//cisbp.ccbr.utoronto.ca/）、JASPAR數(shù)據(jù)庫（https：//jaspar.elixir.no/）和PlantTFDB數(shù)據(jù)庫（http：//planttfdb.gao-lab.org）得到葡萄轉(zhuǎn)錄因子信息，并使用TB-tools的GTF/GFF3 Sequences Extractor插件提取VlCKX5啟動(dòng)子上游2000 bp序列，根據(jù)PlantTFDB、CIS-BP和JASPAR數(shù)據(jù)庫公布的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)信息，使用Find Individual Motif Occurences（FIMO）在線網(wǎng)站（https：//meme-suite.org/meme/tools/fimo）在VlCKX5啟動(dòng)子上進(jìn)行TFBS預(yù)測(cè)，依據(jù)10-5截取閾值作為篩選預(yù)測(cè)結(jié)果。通過GENIE3預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子與VlCKX5之間可能存在的共表達(dá)調(diào)控關(guān)系，依據(jù)weigh＞0.1截取閾值作為篩選預(yù)測(cè)結(jié)果。根據(jù)GENIE3預(yù)測(cè)得到的共表達(dá)調(diào)控關(guān)系，通過Gephi0.10軟件將得到的預(yù)測(cè)信息進(jìn)行可視化，使用Fruchterman Reingold布局，繪制共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 亞細(xì)胞定位

去除VlAGL6a（Vitvi15g00776）編碼區(qū)的終止密碼子后，將其插入到101LYFP載體中，形成101LYFP-VlAGL6a重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到GV3101中，將核標(biāo)記物（VirD2NLS-mCherry）與轉(zhuǎn)化后的菌液混合，轉(zhuǎn)化到煙葉中瞬時(shí)表達(dá)。25 ℃下暗處理2 d，正常培養(yǎng)1 d后，用激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯，日本）觀察熒光信號(hào)?？瞻?01LYFP作為對(duì)照。構(gòu)建載體所用引物序列為101LYFP-VlAGL6a-F：ATGGGATCTACTAGTGAATTCATG-

GGGAGAGGAAGAGTGGAGC，101LYFP-VlAGL-

6a-R：GGGGGTACCGTCGACGGATCCAAGAACC-

CACCCTTGGATGAAG。

1.8 酵母單雜交（Y1H）

克隆VlCKX5啟動(dòng)子中VlAGL6a的結(jié)合片段P并插入pAbAi載體中，構(gòu)建重組餌料質(zhì)粒pAbAi-proVlCKX5/P。將重組誘餌質(zhì)粒pAbAi-proVlCKX5/P用BstbⅠ線性化，采用PEG/LiAc轉(zhuǎn)化方法將其整合到酵母菌株Y1H Gold中。轉(zhuǎn)化后的酵母菌株在SD/-Ura缺陷型培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，將培養(yǎng)基放置于30 ℃培養(yǎng)箱中。通過加入不同濃度的金擔(dān)子素A（AbA）的SD/-Ura培養(yǎng)基篩選抗性濃度。隨后，將重組獵物質(zhì)粒pGADT7-VlAGL6a轉(zhuǎn)化到陽性酵母菌株（包含誘餌基因組）中，并涂布在SD/-Leu缺陷型培養(yǎng)基上，在30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d，以pGADT7空載體轉(zhuǎn)化到陽性酵母菌株（包含誘餌基因組）中作為對(duì)照。在SD/-Leu/AbA培養(yǎng)基上培養(yǎng)共轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞，檢測(cè)VlCKX5與VlAGL6a的相互作用。構(gòu)建載體所用引物序列為pAbAi-proVlCKX5/P-F：TTGAATTCGAGCTCGGTACCC-

CATGACCGAGTCCTCGTTATTTTG，pAbAi-proVlCKX5/P-R：TACAGAGCACATGCCTCGAGGAGCAACACCTAATCCTCCTCTC；pGADT7-VlAGL6a-F：GCCATGGAGGCCAGTGAATTCATGGGGAGAGGAAGAGTGGAGC，pGADT7-VlAGL6a-R：CAG-

CTCGAGCTCGATGGATCCTCAAAGAACCCAC-

CCTTGGATGAAG。

1.9 雙熒光素酶測(cè)定

從巨峰葡萄DNA中PCR擴(kuò)增出VlCKX5的ATG起始密碼子上游1566 bp的DNA序列，并插到pGreenII0800-LUC載體中。所生成的質(zhì)粒ProVlCKX5-LUC作為報(bào)告子。將VlAGL6a的CDS編碼區(qū)插入載體pSAK277中，生成作為效應(yīng)子的35S-VlAGL6a。未插入啟動(dòng)子的載體pGreenII0800-LUC和未插入VlAGL6a的載體pSAK277作為陰性對(duì)照。將效應(yīng)子和報(bào)告子分別導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中，報(bào)告質(zhì)粒與效應(yīng)質(zhì)粒以1∶9混合共轉(zhuǎn)化到本氏煙草葉片中[10]。48 h后使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)（Promega，美國）測(cè)定每個(gè)樣品的熒光素酶活性。構(gòu)建載體所用引物序列為L(zhǎng)UC-VlCKX5-F：GTCGACGGTATCGATAAGCTTGGGAGCCACCTTGAGCA-

TCTC，LUC-VlCKX5-R：CGCTCTAGAACTAGTGGATCCCATGGGTCTAGGGAAAGGAGCAG，pSA-

K277-VlAGL6a-F：TAGTGGATCCAAAGAATTCC-

ATGGGGAGAGGAAGAGTGGAGC，pSAK277-Vl-

AGL6a-R：CGAGAAGCTTTTTGAATTCGATCAA-

AGAACCCACCCTTGGATGAAG。

2 結(jié)果與分析

2.1 VlCKX5克隆及序列分析

為進(jìn)一步對(duì)VlCKX5的功能進(jìn)行探究，克隆到VlCKX5（Vitvi13g01614）。VlCKX5的CDS長(zhǎng)度為1641 bp，編碼546個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為61.516 62 kDa，等電點(diǎn)為8.36，不穩(wěn)定系數(shù)和脂肪系數(shù)分別為36.64和94.27，蛋白質(zhì)穩(wěn)定。VlCKX5具有CKXs特征結(jié)構(gòu)域-甲酚甲基羥化酶（PCMH）型黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）結(jié)合域和細(xì)胞分裂素結(jié)合位點(diǎn)（CK-binding）（圖1-A）。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，VlCKX5與中華獼猴桃的同源關(guān)系最近（圖1-B）。VlCKX5與AcCKX（中華獼猴桃）、OsCKX4（水稻）和AtCKX6（擬南芥）蛋白的多序列比對(duì)結(jié)果顯示VlCKX5含有FAD和Cytokin-bind的核心保守結(jié)構(gòu)域（圖1-C）。

2.2 VlCKX5基因表達(dá)模式分析

通過RT-qPCR檢測(cè)巨峰根、莖、葉、花序、幼果、卷須中VlCKX5的表達(dá)量，結(jié)果顯示VlCKX5基因在葡萄根和葉中相對(duì)表達(dá)量最高，其次是在花序中，在莖和卷須中的相對(duì)表達(dá)量最低（圖2-A）。檢測(cè)CPPU處理后不同時(shí)期VlCKX5的表達(dá)量，VlCKX5在CPPU處理后表達(dá)受到顯著抑制，在1、2、4、8 d的表達(dá)量顯著降低（圖2-B）。

2.3 VlCKX5啟動(dòng)子克隆及分析

對(duì)VlCKX5啟動(dòng)子序列的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示VlCKX5啟動(dòng)子區(qū)域除了啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域中常見的順式作用元件CAAT-box和核心啟動(dòng)子元件TATA-box外，還包括光、分生組織表達(dá)和激素的響應(yīng)元件（表1）。在VlCKX5的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)素、水楊酸和脫落酸的植物激素響應(yīng)元件（圖3-A）?？寺lCKX5的5′端上游1566 bp序列并進(jìn)行GUS染色試驗(yàn)，與陰性對(duì)照相比，Mock處理的煙草葉片明顯呈藍(lán)色，ProVlCKX5顯著增強(qiáng)了GUS基因的活性。此外，VlCKX5啟動(dòng)子對(duì)IBA、SA、ABA和CPPU均表現(xiàn)出激素應(yīng)答信號(hào)，其中IBA、SA、ABA和CPPU處理與Mock處理的葉片顏色相比，表現(xiàn)出更深的藍(lán)色，MeJA處理與Mock處理的葉片顏色相比沒有明顯的差別，對(duì)VlCKX5啟動(dòng)子激活效果不明顯（圖3-B）。

2.4 靶向調(diào)控VlCKX5的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)及分析

預(yù)測(cè)了可能靶向VlCKX5的轉(zhuǎn)錄因子，在PlantTFDB、CIS-BP和JASPAR數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了共同靶向VlCKX5的5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子（圖4-A）。通過Gephi0.10軟件對(duì)這5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子以及VlCKX5之間的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系進(jìn)行可視化，結(jié)果可以看出VlCKX5和這5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子之間都存在靶向關(guān)系（圖4-B）。對(duì)轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行功能注釋發(fā)現(xiàn)這5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子屬于BPC、DOF、MADS和FLC家族，結(jié)合VlCKX5的表達(dá)量分析和轉(zhuǎn)錄因子熱圖（圖2-B，圖4-C），挑選出與VlCKX5表達(dá)趨勢(shì)同為下調(diào)的AGL6a作為關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

2.5 VlAGL6a的亞細(xì)胞定位及RT-qPCR

亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果顯示，101LYFP-VlAGL6a標(biāo)記的熒光與mcherry標(biāo)記的熒光在細(xì)胞核內(nèi)共定位（圖5-A）。RT-qPCR結(jié)果顯示，在巨峰葡萄的根、莖、葉、花序、幼果和卷須組織的表達(dá)模式中，VlAGL6a在花序中相對(duì)表達(dá)量最高，其次是在果實(shí)和卷須中，在根、莖和葉中的相對(duì)表達(dá)量最低（圖5-B）。CPPU處理后，VlAGL6a在1、2、4和8 d的表達(dá)量顯著降低（圖5-C）。

2.6 VlAGL6a與VlCKX5相互作用

在VlCKX5啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測(cè)出VlAGL6a的結(jié)合位點(diǎn)，標(biāo)記結(jié)合位點(diǎn)片段為P（圖6-A）。利用酵母單雜交技術(shù)，將P片段插入pAbAi載體并作為誘餌導(dǎo)入Y1HGold酵母菌株中。并將重組獵物質(zhì)粒pGADT7-VlAGL6a轉(zhuǎn)化到陽性酵母菌株（包含誘餌基因）中，以驗(yàn)證VlCKX5與VlAGL6a的相互作用。結(jié)果顯示只有同時(shí)含有pGADT7-VlAGL6a和pAbAi-proVlCKX5/P的酵母菌落才可以在濃度為400 ng·mL-1的AbA篩選培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而pGADT7-VlAGL6a和pAbAi-VlCKX5/P的酵母菌落400 ng·mL-1的AbA篩選培養(yǎng)基上不能正常生長(zhǎng)（圖6-B）。

為了進(jìn)一步研究VlAGL6a在調(diào)控VlCKX5表達(dá)中的功能，進(jìn)行了雙熒光素酶試驗(yàn)。構(gòu)建了雙熒光素酶載體（圖7-A）。設(shè)計(jì)了一個(gè)實(shí)驗(yàn)組：ProVlCKX5-LUC+35S-VlAGL6a，以及一個(gè)空白對(duì)照組：LUC0800+pSAK277。在煙草葉片中注入等量菌液瞬時(shí)表達(dá)，用LUC/REN比值計(jì)算熒光素酶的相對(duì)活性。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，35S-VlAGL6a試驗(yàn)組的LUC/REN比率顯著增加（圖7-B）。酵母單雜交和雙熒光素酶試驗(yàn)證明了VlAGL6a可以與VlCKX5啟動(dòng)子內(nèi)P段基序特異性結(jié)合，且VlAGL6a作為VlCKX5的正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)了VlCKX5基因的表達(dá)。

3 討 論

細(xì)胞分裂素是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的一類重要激素，可以促進(jìn)細(xì)胞分裂、調(diào)控根生長(zhǎng)、延緩葉片衰老和調(diào)節(jié)作物產(chǎn)量等[32]，CKXs可以通過切割不飽和的類異戊二烯側(cè)鏈促進(jìn)生物活性細(xì)胞分裂素的不可逆降解。筆者在本研究中對(duì)VlCKX5進(jìn)行生物信息學(xué)分析的結(jié)果顯示，VlCKX5具有黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）結(jié)合域和細(xì)胞分裂素結(jié)合位點(diǎn)（CK-binding），這與谷子[33]、白菜[34]、鴿豆[35]等CKX基因的研究結(jié)果相同，完全符合CKX基因的結(jié)構(gòu)特征。VlCKX5基因的特異性表達(dá)分析顯示，VlCKX5在巨峰葡萄的根、莖、葉、花序、果實(shí)和卷須中均能表達(dá)，其中VlCKX5基因在根和葉中相對(duì)表達(dá)量較高，在花序中的表達(dá)量次之，在莖和卷須中的表達(dá)量最低。VlCKX5的表達(dá)具有組織特異性，這說明VlCKX5可能在葡萄的營養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)過程中都發(fā)揮著重要作用。與此一致的是，在水稻中，OsCKX基因家族成員也表現(xiàn)出組織特異性的表達(dá)模式，其中OsCKX4在根部表達(dá)顯著，OsCKX9在葉片和腋芽中表達(dá)量較高，而OsCKX5則在所有檢測(cè)的組織中均表現(xiàn)出高水平的表達(dá)，ckx4和ckx9雙突變體會(huì)影響水稻的分蘗數(shù)和穗長(zhǎng)[36]。在本試驗(yàn)中，經(jīng)CPPU處理后，VlCKX5的表達(dá)量在1 d、2 d、4 d和8 d時(shí)均顯著降低，說明CPPU處理抑制了VlCKX5基因的表達(dá)，有研究發(fā)現(xiàn)CPPU可以抑制CKX的活性，是提高作物生產(chǎn)力的農(nóng)用制劑[37]。CKX基因?qū)φ{(diào)控植物產(chǎn)量發(fā)揮重要功能[38-39]。在大麥中沉默HvCKX1基因可降低細(xì)胞分裂素氧化酶/脫氫酶水平，提高植株產(chǎn)量[40]。在水稻中，降低OsCKX2的表達(dá)量會(huì)提高細(xì)胞分裂素在花序分生組織中積累從而提高籽粒產(chǎn)量[41]。在筆者課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)CPPU處理降低了葡萄內(nèi)源細(xì)胞分裂素含量并促進(jìn)葡萄坐果[30]，在擬南芥中過表達(dá)葡萄VlCKX4基因可促進(jìn)擬南芥坐果使角果數(shù)增多[42]。因此推測(cè)VlCKX5基因可能通過提高細(xì)胞分裂素水平促進(jìn)葡萄坐果，從而提高葡萄產(chǎn)量。

在基因表達(dá)的過程中，啟動(dòng)子是決定基因是否被轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)鍵因素之一。本研究中對(duì)VlCKX5啟動(dòng)子序列的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示VlCKX5啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件包含多種與生長(zhǎng)素、水楊酸和脫落酸相關(guān)的響應(yīng)元件。GUS染色試驗(yàn)結(jié)果顯示，IBA、SA、ABA和CPPU激素的處理都增強(qiáng)了VlCKX5啟動(dòng)子的活性，IBA、SA、ABA和CPPU激素可能串?dāng)_調(diào)控VlCKX5的表達(dá)，影響葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育。CKX可能是赤霉素/細(xì)胞分裂素串?dāng)_的一個(gè)重要環(huán)節(jié)[43]。BjuCKX基因具有生長(zhǎng)素、脫落酸、茉莉酸甲酯、乙烯和水楊酸的激素響應(yīng)元件，可以不同程度應(yīng)答激素[44]。細(xì)胞分裂素與脫落酸密切串?dāng)_，細(xì)胞分裂素水平及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)影響脫落酸依賴和脫落酸不依賴的途徑，使植物適應(yīng)不利條件[45]。綜上所述，VlCKX5可能受IBA、SA、ABA和CPPU激素的串?dāng)_影響參與到多種激素通路中發(fā)揮作用。

MADS-box基因編碼高度保守的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控花和果實(shí)發(fā)育過程[46]。有研究發(fā)現(xiàn)MADS-box基因的表達(dá)模式與指定功能之間存在密切的相關(guān)性[47]，而在本研究中VlAGL6a在葡萄花序中的相對(duì)表達(dá)量最高，其次是在果實(shí)和卷須中，在根、莖和葉組織中表達(dá)量極低，VlAGL6a可能在葡萄的生殖生長(zhǎng)中發(fā)揮重要作用。與此一致的是，AcMADS1啟動(dòng)子在番茄和擬南芥的花器官和果實(shí)發(fā)育中的高水平表達(dá)可能促進(jìn)花發(fā)育和果實(shí)成熟[48]，PeMADS5基因在花中高水平表達(dá)促進(jìn)了竹子開花[49]，TaAGL6在花器官開始分化時(shí)的穗中高表達(dá)，過表達(dá)TaAGL6會(huì)導(dǎo)致小麥小穗數(shù)和穗粒數(shù)增多[50]。酵母單雜交和雙熒光素酶分析結(jié)果顯示MADS-box轉(zhuǎn)錄因子VlAGL6a可以靶向VlCKX5促進(jìn)其表達(dá)。有研究表明MADS家族的FUL2和MBP20可以抑制CKX5/6/8基因的表達(dá)，從而促進(jìn)花分生組織中的細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)植物向生殖生長(zhǎng)過渡，進(jìn)而抑制番茄花序分枝[51]。TaMADS-GS蛋白會(huì)抑制TaCKX基因的表達(dá)使小麥籽粒發(fā)育早期的細(xì)胞分裂素含量維持在正常水平，促使籽粒正常發(fā)育[52]。因此推測(cè)VlAGL6a可以靶向VlCKX5通過調(diào)控細(xì)胞分裂素水平影響葡萄坐果。

4 結(jié) 論

VlCKX5基因編碼546個(gè)氨基酸，具有FAD和CK-bind的典型CKXs家族保守結(jié)構(gòu)域。VlCKX5具有組織表達(dá)特異性，在根和葉中高表達(dá)，其次是花序中。CPPU處理后VlCKX5的表達(dá)量顯著降低。外源CPPU處理可以激活VlCKX5啟動(dòng)子活性。轉(zhuǎn)錄因子VlAGL6a定位在細(xì)胞核中，在花序中高表達(dá)。CPPU處理后VlAGL6a的相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)，與VlCKX5的表達(dá)趨勢(shì)一致。進(jìn)一步研究證明，VlAGL6a可以與VlCKX5相互作用并促進(jìn)VlCKX5的表達(dá)，因此，VlAGL6a通過靶向VlCKX5調(diào)控細(xì)胞分裂素水平而影響葡萄坐果，為CPPU激素調(diào)控葡萄坐果提供了理論依據(jù)。

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