摘 要：本研究旨在了解汝南縣禽源致病性大腸桿菌（APEC）血清型和毒力基因分布情況，采集來自汝南縣部分家禽養(yǎng)殖場疑似感染APEC家禽的腦、心臟、肝臟等病料，利用細菌分離培養(yǎng)、血清型PCR和凝集試驗鑒定及毒力基因檢測。結(jié)果顯示，O1、O2、O18、O78血清型占比分別為43.2%、21.5%、15.8%、12.5%，其它血清型為7.0%。毒力基因iucD、tsh、iss、irp2檢出率較高，分別為100.0%、95.4%、87.1%、82.3%。所有菌株至少攜帶2種毒力因子，以攜帶3～5種最多。研究結(jié)果為開展汝南縣禽大腸桿菌病的防控提供參考。

關(guān)鍵詞：禽致病性大腸桿菌；PCR；血清型；毒力基因

中圖分類號：S858.31 文獻標(biāo)識碼：C 文章編號：1673-1085（2025）03-0022-05

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）屬于腸桿菌科的兼性厭氧、革蘭氏陰性菌，也是人類和動物正常腸道微生物群的重要成員，廣泛存在于環(huán)境中[1]。禽大腸桿菌病（ APEC）引起最典型的病變是氣囊炎、心包炎、肝周炎、漿膜炎、腹膜炎和敗血癥等[2]，由于高發(fā)病率和死亡率，APEC是造成家禽業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟損失的致病原因之一，也是人類公共衛(wèi)生的潛在風(fēng)險因素，因為APEC菌株大多屬于腸外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenic E. coli，ExPEC），可引起敗血癥、新生兒腦膜炎和尿路感染等感染[3]。

E.coli抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，血清型眾多，不同血清型之間缺乏交叉免疫保護；不同血清型菌株致病力存在差異，且不同地區(qū)、不同時期的E.coli菌株血清型種類也差別很大[4]。我國已發(fā)現(xiàn)50余種對禽致病的大腸桿菌血清型[5]，國外流行的血清型主要有O1、O2和O78[6]。研究表明，大腸桿菌的致病性并不只與血清型有關(guān)，毒力因子在決定其致病性方面也很重要[7]。APEC含有多種毒力因子，如菌毛、毒素、侵襲素、鐵攝取系統(tǒng)、溶血素和外膜蛋白等[8]，但APEC攜帶的毒力因子情況差異較大。因此，了解APEC血清型、毒力因子流行分布情況對于控制E.coli傳播、流行病學(xué)研究、疫病診斷、疫苗研制以及致病機制至關(guān)重要。

本研究通過采集河南省汝南縣部分蛋雞、肉雞、鴨和鵝養(yǎng)殖場的病料，分離鑒定出276株APEC菌株，進一步對分離菌進行血清型鑒定和毒力基因檢測，為有效防治禽致病性大腸桿菌病提供科學(xué)依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 病料來源" 2023年3月～2024年7月，在汝南縣部分蛋雞、肉雞、鴨和鵝養(yǎng)殖場無菌采集疑似感染APEC病死家禽腦、心臟、肝臟、腸道、脾臟等組織病料，裝入塑料自封袋，共1 274份。

1.2" 主要試劑和儀器" 麥康凱平板培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA" Marker 2 000、2×PCR Mix，購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；革蘭氏染液試劑盒（貨號：SP02274），購自南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司；大腸桿菌O1、O2和O78單因子血清，購自華南生物工程有限公司；梯度PCR儀（型號：OSE-GP-06），購自天根生化科技（北京）有限公司；一體式凝膠成像分析系統(tǒng)（型號：WD-9413B）、快速凝膠電泳儀（型號：DYCP-44P），購自北京六一生物科技有限公司。

1.3" 引物" 參考文獻[5，8-9]設(shè)計用于鑒定E.coli及其血清型特異性引物和8種毒力基因引物，引物委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物信息見表1。

1.4" APEC分離鑒定

使用接種環(huán)無菌挑取病料接種于麥康凱培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落形態(tài)。挑取亮紅色、圓形、表面光滑的菌落制作涂片、革蘭氏染色、鏡檢。將鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性菌的菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)18～24 h以增菌純化。以純化的增菌液為PCR擴增模板，利用E.coli特異性引物phoA-F/R進行PCR擴增反應(yīng)。PCR體系20 μL：菌液模板2 μL，2×PCR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，加入ddH2O補足至20 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性15 s，50 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸40 s，運行35個循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。取PCR擴增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測，使用一體式凝膠成像分析系統(tǒng)拍照記錄。

1.5" APEC血清型鑒定

采用PCR和傳統(tǒng)的血清凝集方法確定所有樣本的O血清型，參考文獻[9]采用PCR擴增方法鑒定APEC的O1、O2、O18、O78血清型，PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×PCR Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，分離菌DNA模板1.0 μL，加入ddH2O補足至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性35 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下觀察。再采用E.coli O抗原單因子血清玻片凝集試驗對PCR陽性菌株進行驗證。取純化培養(yǎng)的菌液10 mL，8 000 g離心5 min，棄上清，加入5 mL生理鹽水重懸，121 ℃高壓滅菌2 h，即為菌體O抗原。各取E.coli抗O多因子血清和菌體O抗原10 μL在玻片上進行凝集試驗，30 s內(nèi)凝集者為陽性。陽性者，再用該多因子血清對應(yīng)的單因子血清進一步進行玻片凝集試驗，以確定菌株的O血清型。同時，設(shè)菌體O抗原與生理鹽水混勻作為對照組，排除自凝現(xiàn)象。

1.6" APEC毒力基因檢測

參考孟慶美等[8]建立的多重PCR檢測方法并適當(dāng)修改，對8種毒力基因進行檢測。

2" 結(jié)果

2.1" APEC的分離鑒定

分離菌在麥康凱培養(yǎng)基中產(chǎn)生亮紅色、圓形、表面光滑的菌落，革蘭氏染色鏡檢可見分離菌為兩端鈍圓、無芽孢、散在或成對排列的陰性菌。PCR擴增獲得大小為761 bp左右的條帶，與預(yù)期相吻合（圖1）。根據(jù)細菌分離培養(yǎng)、菌體形態(tài)結(jié)果，結(jié)合PCR擴增結(jié)果，證實分離菌為APEC菌株，共分離到526株。

2.2" APEC的血清型鑒定

利用APEC的血清型特異性引物對分離菌株進行PCR（圖2），并對陽性菌株進行凝集試驗驗證，結(jié)果可知，526株APEC菌株血清型分布如下：O1、O2、O18、O78血清型占比分別為43.2%（227/526）、21.5%（113/526）、15.8%（83/526）、12.5%（66/526），其它血清型為7.0%（37/526）。

2.3" APEC毒力基因檢測

采用多重PCR方法對APEC的8種毒力基因檢測（圖3），結(jié)果顯示：iucD、tsh、iss、irp2檢出率較高，分別為100.0%（526/526）、95.4%（502/526）、87.1%（458/526）、82.3%（433/526），均高于80.0%；cva/cvi、aatA檢出率分別為43.7%（230/526）、37.3%（196/526），papC、vat檢出率相對較低，分別為9.9%（52/526）、7.6%（40/526）（圖4）。所有菌株至少攜帶2種毒力因子，最多達8種，以攜帶3～5種最多，占比82.9%（436/526）。

3" 討論

由APEC引起的禽大腸桿菌病是一種復(fù)雜的綜合性疾病，發(fā)病廣泛，對世界范圍內(nèi)的家禽業(yè)產(chǎn)生了不良的影響。本研究對來自河南省汝南縣部分家禽養(yǎng)殖場的1 274份病料，通過APEC的分離培養(yǎng)、鏡檢和PCR檢測，共獲得526株APEC菌株，檢出率為41.3%，表明汝南縣家禽感染APEC情況比較嚴(yán)重，威脅家禽養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。對鑒定菌株進一步進行血清型分析，發(fā)現(xiàn)流行血清型主要為O1、O2、O18、O78，其中優(yōu)勢血清型為O1，其次為O2、O18、O78，提示血清型種類較多給疫病防控帶來困難。區(qū)分致病性大腸桿菌菌株需要鑒定其所屬的血清型，與其他ExPEC相比，大多數(shù)APEC分離株可能是O1、O2、O18 和O78血清型[10]。國內(nèi)APEC血清型流行情況存在較大差異。Afayibo等[11]報道，中國東部APEC約80%屬于O1（12.17%）、O2（23.48%）和O78（44.78%）血清型，優(yōu)勢血清型為O78，與本研究結(jié)果一致。殷鶴予等[12]報道，河北省唐秦地區(qū)蛋雞APEC優(yōu)勢血清型為O2、O45、O78。劉伯承等[7]從湖南省部分地區(qū)APEC分離鑒定出15種血清型，其中O1、O2、O14、O78為優(yōu)勢血清型。不同地區(qū)禽致病性大腸桿菌血清型呈現(xiàn)多樣化，推測可能與其所處地區(qū)養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)環(huán)境、用藥習(xí)慣及疫苗防控等有關(guān)，提示應(yīng)在掌握當(dāng)?shù)匮逍土餍刑攸c基礎(chǔ)上有針對性地制定防控措施，以提高防治效果。

毒力基因主要是由細菌、真菌、原生動物和病毒產(chǎn)生和釋放的蛋白質(zhì)。不同毒力因子在APEC感染宿主過程中發(fā)揮不同的作用機制，破壞宿主免疫系統(tǒng)，引起宿主炎癥反應(yīng)。研究APEC毒力基因攜帶情況有助于了解其致病力和致病機制。papC、iucD、irp2、tsh、vat、astA、iss、cva/cvi等8個毒力基因是禽源大腸桿菌致病性的關(guān)鍵[13]。這些毒力基因可能通過促進大腸桿菌的入侵、定植和粘附，保護大腸桿菌免受宿主防御的攻擊，從而對致病性大腸桿菌菌株起保護作用[14]。多項研究表明，APEC可能通過增強cva / cvi、iss、tsh、irp2等多種基因編碼的毒力因子的致病性而引起大腸桿菌病[11]。本研究對526株APEC相關(guān)毒力基因檢測，結(jié)果顯示均檢出8種毒力基因，其中iucD、tsh、iss、irp2檢出率較高，攜帶毒力基因種類在2～8種之間。禽源大腸桿菌的致病性與其所攜帶的毒力基因數(shù)量之間呈正相關(guān)[15]，研究結(jié)果表明，汝南縣APEC毒力基因譜分布廣泛，致病性強，這是導(dǎo)致家禽發(fā)病率和死亡率升高的原因之一。本研究與劉璨穎等[13]對廣東省佛山市禽源致病性大腸桿菌毒力因子攜帶情況調(diào)查結(jié)果基本一致。從已有眾多報道看[5，7，12，16]，不同地區(qū)的大腸桿菌毒力因子也有較大的差異。只有了解本地區(qū)禽源APEC毒力基因分布情況，才能正確判斷本地APEC致病力。本研究只對APEC的8種毒力基因檢測，盡管不夠全面，但在一定程度反映了汝南縣禽源大腸桿菌病毒力因子流行特點，為今后疫病防控和疫苗研制提供基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)支撐。

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