關(guān)鍵詞：煙草；HSP70熱激蛋白：生物信息學(xué)；溫度脅迫；基因表達(dá)

中圖分類號：S572：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2025）02-0022-07

煙草（Nicotiana tabacum）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物。從大田中收獲的新鮮煙葉要成為可利用的具有優(yōu)良品質(zhì)的商品煙葉，必須經(jīng)過合理的烘烤，而烘烤特性的好壞直接決定其經(jīng)濟(jì)價值的高低?？緹熒喜咳~組織結(jié)構(gòu)致密，水分含量少，導(dǎo)致色素降解較慢且降解不完全。生產(chǎn)上一般通過延長烘烤時間或者升高烘烤溫度來使色素降解完全，但延長烘烤時間和提高溫度會導(dǎo)致煙葉細(xì)胞破裂，內(nèi)含物流出并附著在煙葉上面，造成熱掛灰現(xiàn)象，給烤后產(chǎn)量、品質(zhì)帶來極為不利的影響。因此，如何提高煙葉細(xì)胞在烘烤過程中的穩(wěn)定性至關(guān)重要。HSP70是熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）家族的重要成員，廣泛存在于植物細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體等組織中，其表達(dá)水平在溫度或其他脅迫條件刺激下會迅速增強(qiáng)，以使細(xì)胞免受脅迫和修復(fù)脅迫造成的傷害。HSP能夠提高植物耐熱性，一方面是通過增強(qiáng)HSP在生物膜上的富集防止膜脂受熱變性，從而增強(qiáng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；另一方面是通過對變性蛋白的重組裝或折疊減少蛋白變性或修復(fù)已受損的蛋白，從而維持細(xì)胞的穩(wěn)定性。

HSP70-2是HSP70家族的成員之一，在辣椒、馬鈴薯上的研究表明其有響應(yīng)溫度脅迫的功能，但在煙草上還未見相關(guān)研究報道。為明確HSP70-2在煙草上是否有響應(yīng)溫度脅迫的功能，以及與溫度脅迫的關(guān)系，本研究通過生物信息學(xué)分析對NtHSP70-2基因的生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測，同時進(jìn)行高溫和低溫脅迫處理，分析其表達(dá)量變化，明確溫度脅迫與NtHSP70-2表達(dá)的關(guān)系，以期為后續(xù)應(yīng)用于提高煙葉細(xì)胞在烘烤過程中的穩(wěn)定性奠定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料種植與脅迫處理

供試煙草品種為K326。選取籽粒飽滿的種子，于2023年3月28日在育苗盤中播種，5月22日煙苗長至六葉一心時移栽入人工氣候培養(yǎng)箱進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為光照12h、晝夜溫度28/15℃。移栽4d后進(jìn)行溫度脅迫處理，設(shè)置高溫38℃、低溫4℃，并于脅迫2、12、24h時對其根、莖、葉進(jìn)行取樣保存，以不脅迫（0h）樣品為對照（CK）。本實驗所需材料及場地均由貴州省煙草品質(zhì)研究重點實驗室提供。

1.2實驗方法

1.2.1 NtHSP70-2基因的克隆 對K326煙葉進(jìn)行RNA提取，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，并以該cDNA為模板。利用SnapGene軟件設(shè)計引物5’-ATGGC-CGGGAAAGGAGAAGG-3’、5’-TTAGTCCACCTC-CTCAATCTTAGGACC-3’，引物合成委托擎科生物公司進(jìn)行。參照文獻(xiàn)[17]的方法克隆NtHSP70-2基因的CDS序列。

1.2.2 NtHSP70-2基因生物信息學(xué)分析 NtH-SP70-2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位、跨膜預(yù)測、啟動子作用元件分析利用在線網(wǎng)站進(jìn)行，具體信息見表1。

1.2.3 NtHSP70-2基因表達(dá)量測定 采用TriZol法對采集的煙苗各部位樣品進(jìn)行RNA提取，參照RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN）的操作步驟進(jìn)行。使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（TIANGEN）反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，所有操作步驟均在冰上完成，以防止RNA降解。利用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）測定NtHSP70-2的表達(dá)量，每個樣品3次重復(fù)。使用的引物以及PCR反應(yīng)體系分別見表2、表3。PCR反應(yīng)程序為：94℃3min;95℃5s，56.9℃10s，72℃15s，40個循環(huán)。以L25基因作為內(nèi)參基因，計算Ct值，然后采用2-^ΔΔCt法計算基因相對表達(dá)量。每個樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

2結(jié)果與分析

2.1 NtHSP70-2基因的克隆

NtHSP70-2基因的CDS開放閱讀框長度為1947bp，編碼648個氨基酸。運(yùn)用NCBI設(shè)計引物，以煙草品種K326 cDNA為模板擴(kuò)增CDS目標(biāo)片段，進(jìn)行膠回收后連接感受態(tài)，涂板篩選陽性克隆，測序發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的目標(biāo)片段與NCBI數(shù)據(jù)庫下載的目標(biāo)序列一致（圖1）。

2.2 NtHSP70-2基因生物信息學(xué)分析

2.2.1NtHSP70-2編碼蛋白的理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位分析利用ProtParam在線網(wǎng)站分析Nt HSP70-2基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果（表4）顯示，NtH-SP70-2蛋白的分子式為C₃₁₁₅H₅₀₁₂N₈₆₀O₉₉₁S₂₃，分子量為71.10 kDa，理論等電點（pI）為5.13，脂肪系數(shù)為83.13，為穩(wěn)定性蛋白。氨基酸成分分析結(jié)果（表5）表明，其富含酸性氨基酸（ Asp+Glu，100個）和強(qiáng)堿性氨基酸（Arg+Lys，82個）；丙氨酸（Ala）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、賴氨酸（Lys）含量較高，分別為8.9%、8.3%、8.2%、8.2%，色氨酸（Trp）、組氨酸（His）含量較低，分別為0.5%和0.8%。蛋白親疏水性預(yù)測表明，平均親水性指數(shù)為-0.403，且在氨基酸組成上也是親水性氨基酸的數(shù)量多于疏水性氨基酸，因此該蛋白為親水性蛋白。

亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，NtHSP70-2蛋白定位于線粒體中（表4），屬于線粒體sHSP。線粒體sHSP在非生物脅迫下通?？梢灾亟M裝受損蛋白，以此對細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

2.2.2 NtHSP70-2蛋白結(jié)構(gòu)分析 采用HMME數(shù)據(jù)庫對NtHSP70-2保守結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：NtHSP70-2不存在跨膜結(jié)構(gòu)域；只有一個保守結(jié)構(gòu)域（圖2A），位于第9位至第618位氨基酸，而且在第521位到第541位氨基酸間存在卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，屬于HSP70超家族。

利用PRABI對NtHSP70-2蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測，結(jié)果（圖2B）發(fā)現(xiàn)該蛋白二級結(jié)構(gòu)包含α-螺旋（alpha helix）、無規(guī)卷曲（random coil）、延伸鏈（extended strand）和β-轉(zhuǎn)角（betaturn），分別占42.59%、31.64%、18.21和7.56%。利用UNIPROT對NtHSP70-2三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2C所示，表明該蛋白與辣椒CaHSP70-2蛋白結(jié)構(gòu)相似，推測其與CaHSP70-2有相似的功能。

2.2.3 NtHSP70-2基因啟動子順式作用元件分析 啟動子元件是影響基因表達(dá)的重要因素之一，對啟動子元件進(jìn)行分析有助于挖掘基因的功能和表達(dá)調(diào)控機(jī)制。通過PlantCARE數(shù)據(jù)庫，對NtHSP70-2基因起始密碼子上游2000bp啟動子序列進(jìn)行分析，結(jié)果（表6）表明，Nt HSP70-2基因啟動子序列除含有TATA-Box、CCAAT基本元件外，還存在非生物脅迫響應(yīng)元件和激素響應(yīng)元件，包括赤霉素響應(yīng)元件（P-box）、茉莉酸響應(yīng)元件（CGTCA-motif）、脫落酸反應(yīng)性作用元件（ABRE）、應(yīng)激響應(yīng)元件（STER）、干旱響應(yīng)相關(guān)元件（MYB），以及響應(yīng)低溫、高鹽、干旱脅迫的順式作用元件（DRE core）和響應(yīng)逆境脅迫的元件（MYB-like sequence）。其中STER、ABRE、DREcore、MYB-like sequence、CGTCA-motif等順式作用元件都可以響應(yīng)溫度脅迫，因此推測NtHSP70-2基因可以響應(yīng)溫度脅迫。

2.2.4 NtHSP70-2蛋白同源序列比對 煙草是茄科作物，因此我們從茄科作物數(shù)據(jù)庫下載了辣椒、番茄、茄子、馬鈴薯的HSP70-2蛋白序列，利用DNAMAN將煙草NtHSP70-2與這些作物的HSP70-2蛋白進(jìn)行同源序列比對，結(jié)果（圖3）表明，NtHSP70-2序列與辣椒、馬鈴薯、番茄、茄子的HSP70-2序列相似度分別為94.70%、94.70%、93.75%、94.40%，相似性較高，推測它們可能有著相似的功能。

2.3不同溫度脅迫下NtHSP70-2基因的組織表達(dá)分析

對高溫和低溫脅迫下煙苗根、莖、葉中Nt H-SP70-2的相對表達(dá)量進(jìn)行測定，結(jié)果（圖4）表明：NtHSP70-2基因在煙苗根、莖、葉中均有表達(dá)，葉中的表達(dá)量最高，其次是莖，根中的表達(dá)量最低：38℃高溫和4℃低溫脅迫均能誘導(dǎo)NtH-SP70-2上調(diào)表達(dá)，且在根、莖、葉中的變化趨勢一致，均在處理12h時達(dá)到最高，且高溫脅迫下的上調(diào)幅度高于低溫脅迫。推測NtHSP70-2基因可能在提高煙草耐熱性和抗寒性方面發(fā)揮重要作用。

3討論與結(jié)論

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙草產(chǎn)業(yè)在我國國民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)重要地位。在實際生產(chǎn)中，由于上部煙葉組織結(jié)構(gòu)致密，烘烤過程中常常出現(xiàn)色素降解不完全的現(xiàn)象，而采用傳統(tǒng)延長烘烤時間或者升高溫度的方法又會導(dǎo)致細(xì)胞破裂而形成掛灰煙。因此，提高煙葉對溫度的耐受性對其烤后品質(zhì)與產(chǎn)量的提高有著重要的意義。

HSP70廣泛存在于植物中，現(xiàn)已在擬南芥中鑒定出19個HSP70家族成員，在玉米中鑒定出32個HSP70家族成員，在煙草中鑒定出61個HSP70家族成員。通過對這些物種HSP70成員的鑒定發(fā)現(xiàn)，它們大多屬于酸性蛋白質(zhì)，定位于細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、葉綠體、線粒體中，啟動子區(qū)都有響應(yīng)溫度脅迫的順勢作用元件STER、ABRE、DRE core、MYB-like等。本研究也發(fā)現(xiàn)NtHSP70-2是酸性蛋白，定位于線粒體中，啟動子區(qū)包含STER、ABRE、DRE core、MYB-like sequence等順式作用元件，說明NtHSP70-2可能也具有響應(yīng)溫度脅迫的功能；同源序列比對結(jié)果表明，NtHSP70-2與同屬茄科的辣椒、馬鈴薯、番茄、茄子HSP70-2序列相似性較高，相似度在93.75%～94.70%之間。前人對番茄、茄子的研究已發(fā)現(xiàn)HSP70具有響應(yīng)溫度脅迫的功能，因此推測NtHSP70可能也在提高煙草對溫度脅迫的耐受性上發(fā)揮重要作用。

前人研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下，百合LIHSP70表達(dá)量迅速增加，可以提高植株對高溫的耐受性；對萵苣幼苗進(jìn)行高溫脅迫，其Hsp70表達(dá)量迅速增加；低溫脅迫下，小桐子JcHsp70s基因表達(dá)量顯著上升，脅迫48h后JcHsp70-8、JcH-sp70-15基因表達(dá)量相較于24h時有所下降；蠟梅花E-CpHSP70-1基因過表達(dá)可提高蠟梅植株的耐熱性；熱和冷脅迫均可以提高玉米HSP70基因表達(dá)量。本研究結(jié)果表明，38℃高溫和4℃低溫脅迫下，煙草根、莖、葉中的NtH-SP70-2基因表達(dá)量迅速增加，在處理12h時達(dá)到最高，之后有所降低，總體趨勢與前人研究一致，但表達(dá)量達(dá)到最高的時間點與前人研究不一致，這可能是不同作物HSP基因間的差異造成的。

綜合來看，NtHSP70-2蛋白是酸性穩(wěn)定蛋白，定位于線粒體，不存在跨膜結(jié)構(gòu)；NtHSP70-2啟動子區(qū)含有多種溫度響應(yīng)順式元件，而且在煙苗根、莖、葉中的表達(dá)均受高、低溫脅迫誘導(dǎo)上調(diào)，推測其可以響應(yīng)溫度脅迫，有助于提高煙草對溫度脅迫的耐受性。另外，田間收獲的煙葉需要烘烤才能發(fā)揮商品屬性，而烘烤特性反映的是烘烤過程中煙葉水分和色素的變化。HSP70在其他作物上有調(diào)控水分和色素的功能，NtH-SP70-2基因能夠響應(yīng)溫度脅迫，其是否也具有調(diào)控?zé)熑~烘烤過程中色素與水分變化的功能，后續(xù)可通過創(chuàng)制該基因過表達(dá)和敲除突變體來進(jìn)一步驗證。