陳余朋 張 聲 鄭 珂 陳 虹 王 密

[摘要] 目的 探討腎臟穿刺活檢標(biāo)本免疫熒光染色制作方法及意義。方法 采用直接法檢測1006例腎臟穿刺活檢組織IgG、IgA、IgM、C3、Fib、C1q免疫熒光染色;其中150例采用間接法檢測HBsAg、HBcAg免疫熒光染色。結(jié)果 在熒光顯微鏡下觀察熒光附著部位與強度(-～++++),對照片陰性。免疫沉積物定位準(zhǔn)確、清晰、靈敏度高、特異性強,結(jié)果易于判斷。結(jié)論 直接免疫熒光染色法染色步驟簡單,對熒光標(biāo)記物的分布部位、分布形式、熒光強度顯示極為明確,可提高各種免疫腎病的檢出率,為國際上公認(rèn)的腎活檢病理診斷和研究的重要染色手段,值得推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞] 腎臟; 穿刺; 活檢標(biāo)本; 免疫熒光

[中圖分類號] R692 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701(2009)33-154-02

免疫熒光技術(shù)對腎臟疾病的診斷及其分類具有極其重要的作用,在腎活檢病理診斷中的地位是其他組織化學(xué)、電子顯微鏡檢查等無法替代的。應(yīng)用冰凍切片進行直接免疫熒光檢查,被認(rèn)為是腎活檢免疫病理檢查的重要方法[1-3]。我科從2002年8月～2009年6月行1006例腎穿活檢免疫熒光染色,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎臟穿刺活檢組織,恒溫冷凍切片,3～4μm厚,備用。

1.2 試劑

①直接法兔抗人熒光抗體IgG(1︰50)、IgA(1︰40)、IgM (1︰40)、C3(1︰40)、Fib(1︰40)、C1q(1︰40);間接法第一抗體鼠抗人HBsAg(1︰50),第二抗體為FITC標(biāo)記抗鼠熒光抗體(1︰75);間接法第一抗體兔抗人HBcAg(1︰50),第二抗體為FITC標(biāo)記抗兔熒光抗體(1︰75)。購自DAKO公司。②Polyclonal Rabbit Albumin/FITC(1:50)購自DAKO公司。③0.01mol/L(PH 7.2～7.4)PBS。④抗體稀釋液(S3022DAKO公司)。⑤緩沖甘油:1份0.1mol/L(PH 8.0)PBS與9份甘油混勻。

1.3 儀器

Leica CM3050冷凍切片機,Olympus BX61熒光顯微鏡+ DP70數(shù)碼攝像。

1.4染色步驟

直接法檢測IgG、IgA、IgM、C3、Fib、C1q。①腎組織冷凍切片在室溫下稍風(fēng)干后,在室溫下用冷丙酮固定10min。②PBS沖洗2×3min。③滴加兔抗人的熒光抗體IgG、IgA、IgM、C3、Fib、C1q,設(shè)立Albumin作對照排除。④室溫下避光孵育40min。⑤PBS沖洗2次×3min。⑥緩沖甘油封片。

間接法檢測HBsAg、HBcAg步驟,①～⑤同直接法。⑥分別滴加FITC標(biāo)記抗鼠熒光抗體和FITC標(biāo)記抗兔熒光抗體。⑦室溫下孵育30min。⑧下同直接法⑤～⑥。

2 結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察腎組織熒光附著部位與強度。陽性染色呈顆粒狀或團塊狀或線狀翠綠色沉積[1]。對照片陰性。強度分為6級:-:陰性;±:高倍鏡下隱約可見;+:低倍鏡下隱約可見,高倍鏡下可見;++:低倍鏡下可見,高倍鏡下清晰可見;+++:低倍鏡下清晰可見,高倍鏡下耀眼;++++:低倍鏡下耀眼,高倍鏡下刺眼。免疫沉積物定位準(zhǔn)確、清晰、靈敏度高、特異性強,結(jié)果易于判斷。如圖1～4。

3 討論

腎穿刺活檢組織冷凍切片免疫熒光染色特異性強、敏感性高,染色步驟簡單,節(jié)省時間,定位準(zhǔn)確,強度易于判讀,是一種最簡便、快速的方法[2]。直接法:用已知特異性抗體與熒光素結(jié)合,制成特異熒光抗體,直接用于細(xì)胞或組織抗原的檢查。此法特異性高,缺點是一種熒光抗體只能檢查一種抗原,敏感性差,但此法非常實用,應(yīng)用也廣泛。間接法:先用特異性抗體與細(xì)胞標(biāo)本反應(yīng),隨后用PBS洗去未結(jié)合的抗體,再用間接熒光抗體與結(jié)合在抗原上的抗體結(jié)合,形成抗原-抗體-熒光抗體的復(fù)合物。由于結(jié)合在抗原-抗體復(fù)合物上的熒光抗體顯著多于直接法,從而提高了敏感性[4]。

免疫熒光染色受到固定劑、溫度、時間、抗體效價等很多因素的影響[3-8] 。因此,在實際工作中應(yīng)注意以下幾點:(1)將取好的新鮮腎組織不經(jīng)任何處理置于少許浸濕生理鹽水的紗布上放入Ependorf管內(nèi)后轉(zhuǎn)入含有冰袋的保溫箱內(nèi)保存(或者冰壺),并盡快送檢,避免組織干涸,并且以不超過24h檢查為宜,保持抗原的活性。(2)臨床醫(yī)生取得腎組織后迅速在放大鏡下觀察,切割腎皮質(zhì)3～4mm,確保組織中含有腎小球。(3)臨床處理標(biāo)本時應(yīng)避免固定液交叉腐蝕熒光組織,防止出現(xiàn)假陰性。(4)如果不能馬上切片,短時間內(nèi)可將標(biāo)本置4℃冰箱內(nèi)保存,較長時間應(yīng)置于-70℃低溫冰箱內(nèi),以保持抗原活性,防止抗原移位或丟失,但在低溫冰箱中放置的時間不宜超過2d。(5)冷凍切片方法:將OCT包埋劑滴到金屬支持器上,待其凝固后修平,將細(xì)條狀腎組織放平,并在周圍滴上少量的OCT,冷凍后切片,厚約3～4μm,將腎組織旁邊的多余OCT用刀片修去,有利于切片。(6)加抗體前,先切片一張預(yù)染HE,看是否有腎小球,如無腎小球?qū)⒂绊懡Y(jié)果判定。(7)對新購買的熒光抗體,應(yīng)根據(jù)說明書進行預(yù)實驗,確定工作濃度。(8)抗體應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配,因為稀釋后的溶液中抗體及酶的有效活性會很快降低。(9)熒光抗體的保存,以0～4℃保存,防止抗體活性降低和蛋白變性。(10)用抗體稀釋液(S3022DAKO公司)稀釋抗體,可以減少背景染色。(11)濕盒內(nèi)加入適量的蒸餾水,以防止染色過程切片干燥。(12)用Polyclonal Rabbit Albumin/FITC作對照,目的是非特異性熒光染色可通過此對照進行鑒別與排除。(13)抗體孵育要避光,以保證熒光不易淬滅。(14)觀察結(jié)果,最好在暗室觀察,在有光線環(huán)境,熒光比較容易淬滅。(15)技術(shù)員應(yīng)掌握熒光觀察方法,并與醫(yī)生很好地溝通,發(fā)現(xiàn)不足,及時糾正,做好室內(nèi)質(zhì)控。

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(收稿日期:2009-06-18)