魏兵強

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，甘肅蘭州，730070）

無選擇標記轉(zhuǎn)基因植物研究進展

魏兵強

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學院蔬菜研究所，甘肅蘭州，730070）

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的誕生，轉(zhuǎn)基因植物中選擇標記基因的安全性已受到了廣泛的關(guān)注，如何培育無選擇標記基因轉(zhuǎn)基因植物已成為基因工程研究的重點。主要綜述了幾種培育無選擇標記轉(zhuǎn)基因植物的原理及其國內(nèi)外研究進展。

無選擇標記 轉(zhuǎn)基因 植物

1 前言

轉(zhuǎn)基因植物的安全性已經(jīng)引起了社會的普遍關(guān)注與爭論，因為在植物的遺傳轉(zhuǎn)化過程中需要借助選擇標記基因的功能篩選轉(zhuǎn)化體，而選擇標記基因一般是一些抗生素抗性基因和抗除草劑基因，這些基因在轉(zhuǎn)化成功后會長期存在于轉(zhuǎn)基因植物中，因此，對轉(zhuǎn)基因技術(shù)持反對態(tài)度的學者擔心[1～2]∶第一，人們在食用了轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品后，抗性標記基因是否會水平轉(zhuǎn)移到腸道微生物體內(nèi)或上皮細胞中，從而降低抗生素在臨床中的有效性；第二，標記基因可能會轉(zhuǎn)移到雜草和其他物種上而產(chǎn)生所謂“超級雜草”和超級病蟲害，或打破原有生態(tài)平衡，造成生態(tài)失衡。對于轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身而言，標記基因與目的基因一般由同一種啟動子驅(qū)動，它的存在可能會導致目的基因的沉默或失活；而且轉(zhuǎn)基因過程中所用的標記基因數(shù)量有限，由于標記基因的存在，若要對已轉(zhuǎn)化的植株進行再轉(zhuǎn)化，篩選也是一個困難；標記基因的存在增加了轉(zhuǎn)基因植物基因組的大小，不利于轉(zhuǎn)基因植物的遺傳穩(wěn)定性。由此可見，選擇標記基因的存在嚴重地阻礙了轉(zhuǎn)基因植物的商品化進程和轉(zhuǎn)化技術(shù)本身的有效性，因此，怎樣培育無選擇標記轉(zhuǎn)基因作物已成為近年來植物基因工程研究的重點之一。迄今已有多種方法應用于無選擇標記轉(zhuǎn)基因植物的培育上。

2 培育無選擇標記轉(zhuǎn)基因植物的方法

2.1 同源重組法

同源重組依賴于大范圍的DNA同源序列的聯(lián)會。只要兩條DNA序列相同或相近，重組就可以在此序列中的任何一點發(fā)生。重組以后，DNA同源序列間的DNA片段可以被切除。將標記基因放在兩個DNA同源序列之間，發(fā)生同源重組后，標記基因可以被切除，這樣的細胞經(jīng)過再生，可以得到無選擇標記基因植株。同源重組頻率在細胞核中一般來說比較低，唯一利用同源重組切除核基因組中標記基因的報道是在轉(zhuǎn)基因植物的組織培養(yǎng)時期切除標記基因[3]，這一過程需要兩輪連續(xù)的篩選，而且總的效率小于1%。但在葉綠體中的重組頻率很高，去除標記基因的頻率可達5%。因此同源序列重組在葉綠體轉(zhuǎn)基因去除標記基因方面有很大的應用潛力，所以這一方法最近已被用于從葉綠體基因組中切除標記基因。

2.2 特異性重組法

位點特異性重組技術(shù)是通過對DNA的特定序列進行準確切割和重新連接，從而在基因或染色體上對生物進行遺傳改造的一種技術(shù)。它具有重組位點特異性、重組保守性及重組鏈的交換發(fā)生在重組位點的小片段同源序列之間等特點。位點特異性重組系統(tǒng)已經(jīng)逐漸在生命科學中被應用，成為遺傳操作的一種重要工具，在外源基因定點整合、基因剔除、基因誘變及基因克隆等方面得到應用。常用的位點特異性重組系統(tǒng)有Cre/loxP，F(xiàn)LP/FRT，R/RS和I/SceI等[4～5]。目前在植物無選擇標記遺傳轉(zhuǎn)化中應用最為廣泛的是來源于大腸桿菌P1噬菌體的Cre/ IoxP系統(tǒng)。位點特異重組系統(tǒng)均由一個重組酶和一個相應的特異識別序列組成。重組酶專一性地識別并介導兩個同向特異識別序列發(fā)生重組，形成環(huán)狀DNA并脫離染色體。利用位點特異性重組系統(tǒng)剔除選擇標記基因正是基于這一原理。將選擇標記基因構(gòu)建在兩個同向位點特異性重組序列的中間，然后待選擇標記基因完成轉(zhuǎn)化選擇與篩選的任務(wù)后，再利用重組酶介導位點特異性重組序列間發(fā)生重組，從而剔除選擇標記基因。

Dale等[6]（1991）首次利用位點特異性重組系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物中剔除了選擇標記基因。Rusell等[7]（1992）利用本法獲得了以uidA為目的基因轉(zhuǎn)化煙草，Southern雜交結(jié)果證實選擇標記基因已被Cre酶去除。

早期的這些研究通過二次轉(zhuǎn)化或有性雜交引入重組酶，但這兩種方法均需要通過自交分離進一步去掉重組酶基因及轉(zhuǎn)化重組酶基因所帶入的另一個選擇標記基因，使得無選擇標記基因轉(zhuǎn)基因作物的選育過于復雜，周期過長，同時也不適用于無性繁殖作物，如木本植物等的繁育。通過構(gòu)建誘導型表達載體可以在一定程度上克服位點特異性重組系統(tǒng)去除標記基因存在的問題。此類方法利用化學介導的啟動子或反式作用因子控制重組酶表達，可以一次性將目的基因、選擇標記基因和重組酶基因轉(zhuǎn)入受體植物中，然后在適當?shù)臅r候誘導重組酶表達，進而去除選擇標記基因和重組酶本身。該方法簡化了無選擇標記轉(zhuǎn)基因作物的培育程序。Jianru等（2001）構(gòu)建了一個化學誘導型的載體轉(zhuǎn)化擬南芥。選擇標記基因、cre和xve處于兩個loxP位點之間，Cre可以由雌激素受體XVE蛋白控制表達，在雌二醇的誘導下，選擇標記基因、cre和xve被有效剪切，導致下游gfp基因的表達[8]。遺傳分析表明，由此系統(tǒng)剔除標記基因可控度高，對無性和有性繁殖的作物產(chǎn)生無選擇標記的轉(zhuǎn)基因植株均適合。

2.3 共轉(zhuǎn)化法

將目的基因和選擇標記基因分別裝載到兩個不同的T-DNA上，然后通過農(nóng)桿菌進行轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化過程中T-DNA會隨機地整合到基因組的不同位點上，當目的基因與標記基因插入到染色體的不同位點上時，通過有性雜交（自交），使目的基因與標記基因在后代發(fā)生分離，進而選擇出不含標記基因的轉(zhuǎn)基因植株。

Park等[9]將codA和nptⅡ基因插入雙價載體pNC上，把報告基因gus插入另一個雙價載體pHG上，然后把這兩個雙價載體分別裝載到兩個農(nóng)桿菌菌株LBA4404中進行共轉(zhuǎn)化煙草，獲得了54%的共轉(zhuǎn)化率。魏兵強等[10]構(gòu)建了甜瓜反義ACC氧化酶混合菌株共轉(zhuǎn)化載體，在對煙草的共轉(zhuǎn)化試驗中，獲得了35%的共轉(zhuǎn)化率，目前正在進行目的基因和選擇標記基因的分離研究。

2.4 轉(zhuǎn)座子法

轉(zhuǎn)座子是指能在生物細胞中從同一條染色體的一個位點轉(zhuǎn)移到另一個位點或從一條染色體轉(zhuǎn)移到另一條染色體上的一段特殊的DNA序列。目前已明確原核生物和真核生物都有轉(zhuǎn)座子。常用的轉(zhuǎn)座子主要有Ac/Ds和Spm/dspm兩個轉(zhuǎn)座子家族[11]。Ac/Ds家族轉(zhuǎn)座子來源于玉米，是植物基因分離研究中最常用、最典型的啟動子。其中轉(zhuǎn)座酶基因和反向重復末端對轉(zhuǎn)座功能是必須的，兩個成分可以分開。Ac是自主性轉(zhuǎn)座子，Ds因缺乏轉(zhuǎn)座酶活性而不能自主轉(zhuǎn)座。在Ac/Ds系統(tǒng)中，Ac存在時，Ds可被反式激活?？寺≡贒s反向重復序列之間的DNA序列在有轉(zhuǎn)座酶存在的情況下，可以被轉(zhuǎn)移到基因組新的遺傳座位[12]，這一特性是轉(zhuǎn)座子成分刪除選擇標記基因的基本原理。

轉(zhuǎn)座子可以插入宿主染色體的任意位置，而且在很多情況下轉(zhuǎn)座子從原來位點刪除下來之后，不能再重新插入。所以一開始，選擇標記基因被構(gòu)建在Ac序列之間，標記基因隨著轉(zhuǎn)座的發(fā)生而被刪除。Ebinuma等將ipt基因作為選擇標記基因插入Ac轉(zhuǎn)座元件，在轉(zhuǎn)座元件被剪切下來但沒有重新插入的情況下，不經(jīng)后代分離就可以得到去除選擇標記基因的轉(zhuǎn)基因煙草和白楊[13]。

轉(zhuǎn)座子介導的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)點是其轉(zhuǎn)座子流動性的特點有利于目的基因的插入和轉(zhuǎn)化，同時可以消除轉(zhuǎn)基因植株中的選擇標記基因，從而確保轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性，因此這是遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)上的一個新策略。

3 小結(jié)

以上是目前培育無選擇標記轉(zhuǎn)基因植物的主要方法，其中同源重組法和位點特異性重組法是借助重組作用使標記基因缺失，達到切除標記基因的效果，而轉(zhuǎn)座子和共轉(zhuǎn)化法是將標記基因和外源基因整合在不同的位置上，兩者在其后代的植株的減數(shù)分裂及受精的過程中可以被分開，從而可篩選到?jīng)]有標記基因的安全的轉(zhuǎn)基因作物中。這四種方法各有利弊，選擇何種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)要視具體情況而定。

總之，隨著后基因組時代的到來，各種功能基因?qū)⒈粦糜谥参锏倪z傳轉(zhuǎn)化中，而無選擇標記轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展將會消除轉(zhuǎn)基因食品對人類健康和環(huán)境安全等方面造成的隱患，加速轉(zhuǎn)基因作物的推廣應用，造福人類。

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Progress of Selectable Marker-free Transgenic Plant

WEI Bingqiang
(Vegetable Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070)

With the development of transgenic crops,the security of selectable marker gene in transgenic crops has been concerned extensively,and how to culture the selectable marker-free transgenic plants has become the emphasis of transgenic engineering.Some principle and overseas or domestic progress of culturing the selectable marker-free transgenic plant were surmmarized.

Selectable marker-free;Transgenic;Plant

10.3865/j.issn.1001-3547.2009.10.002

魏兵強（1980-），男，碩士，研究實習員，主要從事蔬菜生物技術(shù)及育種研究

2008-11-17