王曉南　王麗環(huán)　高　鵬

摘 要：動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基相比天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基等傳統(tǒng)培養(yǎng)基有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，其組成成分相對(duì)清楚，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，日益得到生物技術(shù)界的重視。運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，可科學(xué)有效地考察細(xì)胞培養(yǎng)基中多因素、多水平間的交互作用。應(yīng)用新型蛋白質(zhì)組分分析技術(shù)及生物芯片技術(shù)定位胞漿信號(hào)通路相關(guān)蛋白、膜表面的生長(zhǎng)因子受體、激素受體、細(xì)胞因子受體、粘附分子等，用以確定細(xì)胞培養(yǎng)基中調(diào)控分子的添加組合。對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)及常用的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行概述。以期為動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的研究與研制提供參考。

關(guān)鍵詞：動(dòng)物細(xì)胞；無(wú)血清培養(yǎng)基；實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

中圖分類號(hào)：R-332文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1673-2197（2009）02-0021-03

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是當(dāng)今生物工程領(lǐng)域中的前沿研究課題之一，無(wú)論是在基礎(chǔ)研究還是生產(chǎn)實(shí)踐方面都得到生物技術(shù)界的重視。隨著哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)模的擴(kuò)大和生物藥物需求的增長(zhǎng)，基于細(xì)胞及產(chǎn)品特性的無(wú)血清培養(yǎng)基的研制已成為細(xì)胞工程領(lǐng)域的重要課題。無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究日益得到人們的重視。近年來(lái)，有關(guān)無(wú)血清培養(yǎng)基的研制和開(kāi)發(fā)得到了迅速發(fā)展，推動(dòng)了基因工程產(chǎn)品及產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)及分類

細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞體外培養(yǎng)的最重要因素。無(wú)血清培養(yǎng)基是繼天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基之后的第三類培養(yǎng)基。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，無(wú)血清培養(yǎng)基是一種不含有動(dòng)物血清或其他生物提取液，但仍可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)、繁殖的一種培養(yǎng)基。無(wú)血清培養(yǎng)基由于其組成成分相對(duì)清楚，制備過(guò)程簡(jiǎn)單，在現(xiàn)代生物技術(shù)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)也是闡明細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化及基因表達(dá)調(diào)控的基礎(chǔ)研究問(wèn)題的有力工具。

常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加相應(yīng)量的血清或組織提取物，其中最常用于培養(yǎng)基的血清是一種組分很不明確的混合物。所以常規(guī)血清細(xì)胞培養(yǎng)基存在以下缺點(diǎn)：

（1）血清來(lái)自于動(dòng)物體，其對(duì)細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)的主要作用是提供生長(zhǎng)因子、激素、結(jié)合蛋白，并提供保護(hù)作用，但同時(shí)也有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子和毒性因子，所以存在潛在毒性。

（2）由于動(dòng)物血清提取的局限，使其應(yīng)用于培養(yǎng)基的價(jià)格格外昂貴。

（3）動(dòng)物血清提取的局限，也給細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化帶來(lái)困難，同時(shí)也存在細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)品分離純化難的問(wèn)題，具有潛在的細(xì)胞毒性作用，給規(guī)?；囵B(yǎng)細(xì)胞增加了難度［1］。

由于上述常規(guī)血清細(xì)胞培養(yǎng)基存在的諸多問(wèn)題，促使我們改進(jìn)培養(yǎng)方法，用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)替代。細(xì)胞工程中無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用，在很大程度上可以避免含血清培養(yǎng)所帶來(lái)的不利。無(wú)血清培養(yǎng)基具有以下明顯的優(yōu)缺點(diǎn)：

無(wú)血清培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn):

（1）可避免血清批次間的質(zhì)量變動(dòng)，提高細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性。

（2）避免血清對(duì)細(xì)胞的毒性作用和血清源性污染。

（3）避免血清組分對(duì)實(shí)驗(yàn)研究的影響。

（4）有利于體外培養(yǎng)細(xì)胞的分化。

（5）可提高產(chǎn)品的表達(dá)水平并使細(xì)胞產(chǎn)品易于純化。

缺點(diǎn)：

（1）細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中易受某些機(jī)械因素和化學(xué)因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應(yīng)用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。

（2）成本較高。

（3）針對(duì)性很強(qiáng)，一種無(wú)血清培養(yǎng)基僅適合某一類細(xì)胞的培養(yǎng)。

發(fā)展無(wú)血清培養(yǎng)基，除了開(kāi)發(fā)化學(xué)合成培養(yǎng)基外，也可以尋找適當(dāng)?shù)木哂蓄愃朴谘骞δ艿纳锓肿觼?lái)替代血清。目前，無(wú)血清培養(yǎng)基的研究有兩個(gè)方向：一是培養(yǎng)基中不含有任何動(dòng)物來(lái)源的添加組分；二是培養(yǎng)基中不含有不明確的添加組分。依次可以將當(dāng)前應(yīng)用較多的無(wú)血清培養(yǎng)基歸納為以下4種：

（1）無(wú)血清培養(yǎng)基。此為一般意義上的無(wú)血清培養(yǎng)基，是由各類可替代血清功能的生物材料配制成的細(xì)胞培養(yǎng)基，如牛血清白蛋白（BSA）、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等生物大分子物質(zhì)，以及從血清中提取的去除蛋白質(zhì)的混合脂類以及水解蛋白等。其特點(diǎn)是培養(yǎng)基中的蛋白含量較高，添加物質(zhì)的化學(xué)成分不明確，其中含有大量的動(dòng)物來(lái)源蛋白［2］。

（2）無(wú)動(dòng)物來(lái)源培養(yǎng)基。許多商業(yè)公司開(kāi)發(fā)的無(wú)動(dòng)物來(lái)源培養(yǎng)基是基于生產(chǎn)重組藥物的安全考慮，培養(yǎng)基中的添加組分無(wú)動(dòng)物來(lái)源，需要的蛋白來(lái)源于重組蛋白或者蛋白水解物，這些組分可以保障細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖的需要。

（3）無(wú)動(dòng)物蛋白培養(yǎng)基。培養(yǎng)基完全不用動(dòng)物來(lái)源的蛋白，但仍有部分添加物是來(lái)源于植物蛋白的水解片段或合成多肽片段等其他衍生物。此類培養(yǎng)基組分相對(duì)穩(wěn)定，但必須添加類固醇激素和脂類前體，并且對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞是高度特異性的［3］。

（4）化學(xué)組分限定培養(yǎng)基［4，5］。此類培養(yǎng)基是目前最安全、最為理想的培養(yǎng)基，首先可以保證培養(yǎng)基批次間的一致性，其中所添加的少量動(dòng)物來(lái)源的蛋白水解物、蛋白都是成分明確的組份。其特點(diǎn)是培養(yǎng)基的性質(zhì)明確，有利于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的代謝研究，同時(shí)分離純化也比較方便。

2 無(wú)血清培養(yǎng)基的實(shí)驗(yàn)研究

無(wú)血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細(xì)胞在體外較長(zhǎng)時(shí)間生長(zhǎng)繁殖的合成培養(yǎng)基。但是它們可能包含個(gè)別蛋白或大量蛋白組分。雖然基礎(chǔ)培養(yǎng)基加少量血清所配制的完全培養(yǎng)基可以滿足大部分細(xì)胞培養(yǎng)的要求，但對(duì)有些實(shí)驗(yàn)卻不適合，如觀察一種生長(zhǎng)因子對(duì)某種細(xì)胞的作用，這時(shí)需要排除其他生長(zhǎng)因子的干擾作用，而血清中可能含有各種生長(zhǎng)因子；又如需要測(cè)定某種細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中分泌某種物質(zhì)（抗體、生長(zhǎng)因子）的能力；或者要大規(guī)模的培養(yǎng)某種細(xì)胞，以獲得它們的分泌產(chǎn)物。

2.1 無(wú)血清培養(yǎng)基的基本配方

基本成分為基礎(chǔ)培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。用于生物制藥和疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，多數(shù)呈貼壁生長(zhǎng)或兼性貼壁生長(zhǎng)；而當(dāng)其在無(wú)血清、無(wú)蛋白培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí)，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細(xì)胞往往以懸浮形式生長(zhǎng)。

2.2 添加組分

2.2.1 促貼壁物質(zhì)

許多細(xì)胞必須貼壁才能生長(zhǎng)，這種情況下無(wú)血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴(kuò)展因子，一般為細(xì)胞外基質(zhì)，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細(xì)胞功能的分化因子，對(duì)許多細(xì)胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進(jìn)來(lái)自中胚層細(xì)胞的貼壁與分化，這些細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、粒細(xì)胞、腎上皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞、CHO細(xì)胞、成肌細(xì)胞等。

2.2.2 促生長(zhǎng)因子及激素

針對(duì)不同細(xì)胞添加不同的生長(zhǎng)因子。激素也是刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、維持細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，有些激素是許多細(xì)胞必不可少的，如胰島素。

2.2.3 酶抑制劑

培養(yǎng)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞，需要用胰酶消化傳代，在無(wú)血清培養(yǎng)基中酶抑制劑必不可少，以終止酶的消化作用，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的。最常用的是大豆胰酶抑制劑。

2.2.4 結(jié)合蛋白和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白

常見(jiàn)如轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷。許多旋轉(zhuǎn)式培養(yǎng)的無(wú)血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

2.2.5 微量元素

硒是最常見(jiàn)的微量元素。

2.3 使用方法

目前，血清仍是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最基本的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細(xì)胞生長(zhǎng)狀況不良時(shí)，常常會(huì)先使用有血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛以后，再換成無(wú)血清培養(yǎng)液。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個(gè)適應(yīng)過(guò)程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%、1%，直至無(wú)血清培養(yǎng)。在降低過(guò)程中要注意觀察細(xì)胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細(xì)胞死亡，存活細(xì)胞是否還保持原有的功能和生物學(xué)特性等。在實(shí)驗(yàn)后這些細(xì)胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細(xì)胞能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)于無(wú)血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細(xì)胞轉(zhuǎn)入無(wú)血清培養(yǎng)之前，要留有種子細(xì)胞，種子細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細(xì)胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)，關(guān)鍵是使所培養(yǎng)細(xì)胞處于如下?tīng)顩r：

（1）處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期；

（2）>90%活細(xì)胞率；

（3）適應(yīng)時(shí)以較高的起始細(xì)胞接種。

細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基的方法：

直接適應(yīng)——細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）中。

一些類型細(xì)胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基。對(duì)于直接適應(yīng)，接種細(xì)胞密度應(yīng)該:2.5×10⁵-3.5×10⁵細(xì)胞/mL。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶-3×10⁶細(xì)胞/mL時(shí)，傳代培養(yǎng)細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞密度在培養(yǎng)4~7天后達(dá)到2×10⁶~4×10⁶細(xì)胞/mL時(shí)，細(xì)胞完全適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶~3×10⁶細(xì)胞/mL，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

連續(xù)適應(yīng)——分好幾步把細(xì)胞從添加血清的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)換到無(wú)血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應(yīng)相比較，連續(xù)適應(yīng)趨向?qū)τ诩?xì)胞更加溫和一些。

(1)以2倍正常接種密度接種生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基-25％SFM混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

（2）當(dāng)細(xì)胞密度>5×10⁵細(xì)胞/mL時(shí)，以2×10⁵~3×10⁵細(xì)胞/mL細(xì)胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

（3）以2×10⁶~3×10⁶細(xì)胞/ml細(xì)胞密度，25％有血清培養(yǎng)基和75%SFM中傳代培養(yǎng)。

（4）當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶~3×10⁶細(xì)胞/mL（接種后4~6天），在100％SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

（5）每隔3~5天，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到1×10⁶~3×10⁶細(xì)胞/mL，細(xì)胞活率在90％時(shí)，貯備的適應(yīng)了無(wú)血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物應(yīng)該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細(xì)胞適應(yīng)了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進(jìn)行幾次傳代。

在適應(yīng)過(guò)程中，最好不要讓細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質(zhì)，因而更易于受外界因素的影響。

細(xì)胞培養(yǎng)適應(yīng)替代血清：許多細(xì)胞利用連續(xù)適應(yīng)方法能很好的適應(yīng)，用包含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。通過(guò)下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當(dāng)前培養(yǎng)基的量：從1∶2到1∶4再到1∶16直至100％替代培養(yǎng)基。每次適應(yīng)改變血清比例時(shí)，傳代細(xì)胞2~3次。

培養(yǎng)直接從FBS轉(zhuǎn)換到替代血清。一開(kāi)始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長(zhǎng)的延遲可能會(huì)發(fā)生，允許進(jìn)行2~3次的傳代，使生長(zhǎng)率恢復(fù)到以前的水平。

特別需要強(qiáng)調(diào)的是：配制無(wú)血清培養(yǎng)液必須使用高質(zhì)量的水，如石英玻璃蒸餾器經(jīng)3次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因?yàn)闊o(wú)血清培養(yǎng)基缺乏血清中天然成分未中和毒素、保護(hù)細(xì)胞的大分子，既便水中的有毒物質(zhì)含量甚微，也可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致死性損害。這是無(wú)血清培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。

3 結(jié)語(yǔ)

動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的研究方法運(yùn)用了基因組技術(shù)、蛋白質(zhì)組技術(shù)、代謝工程技術(shù)、計(jì)量分析方法等。另外，有關(guān)無(wú)血清培養(yǎng)基在線數(shù)據(jù)庫(kù)的建立也方便了相關(guān)信息的檢索與分析［6］，為無(wú)血清培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)提供了更多的信息。

隨著重組蛋白、單克隆抗體及病毒疫苗需求量的加大，將會(huì)有更多的科學(xué)方法運(yùn)用到細(xì)胞培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)與研究中［7］。新一代動(dòng)物細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基將具有“無(wú)血清、無(wú)蛋白、無(wú)動(dòng)物來(lái)源、成分確定”的特性，同時(shí)在功能上屬于安全、通用的高效培養(yǎng)基，這種細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基在細(xì)胞工程領(lǐng)域中將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Even M S，Sandusky C B，Barnard N D. Serum-free hydridoma culture:ethical，scientific and safety considerations［J］. Trends in Biotechnology，2006，24(3):105-108.

［2］ Keen M J，Rapson N T. Development of a serum-free culture medium for the large scale production of recombinant protein from a Chinese hamster ovary cell line［J］. Cytotechnology，1995，17 (3) :153-163.

［3］ Schroder M， Matischak K， Friedl P. Serum-and protein-free media formulations for the Chinese hamster ovary cell line DUKXB11［J］. Journal of Biotechnology，2004， 108 (3): 179-292.

［4］ Hesse F， Wanger R. Developments and improvements in the manufacturing of human therapeutics with mammalian cell cultures［J］. Trends Biotechnology，2000， 18 (4): 173-180.

［5］ Chen Z L， Iding K， Lutkemeyer D， et al. A low-cost chemically defined protein free medium for a recombinant CHO cell line producing prothrombin［J］. Biotechnology Letters，2000， 22 (10): 837-841.

［6］ Falkner E， Appl H， Eder C， et al. Serum free cell culture: The free access online database［J］. Toxicology in Vitro， 2006， 20 (3): 395-400.

［7］ Wurm F M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells［J］. Nature Biotechnology， 2004， 22 (11): 1393-1398.

（責(zé)任編輯：陳涌濤）