嚴　莉　喬翠玲

[摘要] 目的 對酶聯(lián)免疫法檢測HBsAg和熒光定量PCR檢測HBV-DNA結(jié)果行對比研究，探討其臨床意義。方法 對45例HBsAg陰性的慢性乙型肝炎HBV感染患者采用ELISA檢測HBVM（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc），同時采用PCR對其血清HBV-DNA進行定量分析；對照組為同期慢性乙型肝炎患者。結(jié)果 45例HBsAg陰性慢性乙型肝炎患者中，HBV-DNA陽性率為24.44％。結(jié)論 ELISA法檢測HBV是不全面的，但PCR只能檢出復制狀態(tài)的病毒，難以表達非復制狀態(tài)的感染，因而用PCR方法檢測HBV-DNA也不能完全代替血清標志物的檢測。建議必要時兩者結(jié)合加強對患者的檢測，以避免臨床不必要的漏檢。

[關(guān)鍵詞] 慢性乙型肝炎； HBsAg； HBV-DNA； 對比

[中圖分類號] R512.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2009）13-26-02

Comparison Research of ELISA and PCR in Examining HBsAg and HBV-DNA

YAN Li1 QIAO Cuiling2

1.Department of Laboratory，The First People's Hospital in Yibin；2.Health School in Yibin，Sichuan 644000

[Abstract] ObjectiveTo compare the clinical value and reliability of ELISA（enzyme linked immunosorbent assay） and PCR（polymerase chain reaction）in examining HBsAg（hepatitis B surface antigen） and HBV-DNA（hepatitis B virus- DNA）. MethodsExamining HBVM（HBsAg，Anti-HBs，HBeAg，Anti-HBe，Anti-HBc）by ELISA and HBV-DNA by PCR of 45 HBV patients. ResultsOf all the 45 HBV patients，the positive rate of HBV-DNA was 24.44%. ConclusionELISA and PCR can not correctly examine the results and in clinical we should examine blood by both.

[Key Words]HBV； HBsAg； HBV-DNA； Contrast

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種嚴重危害人類健康和生命的全球性傳染性疾病，HBV持續(xù)感染與肝硬化和原發(fā)性肝細胞肝癌等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我國是乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染高發(fā)區(qū)，根據(jù)2006年全國人群乙型肝炎血清流行病學調(diào)查結(jié)果顯示，我國人群1～59歲人群中HBsAg攜帶率已從1992年的9.75％降至7.18％，按目前HBsAg攜帶率推算，我國仍然有HBsAg攜帶者約9300萬人。目前醫(yī)院臨床上多以血清免疫學乙型肝炎病毒標志物HBVM（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）作為診斷乙型肝炎的重要依據(jù)之一，隨著PCR對血清HBV-DNA進行定量檢測，HBsAg陰性不能排除HBV感染已經(jīng)成為共識，尤其在HBV感染的高發(fā)地區(qū)。本文旨在通過采用酶聯(lián)免疫法和熒光定量聚合酶鏈反應兩種方法同時測定，并對HBsAg、HBV-DNA結(jié)果進行對比，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

45例患者HBsAg陰性的慢性乙型肝炎患者均為2006年6月～2007年10月門診及住院患者。其中男23例，女22例；年齡24～67歲，平均47歲；均無乙肝疫苗接種史。HBVM檢測所有病例HBsAg均呈陰性，同時采用PCR方法對血清HBV-DNA進行定量分析。對照組45例為同期慢性乙型肝炎患者，其中男17例，女28例；年齡19～59歲，平均42歲。ELISA法檢測HBsAg、HBeAg、抗-HBc均呈陽性，同時采用PCR對血清HBV-DNA進行定量分析。慢性乙型肝炎及其病理診斷依照中華肝病學會和中華傳染病學會2000年西安會議標準，并排除其他肝炎病毒感染和其他原因的肝病損害。

1.2 方法

用酶聯(lián)免疫檢測法檢測HBVM（HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc），試劑盒由上?？迫A生物技術(shù)有限公司提供，操作嚴格按試劑盒說明書進行，并采用衛(wèi)生部臨檢中心0407質(zhì)控血清進行質(zhì)量控制。結(jié)果判定：s/co≥1為有反應性，0.8≤s/co<1為灰區(qū)可疑，s/co < 0.8為無反應性。

PCR檢測血清HBV-DNA試劑盒為中山醫(yī)科大學達安基因股份有限公司產(chǎn)品，操作嚴格按試劑盒說明書進行，儀器為美國PE-5700型PCR擴增儀，反應結(jié)束后，由電腦自動分析計算HBV-DNA定量結(jié)果，結(jié)果以拷貝/毫升（cp/mL）表示（采用求算術(shù)平均值的方法計算HBV-DNA平均拷貝數(shù)，遇有無反應性結(jié)果，不參加平均值的統(tǒng)計）。結(jié)果判定：≥1000cp/mL為有反應性，< 1000cp/mL為無反應性。

2 結(jié)果

45例HBsAg陰性的慢性乙型肝炎患者中，HBV-DNA陽性率為24.44％，單獨抗-HBs陽性的慢性肝炎組HBV-DNA陽性率為16.67％，抗-HBe、抗-HBc并存者HBV-DNA陽性率為25％，抗-HBs、抗-HBe及抗-HBc三者陽性的慢性乙型肝炎患者HBV-DNA陽性率為25％，單一的抗-HBc陽性的慢性乙型肝炎組HBV-DNA陽性率為28.57％，HBVM 5項指標均為陰性的患者血清HBV-DNA陽性率為25％，具體結(jié)果見表1。

3 討論

酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）是將酶的催化反應與抗原抗體的免疫學反應結(jié)合起來的一種技術(shù)，由于其靈敏度高、特異性強、重復性好、易于自動化且無放射性污染等諸多優(yōu)點成為應用最廣泛、發(fā)展最快的一種免疫測定技術(shù)，但ELISA法操作環(huán)節(jié)較多，再加上抗原、抗體的變異，較長的“窗口期”、洗滌時殘留、孔與孔之間交叉污染、標本本身及工作人員操作熟練程度等多種偶然因素的影響，都會導致一定的假陽性率。標本中HBsAg滴度過高也會因為出現(xiàn)“后滯現(xiàn)象”而導致弱陽性或假陰性。國外ELISA試劑通常定義一段“灰區(qū)”的檢測范圍，結(jié)果報告“可疑”，而國內(nèi)無一廠家對HBsAg的灰區(qū)進行設(shè)定，各醫(yī)療機構(gòu)對灰區(qū)的理解也未達成共識，在報告模式上則只報告陰性和陽性，因此普遍存在結(jié)果不一致的現(xiàn)象。即ELISA法檢測HBV是不全面的，醫(yī)院單憑HBsAg檢測無反應性來判斷血液無傳染性是遠遠不夠的。

PCR作為一種體外基因擴增技術(shù)，是利用目的特異性引物在聚合酶的作用下，以四種單核苷酸為底物，在體外短時間內(nèi)將模板DNA的一個區(qū)段進行幾何級數(shù)的擴增，具有敏感、快速、特異、無放射性等優(yōu)點，該技術(shù)目前已得到了非常廣泛的普及和應用。采用熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測HBV-DNA是目前檢測HBV-DNA的最佳手段，也是當今應用最多的一種核酸檢測（NAT）技術(shù)，其采用完全閉管檢測，不需后處理，避免了交叉感染，同時采用實時檢測技術(shù)連續(xù)不斷的檢測PCR過程中反應體系對熒光信號的變化，利用熒光信號達到了某一閾值時的循環(huán)次數(shù)與起始模板DNA量的對數(shù)值之間的嚴格的線性關(guān)系，進行起始模板定量，定量的準確率極高，可真實反應HBV的復制情況。但PCR只能檢出復制狀態(tài)的病毒，難以表達非復制狀態(tài)的感染，因而用PCR方法檢測HBV-DNA也不能完全代替血清標志物的檢測。

既往研究發(fā)現(xiàn)，HBV通過在細胞內(nèi)表達抗原或與細胞基因整合，誘導免疫損傷甚至細胞惡變。HBsAg是HBV感染的特異性指標，抗-HBs一般于HBsAg消失數(shù)周后（也就是急性感染約5個月后）開始在血液中出現(xiàn)，是HBsAg刺激機體產(chǎn)生的特異性保護抗體，是HBV感染終止及有免疫力的標志。但是，本文單獨抗-HBs陽性的慢性肝炎組HBV-DNA陽性率為16.67％，提示抗-HBs轉(zhuǎn)陽后，肝細胞的病毒復制仍可持續(xù)或者抗體未能消除變異的HBV感染。

實驗結(jié)果表明：HBsAg陰性慢性乙型肝炎患者中，HBV-DNA陽性率為24.44％，提示在HBsAg陰性的慢性乙型肝炎患者，盡管體內(nèi)存在病毒抗體，但隱伏的HBV仍可長期存在，甚至持續(xù)低水平復制，因此，僅根據(jù)HBsAg陰性甚至HBsAg陰性、抗-HBs陽性不能排除乙肝感染。兩者檢測結(jié)果之間的差異可能與以下因素有關(guān)：（1）HBsAg在血液中多為不含病毒顆粒的空殼，其無法反映病毒有無復制、復制程度、傳染性強弱等情況，而HBV- DNA檢測是對病毒本身的檢測，是HBV復制最直接、最可靠的指標；（2）部分患者ELISA檢測有反應性，但PCR檢測為陰性，提示其體內(nèi)仍有病毒顆粒，但可能非完整的病毒顆粒，病毒處于相對靜止狀態(tài)，無明顯的病毒復制；（3）部分患者ELISA檢測有反應性，但PCR檢測為陰性，可能與HBV-DNA所用引物不匹配或HBV-DNA整合于宿主細胞基因或基因變異即HBV- DNA檢測假陰性，體內(nèi)病毒較低所致。后兩種原因皆提示其傳染性極低。

綜合上述結(jié)果，提示隱匿性乙型肝炎患者仍普遍存在，相當部分HBsAg陰性的慢性肝病患者不僅是HBV感染者，而且存在病毒復制和傳染性。HBsAg隱性感染是隱源性肝病的主要病因之一，也是乙肝疫苗接種無應答的原因之一。這就要求我們在臨床進行檢測時，要加強對患者的篩選，首先應用ELISA法檢測HBsAg，去除HBsAg有反應性血液，再在其基礎(chǔ)上對HBsAg無反應性血液加做HBV-DNA核酸檢測，去除HBV-DNA有反應性血液，只有這樣才能正確診斷患者的機體感染或復制狀態(tài)。

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（收稿日期：2009-01-14）