周之超　　石明明

摘要:利用鹽溶法分離制備動物基因組DNA和RNA的方法,并對實驗過程進行改良和分析。實驗中選用新鮮豬肝作為實驗材料,根據(jù)核糖核蛋白與脫氧核糖核蛋白在一定濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同進行分離,利用SDS裂解,氯仿、異戊醇抽提,分離得到豬肝臟中基因組DNA和RNA;同時,通過脫氧核糖和核糖的顯色反應(yīng)定性區(qū)分了DNA和RNA;實驗最后利用紫外分光光度法和二苯胺法定量測定了DNA樣品中的DNA的含量。

關(guān)鍵詞:核酸;DNA;RNA;地衣酚顯色法;二苯胺顯色法

中圖分類號:Q503;Q52文獻標識碼:A文章編號:1007-273X(2009)08-0007-03

核酸通常與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核蛋白存在于細胞中,是生命的基本物質(zhì)之一,具有儲存、傳遞生物體遺傳信息的功能,也是蛋白質(zhì)合成不可缺少的物質(zhì),在生物的生長、遺傳、變異等生命過程中起著重要的決定作用。核酸分為兩大類—核糖核酸(RNA)和脫氧核糖核酸(DNA)。

核酸的基本組成單位是核苷酸,是由眾多的核苷酸縮合而成的多聚核苷酸。核苷酸經(jīng)過水解可以得到含氮堿、戊糖和磷酸。

真核生物基因組DNA和RNA廣泛應(yīng)用在動、植物的遺傳育種基因圖譜的構(gòu)建、品種鑒定、物種形成和系統(tǒng)演化等方面的研究中,無論是基因工程,還是蛋白質(zhì)工程,核酸分子都是這些技術(shù)應(yīng)用所涉及的主要對象,所以DNA和RNA的分離與提取是分子生物學(xué)研究中重要的基本技術(shù)[1]。

1材料和方法

1.1材料

供試材料為冷凍的新鮮剪碎豬肝4g[2]。所用試劑為SC緩沖溶液:2.94g檸檬酸鈉和9.0g氯化鈉溶于1L蒸餾水(用鹽酸調(diào)pH值至7.0);5% SDS溶液;地衣酚試劑:先配制0.1%三氯化鐵的濃鹽酸溶液,實驗前以此溶液為溶劑配成0.1%地衣酚溶液;氯化鈉;95%冷乙醇;氯仿;異戊醇。

1.2豬肝DNA和RNA的提取

1.2.1DNA的提?、偃⌒迈r豬肝搗碎液,裝入離心管,平衡,4 000r/min離心10min,除去上層;②下層加入SC溶液5mL混勻,同上離心,除去上層;③下層沉淀轉(zhuǎn)移入三角瓶,加入SC溶液20mL,SDS溶液3mL混勻,5mL氯仿/異戊醇混勻,固體氯化鈉2g邊加邊混,充分振蕩30min,4 000r/min離心20min;④小心取出離心管,觀察有3層,取出上層水相;水相加入等體積氯仿/異戊醇振蕩10min,4 000r/min離心20min;⑤取上清,加等體積95%冷乙醇,邊加邊順一個方向攪,玻璃棒上纏繞的DNA用少量80%乙醇洗一次,置小離心管于4℃冰箱中待用[3,4]。

1.2.2RNA的粗提①接上面的第一步,在上清中加入等體積的氯仿/異戊醇置于帶塞燒瓶中振蕩,冰浴30min;②將混合物轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管中,4℃、12 000r/min離心15min,將上清液移至另一EP管中;加異丙醇,在冰上放置15min,

3 000r/min離心10min,得到RNA沉淀[5,6]。

1.3核糖核酸和脫氧核糖核酸的顯色

D-核糖核酸+濃鹽酸+地衣酚——反應(yīng)顯綠色

D-2-脫氧核糖核酸+酸+二苯胺——反應(yīng)顯藍紫色

1.3.1 DNA顯色1mL SC溶液溶解DNA,然后轉(zhuǎn)移到50mL離心管中,用9mL 0.01mol/L NaOH溶液溶解,4 000r/min離心10min,上清轉(zhuǎn)移到試管中備用。各取上述1mL DNA溶液于兩只試管中,其中一只里面加入3mL地衣酚試劑,然后置沸水中20min,觀察顏色反應(yīng);另外一只試管中加入2mL二苯胺試劑,60℃條件下反應(yīng)1h,觀察顏色反應(yīng)。

1.3.2RNA顯色將RNA沉淀用2mL蒸餾水溶解,然后轉(zhuǎn)移至2只試管中,每只1mL。其中一只試管中加入3mL地衣酚試劑,然后置沸水中20min,觀察顏色反應(yīng);另外一只試管中加入2mL二苯胺試劑,60℃條件下反應(yīng)1h,觀察顏色反應(yīng)。

1.4核酸的定量和純度測定

紫外分光光度法(此法要求核酸純度很高,1個吸光度值相當于50μg/mL雙螺旋DNA;除了定量測定以外還可進行核酸純度的檢測,A260/A280比值,純的DNA為1.8,RNA為2.0,樣品中含有蛋白質(zhì)和苯酚時,A260/A280比值降低。);定糖法(DNA糖部分為脫氧核糖,RNA糖部分為核糖,分別可以進行二苯胺顯色法和地衣酚顯色法);定磷法(核酸的磷酸部分)。

1.4.1二苯胺顯色法原理DNA在酸性條件下其嘌呤堿與脫氧核糖間的糖苷鍵斷裂,生成嘌呤堿、脫氧核糖和脫氧嘧啶核苷酸,而2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中加熱脫水生成ω-羥基-γ-酮基戊糖,與二苯胺試劑反應(yīng)生成藍色物質(zhì),在595nm波長處有最大吸收(見圖1)[5]。DNA在40～400μg范圍內(nèi),光吸收與DNA的濃度成正比。在反應(yīng)液中加入少量乙醛,可以提高反應(yīng)靈敏度。

1.4.2 DNA吸光度的測定①A260測定:以H2O作為空白,取上清測A260值后確定稀釋倍數(shù),使A260值在2.0左右(DNA此時的濃度約為100μg/mL。(由于二苯胺法的測定范圍是40~400μg/mL DNA,所以DNA濃度如果太小會影響測定結(jié)果)。②A280測定:A260/A280比值計算。純的DNA為1.8,RNA為2.0。如果樣品中混有RNA,則比值大于1.8;如果樣品中混有蛋白質(zhì),則比值小于1.8。

所用的DNA溶液為前面提取后溶解的DNA樣品。

1.4.3DNA標準曲線的制作和樣品測定DNA標準曲線的制作加樣見表1。

按表1加完各試劑后,充分混勻。于60℃水浴中保溫1h,冷卻后于595nm波長處以0管為空白調(diào)零,測定各管光密度(OD595)。以DNA的含量為橫坐標,光密度(吸收值)為縱坐標,繪制標準曲線。(注:待測溶液中的DNA含量應(yīng)調(diào)整至標準曲線的可讀范圍內(nèi)。樣品1和樣品2為不同稀釋倍數(shù)的DNA溶液。)

1.4.4DNA含量計算 以樣品的光密度,根據(jù)標準曲線計算出相對應(yīng)DNA含量,并同紫外法測定的值進行比較。(注:二苯胺試劑具有腐蝕性,且二苯胺反應(yīng)產(chǎn)生的藍色不易褪色,操作中應(yīng)防止灑出;比色時,比色杯外面一定要擦干凈。)

2結(jié)果與分析

2.1豬肝DNA及RNA的分離提取

2.1.1核酸分離的原則核酸存在于多種細胞,因此,分離方法復(fù)雜多樣。因各種DNA、RNA含量的差異、核酸的純度及量的要求不同,因此,在實驗前應(yīng)對所采用的方法有所選擇?？偟恼f來,核酸的分離與純化是在溶解細胞的基礎(chǔ)上,利用苯酚等有機溶劑抽提(核酸溶于緩沖液,即水相),分離,純化;利用乙醇、丙酮等有機溶劑沉淀,收獲核酸。

2.1.2DNA和RNA分離的基本原理根據(jù)核糖核蛋白與脫氧核糖核蛋白在一定濃度的氯化鈉溶液中的溶解度不同進行分離,然后用蛋白質(zhì)變性沉淀劑去除蛋白,使核酸釋放出來,再利用核酸不溶于乙醇的性質(zhì)將核酸析出,達到分離DNA和RNA的目的。

在0.14mol/L的氯化鈉溶液中,RNA核蛋白溶解度大,而DNA核蛋白溶解度小;相反在1mol/L的氯化鈉溶液中,DNA核蛋白的溶解度大,而RNA核蛋白的溶解度小,從而使DNA和RNA核蛋白分開。

2.1.3核酸分離的一般步驟①溶解細胞:溶解細胞的方法包括十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)加NaOH、蛋白酶和用超聲波破碎等方法。②有機溶劑抽提:利用SDS溶液提取的目的是使蛋白質(zhì)變性沉淀于有機相,而核酸保留在水相,達到分離核酸的目的。③沉淀:為了除去分離過程中殘留的有機溶劑,常用的方法是加冷乙醇和鹽沉淀核酸,再通過離心回收核酸,然后用80%乙醇洗滌沉淀,除去多余的鹽,以免影響核酸溶解和抑制后續(xù)步驟的酶促反應(yīng)。試劑盒:目前開發(fā)了許多商品化的核酸分離柱,可簡單、快速地分離得到純度很高的DNA或RNA,其分離原理有的是利用核酸的分子量差異,有的是利用所需分離的核酸的特點將其特異性結(jié)合達到分離、回收的目的。④傳統(tǒng)的酚、氯仿、異戊醇在抽提中的作用:a.酚:有效的使蛋白質(zhì)變性,不能完全的抑制RNA酶的活性,能溶解帶有長poly(A)的RNA分子。使用前必須用水飽和并用Tris平衡至pH>7.8,以防止DNA分配到有機相。結(jié)晶酚要在182℃下重蒸去除醌類等氧化產(chǎn)物,這些物質(zhì)能夠引起磷酸二酯鍵的斷裂或促進核酸交聯(lián)。b.氯仿:純酚的比重為1.07,有機相和水相有時很難分開。加入氯仿(比重為1.47)可以避免這一問題。同時,酚有時會微溶于水?？梢杂寐确聦⑺嘀械姆尤コ?。c.異戊醇:減少泡沫的產(chǎn)生。

2.2核糖核酸和脫氧核糖核酸的顯色實驗

DNA脫氧核糖的顯色反應(yīng)中加地衣酚試劑的試管反應(yīng)后呈茶色,加二苯胺試劑的試管反應(yīng)后呈藍色。反應(yīng)機理是DNA分子中2-脫氧核糖殘基在酸性溶液中加熱降解,產(chǎn)生2-脫氧核糖并形成ω-羥基-γ酮基戊醛,后者與二苯胺試劑反應(yīng)成藍色化合物,其反應(yīng)為:DNA→ω-羥基-γ酮基戊醛→藍色復(fù)合物,所以我們的結(jié)果與理論是一致的,對于加入地衣酚的試管,我們認為地衣酚主要是與RNA發(fā)生反應(yīng),所以我們看到的茶色可能只是地衣酚加熱后的顏色,或者是DNA溶液和地衣酚加熱后的共同的顏色。

RNA核糖的顯色實驗結(jié)果表明加地衣酚試劑的試管反應(yīng)后呈淺綠色,加二苯胺試劑的試管反應(yīng)后呈黑色。RNA與濃鹽酸共熱時發(fā)生降解,產(chǎn)生的核糖又可轉(zhuǎn)變糖醛,在FeCl3或CuCl2催化下,糖醛與3,5-二羥基甲苯(地衣酚、苔黑酚)反應(yīng)形成綠色復(fù)合物,實驗結(jié)果觀察到為淺綠色,符合理論結(jié)果,顏色稍淺,可能是濃度過低,試液被稀釋的結(jié)果,或者是酸度不夠沒有加催化劑的影響。對于加入二苯胺試劑的試管,我們認為二苯胺試劑主要是與DNA發(fā)生反應(yīng),所以我們看到的黑色可能只是二苯胺試劑加熱后的顏色。

2.3核酸的定量和純度測定

2.3.1DNA標準曲線的制作和樣品測定按照表1的順序加入樣品反應(yīng)得到DNA標準曲線樣品測定的結(jié)果(見表2),以DNA的含量為橫坐標,光密度(吸收值)為縱坐標,繪制標準曲線(見圖2)。

2.3.2DNA含量的計算由圖2所作的DNA標準曲線可知,DNA含量與OD595的關(guān)系為:

OD595=0.0022×c(DNA)濃度

實驗中樣品1為DNA原液,樣品2為稀釋1倍的DNA溶液。將OD595值0.274和0.174分別代入上面的公式,可求得樣品1、樣品2中的DNA含量分別為124.54μg/mL和79.09μg/mL。由紫外分光光度法得,1個吸光度值相當于50μg/mL雙螺旋DNA,我們測得稀釋一倍的DNA溶液吸光度值為1.734,所以其DNA含量為50μg/mL×1.734=86.7μg/mL,則原液DNA含量為86.7μg/mL×2=172.4μg/mL。

由實驗結(jié)果得知,通過DNA標準曲線測得的DNA含量比紫外分光光度法測得的值要低,由于而在我們的實驗過程中很難保證這一點,所以我們認為通過DNA標準曲線測得的DNA含量值更為可信。而且,紫外分光光度法對核酸純度要求很高,但測得的A260/A280比值為1.727,純的DNA為1.8,說明樣品中混入了蛋白質(zhì),可能是在DNA的分離純化中,沒有將蛋白質(zhì)除盡的緣故。

3討論

(1)在細胞內(nèi)的核酸通常是與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而存在——核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白。核蛋白在水溶液和各種電解質(zhì)溶液中有一定的溶解度,所以在前面研磨步驟將損失一部分核酸。因此應(yīng)避免加入大量的水進行研磨,以減少核蛋白的溶解。

(2)核酸酶降解核酸所帶來的誤差。脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的存在導(dǎo)致了一些核酸降解成為了核苷酸,在水中溶解后被棄去。防止該誤差的主要方法有兩種,一是選取核酸酶含量較低的材料,如小牛胸腺細胞等;二是降低酶活性,保證操作在低溫下進行,以此來抑制酶的活性。

(3)在堿性溶液中溶解RNA后加HCl時,溶液呈酸性,有小部分DNA此時也被水解掉了。可以之前利用氯仿-異戊醇法或苯酚法去除蛋白質(zhì),然后在溶解RNA后就可以直接把上清液分離出來。

地衣酚法測RNA反應(yīng)原理是:當RNA與濃鹽酸共熱時.即發(fā)生降解.形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛,后者與3,5-二羥基甲苯(地衣酚orcinol)反應(yīng),在Fe2+或Cu2+催化下,成鮮綠色復(fù)合物,反應(yīng)產(chǎn)物在670nm處有最大吸收。所以,地衣酚法特異性差,凡戊糖均有此反應(yīng),己糖持續(xù)加熱產(chǎn)生的羥甲基糠醛,以及DNA和其他雜質(zhì)也能與地衣酚反應(yīng)產(chǎn)生類似顏色。另外,RNA濃度在10~100μg/mL范圍內(nèi),光吸收與RNA濃度成正比,其中所用標準液濃度為100μg/mL,筆者認為采用50μg/mL,RNA待測液濃度再稀釋一倍,所測結(jié)果再利用線性關(guān)系計算會更準確些[4]。

(4)提取基因組DNA要保證其一級結(jié)構(gòu)的完整性,排除其他生物大分子(蛋白質(zhì)、多糖、脂類等)以及RNA分子的污染,并且不存在過高濃度的有機溶劑和金屬離子,以避免化學(xué)因素對核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞和對后續(xù)的酶反應(yīng)產(chǎn)生抑制作用;同時,應(yīng)盡量簡化操作步驟,以減少提取過程中有害因素對核酸的破壞。該試驗使用SDS破壞細胞膜、核膜,使蛋白質(zhì)變性,有效去除核酸分子結(jié)合的蛋白質(zhì),從而游離出核酸,它主要用來抑制核酸酶的活性,避免DNA被降解;加入氯仿也是為了使核蛋白變性,促使DNA分子釋放,有效抑制核酸酶活性,去除帶有poly(A)長鏈的RNA。該試驗所用試劑均為常見的化學(xué)試劑,不需要昂貴的生物試劑;試驗儀器要求低,操作簡單,完成一次提取過程僅需5～6h[1]。

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