白 月 徐國興 陳金國 謝茂松 郭 健 王婷婷

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光損傷視網(wǎng)膜片培養(yǎng)上清液誘導(dǎo)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞為視網(wǎng)膜樣細(xì)胞的研究

白 月 徐國興 陳金國 謝茂松 郭 健 王婷婷

福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,福建省眼科研究所

目的：探討大鼠視網(wǎng)膜片光損傷后誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)成視網(wǎng)膜細(xì)胞的可能性。方法：實驗研究。采用貼壁篩選法分離、培養(yǎng)SD大鼠骨髓MSC細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定后，用大鼠視網(wǎng)膜片光損傷后的上清液與10%FBS的LG-DMEM以2:3混合成的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)MSC細(xì)胞7~8d。用免疫細(xì)胞化學(xué)染色和RT-PCR觀察誘導(dǎo)后的細(xì)胞是否表達視紫紅質(zhì)、GFAP、NSE。結(jié)果：第3代MSC細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后有（36.64±7.84)%表達rhodopsin, (20.21±6.47)%表達GFAP, (21.83±2.98)%表達NSE。RT-PCR鑒定結(jié)果分析示GFAP、NSE、Rhodopsin mRNA均有表達。結(jié)論：光損傷SD大鼠視網(wǎng)膜片培養(yǎng)上清液可誘導(dǎo)MSCs分化為視網(wǎng)膜樣細(xì)胞。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 視網(wǎng)膜細(xì)胞 大鼠

成體干細(xì)胞中的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有多向分化的潛能，雖然其來源于中胚層，卻可以跨胚層分化為外胚層來源的組織細(xì)胞，而視網(wǎng)膜則來源于胚胎期神經(jīng)外胚層。MSC表達許多生長因子和細(xì)胞因子受體以及細(xì)胞與細(xì)胞黏附作用的受體，提示MSC的功能受自分泌和旁分泌循環(huán)的調(diào)控。這成為不同方法誘導(dǎo)MSCs定向分化的理論基礎(chǔ)。組織或細(xì)胞在受到損傷后會進行自身修復(fù)，視網(wǎng)膜是接受光能，形成視覺的重要組織結(jié)構(gòu)，如果光照強度或光照時間超過了視網(wǎng)膜的承受力，將會造成視網(wǎng)膜光損傷。本研究旨在用光損傷視網(wǎng)膜片的培養(yǎng)上清液體外誘導(dǎo)MSCs，看其損傷時分泌的細(xì)胞因子和分化所需蛋白是否能誘導(dǎo)MSCs分化為視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞。探索體外構(gòu)建MSCs分化成視網(wǎng)膜細(xì)胞所需微環(huán)境的理論可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康無眼病成年Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，體重120~150g（吳氏實驗動物中心）。

1.2 大鼠視網(wǎng)膜片的取材

10%水合氯醛按0.3mL/100g腹腔注射麻醉，無菌狀態(tài)下取出眼球。把眼球用10%FBS的LG-DMEM洗滌3次，去除球周筋膜組織，清洗干凈后移入另一盛有10% FBS的LG-DMEM培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下，在角鞏膜緣后1mm處剪開，用顯微剪取出角膜、晶狀體、玻璃體，留有外層覆蓋鞏膜的視網(wǎng)膜杯。把視網(wǎng)膜杯浸入培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液里，由杯緣向杯底，用顯微鑷鈍性分離視網(wǎng)膜和鞏膜，在視神經(jīng)處剪斷，徹底分離視網(wǎng)膜色素上皮層與視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層。

1.3 大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層常規(guī)石蠟切片HE染色

將大鼠視網(wǎng)膜片（只包含神經(jīng)上皮層）常溫浸泡甲醛24h以固定，常規(guī)脫水、透明、包埋、切片，常規(guī)脫蠟，行蘇木素-伊紅(HE)染色，封片。用數(shù)字?jǐn)z像系統(tǒng)觀察并采集照片。

1.4 視網(wǎng)膜片光損傷和條件培養(yǎng)液的制備

把分離好的4只眼球的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層移入另一盛有8mlNeurobasal+B27的小培養(yǎng)皿中（直徑60mm）。用眼科顯微剪把視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層剪成1mm×1mm×1mm大小。在超凈臺內(nèi)，50W,12V的鹵素?zé)糇鳛楣庠?，采取直落式照射上述的小培養(yǎng)皿，用TES-1330A照度計測定光照強度，調(diào)整光源與培養(yǎng)皿之間的距離（3.5cm），使被照細(xì)胞同一水平的光照強度為(1950 ±200)Lux ,光照時該水平溫度變化在0.5℃之內(nèi)，持續(xù)光照45min，光照后將培養(yǎng)皿放入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1小時15min。用去針頭的針筒吸出小培養(yǎng)皿中的液體，離心后上清液用0.22um濾器過濾，以2:3的比例與10%FBS-LGDMEM混合，并吹打均勻，制成條件培養(yǎng)液Ⅰ。條件培養(yǎng)液Ⅱ制備方法同條件培養(yǎng)液Ⅰ，只是視網(wǎng)膜片未經(jīng)過光損傷處理，盛有Neurobasal+B27和視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層的小培養(yǎng)皿直接放入37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時。條件培養(yǎng)液Ⅲ為Neurobasal+B27和10%FBS-LGDMEM以2：3的比例混合，無視網(wǎng)膜片以及光損傷處理。三種條件培養(yǎng)液均放于-20℃保存。

1.5 視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層光損傷后電鏡觀察

取材，3%戊二醛—1.5%多聚甲醛前固定，1%鋨酸—1.5%亞鐵氰化鉀后固定，酒精—丙酮脫水，環(huán)氧樹脂618包埋劑包埋；超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，日立Hu-12A型（飛利浦208型）透射電鏡觀察、攝影。

1.6 大鼠MSC的分離和培養(yǎng)

取SD大鼠，麻醉后，無菌條件下取出雙側(cè)股骨和脛骨，剔除周圍肌肉組織。在超凈臺內(nèi)，用PBS沖干凈，轉(zhuǎn)移到盛有20%FBS-LGDMEM的培養(yǎng)皿中，去除長骨2端骨骺，暴露骨髓腔。用培養(yǎng)液沖出骨髓腔內(nèi)的骨髓液，吹打。用200目篩網(wǎng)過濾后置于離心管中，1000rpm,10min，棄上清，用10%FBS-LGDMEM培養(yǎng)液重懸后以10×108/mL接種于塑料培養(yǎng)瓶中。37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)，24h換液，以后每3d換液一次，除去非貼壁細(xì)胞，12~15d后MSC達90%瓶底面積時傳代，P1后細(xì)胞融合至80%進行1：2傳代。

1.7 MSC的鑒定

當(dāng)?shù)?代的BMSCs融合達90%,經(jīng)0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化、離心后用PBS制成2×106/mL的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液分裝至4只樣品管中，分別加入熒光標(biāo)記的小鼠抗大鼠單抗CD34-FITC+小鼠抗大鼠單抗CD90-PE，小鼠抗大鼠單抗CD34-FITC+小鼠抗大鼠單抗CD44-PE及其對應(yīng)的同型對照各10μL，混勻，37℃下避光反應(yīng)20min。每管加入1mLPBS混勻，離心2000rpm，10min以洗去未標(biāo)記上的抗體。棄上清液，每管再加入1mLPBS重新混懸細(xì)胞,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面抗原CD34、CD44和CD90的表達。對細(xì)胞純度進行鑒定。

1.8 MSC體外誘導(dǎo)成視網(wǎng)膜細(xì)胞

取第3代BMSCs細(xì)胞消化、離心后用10%FBS-LGDMEM重懸后以200ul/孔接種于6孔板，24h待BMSC貼壁后，棄培養(yǎng)液，將細(xì)胞分為3組：第1組換用條件培養(yǎng)液Ⅰ，第2組換用條件培養(yǎng)液Ⅱ，第三組換用條件培養(yǎng)液Ⅲ，3個組均在在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育。每天觀察記錄細(xì)胞生長分化情況，每2天換一次條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第7~8天時停止。

1.9 誘導(dǎo)的BMSCs細(xì)胞免疫化學(xué)染色

采用Envision二步法，分別將3組誘導(dǎo)的MSC玻片取出，均與神經(jīng)元特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠醇化酶(NSE)（稀釋度1：50）（美國Fisher Scientific公司）、星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠單克隆抗體神經(jīng)膠質(zhì)酸性蛋白(GFAP)（稀釋度1：50）（美國Fisher Scientific公司）、光感受器特異性標(biāo)志小鼠抗大鼠單克隆抗體視紫質(zhì)(Rhodopsin)（稀釋度1：50）（美國Fisher Scientific公司）和二抗（生物素標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體）作用，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidin,DAB）顯色后，蘇木素復(fù)染，室溫干燥后封片，光鏡下觀察是否表達視紫紅質(zhì)、NSE、GFAP。選取至少10個隨機視野，每個視野在200倍物鏡下統(tǒng)計陽性細(xì)胞數(shù)和整個視野細(xì)胞總數(shù)，計算陽性細(xì)胞率，測量值均以x±s表示，來對三種誘導(dǎo)條件下所表達的陽性細(xì)胞進行分析。

1.10 數(shù)據(jù)分析方法

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并進行雙因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠視網(wǎng)膜片光損傷電鏡觀察所見:光損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層，可見光感受器外段腫脹成圓形，盤膜結(jié)構(gòu)紊亂，疊狀結(jié)構(gòu)解離，膜間隙增大。內(nèi)節(jié)線粒體固縮和腫脹，空泡變性。染色質(zhì)濃染，核膜皺縮內(nèi)陷。

2.2 大鼠MSC細(xì)胞的鑒定(如圖1)

圖1 大鼠MSC細(xì)胞的鑒定

BMSCs流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果，培養(yǎng)的第三代BMSCs干細(xì)胞表面標(biāo)志CD90陽性（CD90+/CD34-：92%），基質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志CD44陽性（CD44+/CD34-：93%）

2.3 誘導(dǎo)分化的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（如圖2）

A：3天后原來梭形的BMSCs胞體發(fā)生收縮，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞邊緣變得不規(guī)整，有零星的細(xì)胞突起×300；B：4天后BMSCs有較多突起×300；

2.4 誘導(dǎo)分化的視網(wǎng)膜樣細(xì)胞不同誘導(dǎo)條件下免疫細(xì)胞化學(xué)染色表達指標(biāo)陽性率

表1 不同誘導(dǎo)條件下免疫細(xì)胞化學(xué)染色表達指標(biāo)陽性率

注：均方比F值為7.6054，F(xiàn)0.05=6.944，可見視網(wǎng)膜片三組間兩兩比較差異有顯著性（P ＜0.05）。

3 討論

3.1 視網(wǎng)膜光損傷

視網(wǎng)膜是接受光能，形成視覺的重要組織結(jié)構(gòu)，但也是眼組織中最易受到光損傷的部位。如果光照強度或光照時間超過了視網(wǎng)膜的承受能力，將會造成視網(wǎng)膜光損傷。

本實驗采用（50W,12V的鹵素?zé)糇鳛楣庠矗扇≈甭涫秸丈渖鲜龅男∨囵B(yǎng)皿，1950 ±200Lux）主要是考慮到以下幾點：①視網(wǎng)膜光損傷受諸多因素影響，內(nèi)在因素包括視網(wǎng)膜部位、體溫、膚色、年齡、種屬、營養(yǎng)狀態(tài)及晶體狀況，外在因素包括視網(wǎng)膜暗適應(yīng)狀態(tài)、光照射方式、光強度、波長和光照時間。因此本實驗選擇單純照射細(xì)胞而不是照射活體動物來盡量排除內(nèi)在因素的干擾，選擇成年SD白鼠是考慮到有研究表明白種人較黑種人容易損傷，大白鼠視網(wǎng)膜對光的敏感性隨著年齡的增加而增高。②視網(wǎng)膜光化學(xué)損傷的敏感性隨著光波長的縮短而呈對數(shù)上升，因此短波長更易引起視網(wǎng)膜光損傷，角膜可吸收<295nm的紫外線，晶體可吸收波長<400nm，而且短波長的近紫外光引起的視網(wǎng)膜損傷主要位于色素上皮層，而我們?nèi)〉腟D大鼠視網(wǎng)膜片只有神經(jīng)上皮層，所以不考慮用紫外光進行光損傷。紅外光波長大于可見光，造成視網(wǎng)膜損傷不僅有光化學(xué)損傷還有熱損傷，并且以損傷視網(wǎng)膜色素細(xì)胞為主，而光化學(xué)損傷在視網(wǎng)膜光損傷中最具普遍性和重要性，可見光造成視網(wǎng)膜光損傷屬于光化學(xué)損傷，而且可見光為隨處可見光源，并可到達人眼視網(wǎng)膜，因此最終考慮用鹵素?zé)糇鳛楣鈸p傷光源。③光對視網(wǎng)膜損傷有3種方式：熱損傷、機械損傷、光化學(xué)損傷。要注意避免光照時溫度的升高，因為溫度升高可以增加視網(wǎng)膜光損傷的易感性，溫度每升高2℃，視網(wǎng)膜損傷閾較正常體溫降低5~10倍，要使溫度變化在10℃以內(nèi)以排除溫度升高引起細(xì)胞光熱損傷的可能[1]。④照射時間相同時，照射強度增加，損傷加重。光照強度相同條件下，光照時間越長，損傷越重。Semple-Rowland提出65~130lux為損傷的閾值，宋憶淑等將裝有RPE細(xì)胞的6孔培養(yǎng)板放在光照器下，鹵鎢燈為光源，(1950±200)Lx的光照強度，持續(xù)光照30min，光照結(jié)束后．繼續(xù)培養(yǎng)。分別于光照結(jié)束后30 min及2 h對培養(yǎng)的RPE細(xì)胞進行倒置相差顯微鏡觀察。同時采集培養(yǎng)的RPE細(xì)胞，進行透射電鏡觀察根據(jù)預(yù)實驗電鏡結(jié)果，隨著光照后培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞出現(xiàn)損害的程度逐漸加重，受損的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多[2]。

3.2 MSC細(xì)胞分離、培養(yǎng)、鑒定

用組織工程技術(shù)體外分離和培養(yǎng)所需靶細(xì)胞，用于體內(nèi)相關(guān)疾病的細(xì)胞替代治療為多種疾病帶來了新的治療思路。因此有關(guān)此類的研究受到廣泛關(guān)注。胚胎干細(xì)胞具有發(fā)育全能性，但涉及倫理學(xué)問題，以往受到很大限制，發(fā)展緩慢。應(yīng)用眼色素上皮緣的視網(wǎng)膜干細(xì)胞[3]及鼠腦神經(jīng)先祖細(xì)胞移植[4]也由于供體組織有限性及安全性問題，不利于治療視網(wǎng)膜疾病的開展。于是有人把目光投向成體干細(xì)胞中的MSCs，因其來源于中胚層，可以跨系統(tǒng)甚至跨胚層分化為3個胚層來源的細(xì)胞，特別是中胚層和神經(jīng)外胚層來源組織的細(xì)胞（視網(wǎng)膜來源于胚胎期神經(jīng)外胚層），并且經(jīng)過20~30次細(xì)胞分裂后，這種分化特性也不會消失[5]。且分離培養(yǎng)方便。MSC存在于體內(nèi)多處如胎血、胎肝、胎脾、胎兒的骨髓以及成人骨髓[6], 臍血、脂肪組織和成人的外周血中亦含有數(shù)量極少的間質(zhì)干細(xì)胞[7]，現(xiàn)多從骨髓中分離獲得。MSC的純化方法有貼壁篩選法，流式細(xì)胞儀分選法，密度梯度離心法，免疫磁珠法。較常采用的方法為貼壁篩選法和密度梯度離心法，或兩者聯(lián)合。MSCs的表面標(biāo)志具有非單一性，表達了間質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和表皮細(xì)胞的表面標(biāo)志，一般認(rèn)為CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD120a、CD124、CD166以及STRO-1、SH2、SH3是其重要的標(biāo)志物，流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)不表達造血細(xì)胞表面抗原如CD34、CD45、CD11a、CD14。如果能找到更特異性標(biāo)記物，就可以獲得更純的MSCs，這對后續(xù)的實驗步驟所得的實驗數(shù)據(jù)有重要影響。前2種方法分離所獲得的細(xì)胞純度較低,但具有良好的細(xì)胞分化能力。應(yīng)用流式細(xì)胞儀技術(shù)和磁性分選技術(shù)針對細(xì)胞表面標(biāo)志進行富集和分離,分選效率和純度均較高[8-9]。

3.3 MSC體外誘導(dǎo)成視網(wǎng)膜細(xì)胞

目前國內(nèi)外主要用生長因子誘導(dǎo)MSCs分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞。Anthony K等[8]發(fā)現(xiàn)EGF、taurine或activinA體外誘導(dǎo)大鼠MSCs，有20%~32%表達視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞的表面抗原視紫紅質(zhì)。Anthony K等[8]應(yīng)用activinA（活化蛋白A），?；撬岷虴GF對成人CD90+MSCs體外誘導(dǎo)分化后，20%-32%的細(xì)胞表達感光細(xì)胞特異標(biāo)志—視紫紅質(zhì)，視蛋白，recoverin。非視網(wǎng)膜來源的，可替代視網(wǎng)膜細(xì)胞功能的自體細(xì)胞是細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾病和視神經(jīng)損傷的理想種子細(xì)胞，目前國外有少量研究發(fā)現(xiàn)MSCs視網(wǎng)膜下移植可誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞，但由于體內(nèi)局部微環(huán)境復(fù)雜，影響因素繁多，移植細(xì)胞的分化方向不確定，往往無法定向分化成所需細(xì)胞，存在表達增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變的潛在危險。而體外誘導(dǎo)MSCs定向分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞仍是當(dāng)前研究的難點。國內(nèi)外僅數(shù)篇文獻報道用視網(wǎng)膜片培養(yǎng)上清液體外誘導(dǎo)MSCs分化為視網(wǎng)膜樣細(xì)胞，但均未對培養(yǎng)上清液成分進行具體分析檢測，分析其有效成分。本實驗探索體外誘導(dǎo)MSCs定向分化的新途徑，可進一步進行蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測不同誘導(dǎo)微環(huán)境的蛋白差異，為構(gòu)建MSC體外誘導(dǎo)分化為視網(wǎng)膜細(xì)胞的微環(huán)境提供理論支持。這不僅解決了直接將MSCs體內(nèi)移植分化方向不確定的問題，以及應(yīng)用異體的人視網(wǎng)膜片誘導(dǎo)時可能引發(fā)排斥反應(yīng)等問題。

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1.福建省重點科研課題(基金編號2008Y0040)；2.國家衛(wèi)生部科研基金課題(基金編號:WKJ2008Y004-2-61)。

徐國興，zjfmuxgx@pub5.fz.fj.cn。