鐘鳳林 郭志雄 潘東明

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琯溪蜜柚汁胞ACTIN的分離鑒定和cDNA克隆

鐘鳳林1,2郭志雄1潘東明2

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院 2.福建農(nóng)林大學(xué)園藝產(chǎn)品貯藏保鮮研究所

對(duì)琯溪蜜柚粒化與正常汁胞雙向電泳分析，獲得一個(gè)在粒化中上調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，經(jīng)過(guò)質(zhì)譜鑒定、生物信息學(xué)分析，為肌動(dòng)蛋白(Actin)，以琯溪蜜柚?；鹀DNA為模板，根據(jù)Actin氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行全長(zhǎng)的擴(kuò)增，得到Actin開(kāi)放閱讀框包含1134堿基，編碼377氨基酸。其核酸序列與黑楊派(Populus trichocarpa)、棉花(Gossypium hirsutum）、蓖麻(Ricinus communis）、圓葉錦葵(Malva pusilla) ACT的同源性在89%以上。

琯溪蜜柚 ACTIN 雙向電泳 串聯(lián)質(zhì)譜 克隆

肌動(dòng)蛋白(Actin)是真核生物細(xì)胞中普遍存在的一種重要的蛋白質(zhì)，構(gòu)成細(xì)胞骨架中的微絲(Microfilament)系統(tǒng)，參與真核生物細(xì)胞的許多重要的生命活動(dòng)[1]。肌動(dòng)蛋白是單一多肽鏈的球狀蛋白質(zhì)(G-actin)，由375~377個(gè)氨基酸殘基所組成，分子量為42kD。生物體中包含7個(gè)肌動(dòng)蛋白基因，編碼不同的肌動(dòng)蛋白同工蛋白質(zhì)。高等植物肌動(dòng)蛋白在進(jìn)化過(guò)程中保持高度的保守性和同源性，且具有組織和器官特異性的表達(dá)。研究肌動(dòng)蛋白在擬南芥表皮毛中排列與分布時(shí)發(fā)現(xiàn)，肌動(dòng)蛋白對(duì)細(xì)胞形態(tài)與生長(zhǎng)極性尤為重要，在表皮毛發(fā)育過(guò)程中破壞肌動(dòng)蛋白會(huì)引起表皮毛彎曲和分支[2]。Baluska等在研究擬南芥和Rye幼苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有F-actin條件下細(xì)胞一樣可以分裂，但植物會(huì)變矮，說(shuō)明F-actin是細(xì)胞伸長(zhǎng)所必需[3]。范小平等通過(guò)RNAi序列構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化棉花，表明RNAi載體轉(zhuǎn)基因植株棉纖維發(fā)育遲緩或受到抑制，但GhACT1只是屬于影響纖維生長(zhǎng)的多基因中的一個(gè)，而不是唯一決定棉纖維長(zhǎng)度的基因[4]。

琯溪蜜柚 ((L.) Osbeck) 原產(chǎn)福建省平和縣琯溪河畔，是我國(guó)蜜柚優(yōu)良品種之一，有400多年的栽培歷史。柑橘果實(shí)?；浅墒炱诤筒珊筚A藏期的生理病害。其主要表現(xiàn)為汁胞異常膨大，變硬，汁胞木質(zhì)化，風(fēng)味變淡，一般情況下為囊瓣近蒂端汁胞先發(fā)生?；鬂u向果心發(fā)展，果心處長(zhǎng)形汁胞最為嚴(yán)重[5-7]。通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究?；c正常汁胞，對(duì)獲得的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行分離、鑒定和cDNA克隆，為從轉(zhuǎn)錄水平了解粒化的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 材料

2007年9月18日，琯溪蜜柚采至福建省平和縣小溪村大坑果園，選擇大小均勻，色澤一致、無(wú)病蟲(chóng)、無(wú)損傷的果實(shí)。當(dāng)日從平和寄回實(shí)驗(yàn)室，掰開(kāi)果實(shí)，液氮處理、保存、備用。

1.2 雙向凝膠電泳

取琯溪蜜柚汁胞，總蛋白的提取、蛋白質(zhì)含量測(cè)定及雙向電泳等參照賴(lài)呈純等(2009) 的方法[8]。

1.3 差異表達(dá)蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定

差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行脫色、膠內(nèi)胰酶酶切(in-gel digestion)和肽段提取，然后進(jìn)行肽質(zhì)量指紋譜(Peptide Mass Fingerprinting，PMF)分析。檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為NCBInr；檢索種屬為：all，數(shù)據(jù)檢索的方式為combined；最大允許漏切位點(diǎn)為1；酶為胰蛋白酶。質(zhì)量誤差范圍設(shè)置：PMF 0.3 Da，MS/MS 0.4 Da；在數(shù)據(jù)庫(kù)檢索時(shí)胰酶自降解峰和污染物質(zhì)的峰都手工剔除[9,10]。

1.4 琯溪蜜柚汁胞RNA提取及總RNA含量和濃度測(cè)定

取琯溪蜜柚汁胞樣品，參照鐘鳳林等方法提取RNA[11]。

1.5 琯溪蜜柚汁胞中ACTIN cDNA ORF的克隆

1.5.1 cDNA合成及引物設(shè)計(jì)

按Invitrogen RT-PCR、3'和5'-RACE說(shuō)明書(shū)中附加方案說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。

根據(jù)ACTIN [Gossypium hirsutum] (gi|32186906)在蛋白的起始位置和結(jié)尾設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)擴(kuò)增。引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成。

ACTR(Nco I): 5'- GCATA CCATGG TTAGAAGCAC TTCCTGTGGA CAATGGA

ACTF(Nde I): 5'- GCATA GTATAC ATG GCC GAT GCT GAG GAT ATT C

1.5.2 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5.0min，94℃ 45s，63℃ 45s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.5.3序列測(cè)定、序列分析

膠回收PCR產(chǎn)物，連接、轉(zhuǎn)化、涂板、篩選和PCR鑒定。菌液送上海英駿公司進(jìn)行測(cè)序。序列通過(guò)Expasy、NCBI網(wǎng)址和DNAMAN軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異蛋白質(zhì)點(diǎn)APX的獲得

正常汁胞和?；偟鞍椎碾p向電泳差異比較后，把其中的50個(gè)差異蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)過(guò)膠內(nèi)酶解、MAIDI-TOF-TOF MS以及MASCOT搜索，得到差異蛋白質(zhì)點(diǎn)為Actin (圖1為琯溪蜜柚?；^(guò)程中的差異蛋白質(zhì)Actin的局部放大示意圖)。獲得高品質(zhì)肽質(zhì)量指紋(PMF)(圖2 A)，然后根據(jù)PMF自動(dòng)選取5個(gè)的峰形最好、強(qiáng)度最高的肽離子送入CID碰撞，得到的碎片離子再用TOF質(zhì)譜分析獲得肽碎片指紋(FFP: fragment fingerprint 圖2 B)。使用MASCOT的離子搜索模式搜索蛋白質(zhì)NCBInr綠色植物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)得到匹配的蛋白(圖2 C、D)。Actin其與棉花()actin Score為393。

注：A為正常汁胞；B為?；?；↑表示表達(dá)量上升

注：A為PMF；B為FFP；C為檢索值；D為匹配的結(jié)果

2.2 Actin cDNA ORF的克隆與分析

2.2.1 RNA的提取及質(zhì)量分析

用Trizol法提取琯溪蜜柚?；俁NA，電泳檢測(cè)顯示(圖3，M為DL2000 Marker)，分離得到的總RNA的質(zhì)量較好，條帶完整，紫外檢測(cè)和分析，提取分離得到的總RNA其A260/ A280值為1.90，說(shuō)明該樣品純度高，適合PCR擴(kuò)增。

圖3琯溪蜜柚汁胞RNA電泳結(jié)果

2.2.2 ACTIN ORF 擴(kuò)增結(jié)果

將開(kāi)放閱讀框的兩端加上酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基后設(shè)計(jì)引物，以帶Oligo-dT的接頭引物的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增ORF，電泳結(jié)果獲得了大小約為1100bp的特異產(chǎn)物(圖4，M為DL2000 Marker)。膠回收純化該片段，連接、轉(zhuǎn)化、涂板、篩選和PCR鑒定，送菌液測(cè)序。菌液提取質(zhì)粒后進(jìn)行測(cè)序。

圖4 琯溪蜜柚汁胞的ORF電泳圖

下劃線、方框表示引物區(qū)

測(cè)序后得到的cDNA序列長(zhǎng)為1156，開(kāi)放閱讀框(ORF)共有1134個(gè)堿基組成，編碼377個(gè)氨基酸，ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子。通過(guò)expasy分析，氨基酸位點(diǎn)55~65具有Actins signature1信號(hào)，氨基酸位點(diǎn)106~118具有Actins and actin-related proteins signature信號(hào)，氨基酸位點(diǎn)358-366具有ACTINS signature2信號(hào)(圖5)。

序列分析表明，琯溪蜜柚ACTIN cDNA的核苷酸序列以及推導(dǎo)的氨基酸序列與許多植物來(lái)源的ACT有很高的同源性。其核酸序列與黑楊派()的ACT1、ACT9、棉花(）ACT1、ACT11同源性高達(dá)90%，與蓖麻(）ACT、圓葉錦葵() ACT、棉花(）ACT4、ACT8、ACT9的同源性89%。

2.2.3 Actin ORF推導(dǎo)的氨基酸與其它植物Actin氨基酸序列比對(duì)

由DNAMAN軟件分析可知，Actin cDNA編碼377個(gè)氨基酸，理論分子量為41.7014KD，理論等電點(diǎn)(pI)為5.45，屬酸性或陰離子型。經(jīng)由DNAMAN軟件分析比對(duì)后得到與黑楊派(Populus trichocarpa)的ACT1、ACT9、棉花(Gossypium hirsutum）ACT1、ACT11等的氨基酸序列比對(duì)圖(圖6)，可知：ACT 與推導(dǎo)的氨基酸的同源性都達(dá)到了99％以上。

圖6 Actin cDNA編碼氨基酸序列與其它植物ACTIN的多重序列比對(duì)

3 討論

在高等植物中，肌動(dòng)蛋白在進(jìn)化過(guò)程中保持高度的保守性和同源性，以基因家族形式存在，可分為營(yíng)養(yǎng)體基因與生殖細(xì)胞基因，并且肌動(dòng)蛋白的表達(dá)有組織、器官特異性和發(fā)育階段特異性[12-14]。肌動(dòng)蛋白骨架對(duì)植物高度特異化的細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生和功能起著重要作用，同時(shí)在高等植物形態(tài)發(fā)生的細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)過(guò)程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[15，16]。Li等從cDNA文庫(kù)中篩選出15個(gè)actin基因中，real-time PCR結(jié)果表明有5個(gè)肌動(dòng)蛋白基因在纖維中特異表達(dá)，推斷在GhACT1缺失時(shí)，其他4個(gè)基因仍正常行使功能，彌補(bǔ)和維持纖維生長(zhǎng)，使纖維繼續(xù)伸長(zhǎng)，尤其在伸長(zhǎng)期后期GhACT1的缺失對(duì)纖維伸長(zhǎng)的影響甚微[17]。

本研究通過(guò)分離、鑒定和克隆，獲得了Actin的cDNA全長(zhǎng)，并表明在琯溪蜜柚汁胞發(fā)育階段的?；蠥ctin表達(dá)的變化，可能是Actin與肌球蛋白的相互作用，參與了細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)活動(dòng)，使得琯溪蜜柚汁胞生長(zhǎng)與延伸發(fā)生改變，猜測(cè)其對(duì)構(gòu)建細(xì)胞骨架和適應(yīng)多樣脅迫環(huán)境變化有著重要作用。有關(guān)這方面的有待進(jìn)一步進(jìn)行。

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