包麗霞,殷 瑜,楊 天,楊和行,錢秀萍＊

(1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院,上海 200240;2.上海來益生物藥物研發(fā)中心,上海 201203)

細辛為馬兜鈴科細辛屬藥用植物,應(yīng)用歷史悠久,功效顯著,史載于《神農(nóng)本草》?！吨袊幍洹?2005年版)將北細辛(Asarum heterotropoides var.Mandsh uricum(Maxim.)Kitag.)、漢城細辛(Asarum sieboldiivar.seoulense Nakai.)和華細辛(Asarum sieboldii)列為正品,北細辛列正品之首[1]。北細辛為北方主要道地中草藥,藥用成分為揮發(fā)油,全草入藥,具有發(fā)表散寒、溫肺祛痰的功效[2]。體外試驗證明,細辛浸膏對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、痢疾桿菌及傷寒桿菌有抑制作用,其煎劑對結(jié)核桿菌、傷寒桿菌有抑制作用[3]。植物內(nèi)生菌具有生物多樣性的特點,不僅能夠參與植物次生代謝產(chǎn)物的合成以及對植物次生代謝產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化,還能獨立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物,是天然產(chǎn)物的重要來源和具有高度開發(fā)價值的新型生物資源。近十年來植物內(nèi)生菌及其活性代謝產(chǎn)物成為微生物學(xué)研究的一大熱點[4-6]。從北細辛中分離植物內(nèi)生真菌,以及對其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物進行活性研究的報道至今未見。文中對3株川北細辛、四川北細辛、陜西北細辛進行了內(nèi)生真菌的分離和鑒定,并檢測其代謝產(chǎn)物對肺癌細胞、乳腺癌細胞和胰腺癌細胞的抑制作用,以及靶向抑制脂肪酸合成的抗菌活性,旨在為開辟抗菌抗腫瘤藥物新途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 北細辛(Asarum heterotropoides var.Mandshuricum(Maxim.)Kitag.) 川北細辛、四川北細辛、陜西北細辛于2009年8月采自四川、陜西,由上海交通大學(xué)藥學(xué)院劉忠副教授鑒定。

1.1.2 腫瘤細胞株 A549(肺癌細胞);MDAMB-231(乳腺癌細胞);PANC-1(胰腺癌細胞),由上海來益生物藥物研發(fā)中心保藏。

1.1.3 檢定菌株 E.coliTOP10/pHN678(對照菌株);E.coliTOP10/pHNA(酰基載體蛋白ACP特異性敏感工程菌);E.coliTOP10/pHNF(脂肪酸合成酶FabI特異性敏感工程菌)。由上海來益生物藥物研發(fā)中心保藏。

1.1.4 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基(馬鈴薯葡萄糖瓊脂);固體發(fā)酵培養(yǎng)基：大米4 g,水5 mL;LB培養(yǎng)基(Solarbio);F12K培養(yǎng)基(Sigma);RPM I培養(yǎng)基(Gibco);DMEM培養(yǎng)基(Gibco)。

1.1.5 主要試劑和儀器 Tris(Amersco),MTT(Amersco),胎牛血清(Hyclone),SDS、苯酚-氯仿、RNAse、dNTP、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、IPTG、Amp、戊基泛酸、三氯生、通用引物ITS1和ITS4(上海生工生物),其他試劑均為化學(xué)純;PCR儀(Eppendorf),MK-2全自動酶標儀(Thermo),CO2培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離[7]將3株新鮮的北細辛沖洗干凈,除去泥土等大顆粒,用95%乙醇浸泡1 min,無菌水沖洗2次后用9%次氯酸鈉浸泡5 min。再用無菌水沖洗3次后用95%乙醇浸泡30 s,然后用無菌水沖洗3次。將上述處理好的樣品切成0.5 cm長的小塊置于含氯霉素(80 U/mL)的PDA平板,每個平板放置6～8塊,28℃恒溫靜置培養(yǎng),3～5 d后,培養(yǎng)基上長出菌絲,挑取菌絲于PDA平板,經(jīng)純化后得到表觀形態(tài)不一的內(nèi)生真菌。表面消毒最后1次沖洗后的無菌水,取少量涂布于含氯霉素(80 U/mL)的PDA平板,28℃恒溫培養(yǎng),觀察是否有真菌長出。

1.2.2 真菌總DNA的提取 將純化菌株的孢子和菌絲接入PDA培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)3 d后獲得菌體。在2 mL離心管內(nèi)裝入400μL的玻璃珠(Ф=0.5 mm),1×105Pa滅菌20 min,在離心管內(nèi)加入400～500μL TE(pH 8.0)緩沖液和40μL 10%SDS,然后加入少量菌絲,振蕩4 min,10 000 r/min離心8 min;取上清,加入等量(約400μL)苯酚-氯仿,振搖數(shù)次,12 000 r/min離心3 min;取上清,加入等量氯仿,振搖數(shù)次,12 000 r/min離心3 min;取上清,加入等量異丙醇,混勻,12 000 r/min離心5 min;棄上清,加入500μL 70%乙醇,12 000 r/min離心5 min,重復(fù)2次;加入30～40 μL含RNAse TE緩沖液,37℃水浴30 min。

1.2.3 PCR擴增 利用真菌18S rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer,ITS)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,正向)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,反向)擴增純化菌株的r DNA的ITS區(qū)[8]。反應(yīng)體系(50 μL)：超純水35.75μL,10×擴增緩沖液5μL,25 mmol/L MgCl22μL,2.5 mmol/L dNTP 2μL,10 μmol/L ITS1引物2μL,10μmol/L ITS4引物2 μL,10 U/L熱穩(wěn)定DNA聚合酶0.25μL,模板DNA 1μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min,94℃變性1 min,55℃復(fù)性30 s,72℃延伸1 min,共30個循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物由上海美季生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.4 序列分析 將獲得的序列通過Blast程序在GenBank上進行相似性序列檢索,將其序列連同其近似序列導(dǎo)入MEGA version 4.1中進行比對,利用鄰位互換算法(CN I)搜索最小進化樹(ME tree),并進行500次重復(fù)的自展檢驗(boot-strap),將ME樹上與之最接近的種類確定為分離菌株可能的種類,并參照文獻[9]進行分類歸屬。1.2.5 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物制備 將純化內(nèi)生真菌菌株接種于大米固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,28℃恒溫靜置培養(yǎng)30 d后,用甲醇◇丙酮◇丁酮=1◇3◇1浸泡培養(yǎng)物4 h。3 500 r/min離心5 min后,上清液待測。

1.2.6 抗腫瘤活性檢測 腫瘤細胞A549采用F12K培養(yǎng)基,MDA-MB-231采用RPM I培養(yǎng)基,PANC-1采用DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(3-(4,5-dimethy-2-thiazoly)-2,5-diphenyl-2H-tetyazoliumbromide,MTT)檢測樣品的抗腫瘤活性[10]。

1.2.7 體外抑菌活性檢測[11]以E.coli TOP10/pHN678為對照菌株,ACP和FabI抑制劑高度敏感的E.coliTOP10/pHNA和E.coli TOP10/pHNF為檢定菌株測定抗菌活性。將E.coliTOP10/pHN678、E.coliTOP10/pHNA和E.coliTOP10/pHNF接種于LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜,分別加至反應(yīng)液(20 mL LB液+7.5μL IPTG)中,使菌濃為OD600nm=0.1、IPTG終濃度為37.5μmol/L,標記為678液、HNA液和HNF液。取96孔板分別加入100μL含對照菌和檢定菌的678液、HNA液和HNF液,再分別加入5μL待測樣品。E.coliTOP10/pHN678對照菌株組設(shè)Amp陰性對照、戊基泛酸陽性對照和三氯生陽性對照;E.coliTOP10/pHNA和E.coliTOP10/pHNF分別設(shè)Amp陰性對照和戊基泛酸陽性對照,及Amp陰性對照和三氯生陽性對照。37℃80 r/min過夜培養(yǎng),用酶標儀測定OD600nm值。按下列算式計算抑制率：

2 結(jié)果與討論

2.1 北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌的分離

高濃度殺菌劑短時間處理比低濃度殺菌劑長時間處理更適合植物內(nèi)生真菌的分離[12]。本實驗表面消毒法采用高濃度次氯酸鈉(9%)浸泡5 min,最后一次洗滌的無菌水在PDA培養(yǎng)基上沒有長菌,說明表面消毒較徹底,分離到的內(nèi)生真菌確是北細辛的內(nèi)生真菌,而不是表面的附生菌。川北細辛、四川北細辛、陜西北細辛為北細辛的3個不同種,本實驗中分離到川北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌6株,四川北細辛和陜西北細辛的優(yōu)勢內(nèi)生真菌分別為2株。這10株內(nèi)生真菌的形態(tài)特征不同(表1),表明植物生長地區(qū)和品種不同,其優(yōu)勢內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量也不相同,其中川北細辛的內(nèi)生真菌生物多樣性較為豐富。本實驗相對分離到較少內(nèi)生菌,其原因可能是：①3株北細辛僅生長1～2片真葉,生長年限較短,按植物內(nèi)生真菌侵入的起源學(xué)說[13],內(nèi)生真菌較少;②在PDA培養(yǎng)基上優(yōu)勢菌株生長很快,搶奪了弱勢菌株的營養(yǎng);③有很多內(nèi)生真菌(尤其是專性寄生內(nèi)生真菌)即便用不同的培養(yǎng)基進行分離,也不能在人工培養(yǎng)基上生長[14];④分離時只挑取了表觀形態(tài)不同的真菌進行培養(yǎng),導(dǎo)致表觀形態(tài)相同但可能種屬不同的內(nèi)生真菌的遺漏。

表1 北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of predominant endophytic fungi from Asarum heterotropoides

2.2 北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌的鑒定

經(jīng)PCR擴增和ITS序列測序,10株北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌的ITS序列與GenBank登錄的17株真菌的相似性在97%以上(表2)。序列結(jié)果在NCB I上Blast比對后,構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。根據(jù)親緣關(guān)系的遠近,再參照文獻[9]對內(nèi)生真菌進行分類歸屬。10株內(nèi)生真菌分屬于子囊菌門(Ascomycota)和半知菌類(Fungi Imperfecti)的3個綱4個目5個科5個屬,如表3所示。北細辛內(nèi)生真菌中以柄孢殼菌屬(Podospora)最多,小叢殼屬(Glom erella)和鐮孢屬(Fusarium)次之。

表2 優(yōu)勢內(nèi)生真菌ITS序列相似性分析Table 2 Similarity of the ITS sequence from the predominant endophytic fungi

圖1 根據(jù)ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree on the basis of ITS sequences

表3 北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌的組成Table 3 Predominant endophytic fungi from Asarum heterotropoides

在3株不同來源的北細辛中分離到的優(yōu)勢菌株種類和數(shù)量也存在差異,如表4所示。川北細辛中的優(yōu)勢菌株種類和數(shù)量最多,而陜西北細辛的優(yōu)勢內(nèi)生真菌種類僅一種且不同于其余2種北細辛的內(nèi)生菌。

表4 北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌的分類Table 4 Genus of predominant endophytic fungi fromAsarum heterotropoides

2.3 北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抗腫瘤活性

表5 北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌的抗腫瘤活性Table 5 Antitumor activities of predominant endophytic fungi fromAsarum heterotropoides

檢測10株內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物抗肺癌細胞(A549)、乳腺癌細胞(MDA-MB-231)和胰腺癌細胞(PANC-1)的活性,結(jié)果如表5所示。菌株E1、E5、E8和E9對A549、MDA-MB-231或PANC-1細胞各有不同程度的抑制活性,其中從陜西北細辛中分離的鐮孢屬(Fusariumsp.)菌株E9的抗腫瘤活性最高,對3種腫瘤細胞均有超過75%的抑制率。

2.4 北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌的抗菌活性

表6 北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌的抗菌活性Table 6 Antibacterial activities of predominant endophytic fungi from Asarum heterotropoides

脂肪酸合成對細菌的存活至關(guān)重要。脂肪酸合成酶(FAS)系統(tǒng)的亞基蛋白已成為基因組驅(qū)動的新型抗菌藥物靶標研究的熱點。?；d體蛋白(ACP)和NADH依賴的烯?；?ACP還原酶(FabI)是催化脂肪酸合成的主要功能酶,廣泛存在于細菌中,在細菌脂肪酸生物合成中起著必要的調(diào)節(jié)作用[15]。通過抑制ACP和FabI活性,可抑制脂肪酸的生物合成而致細菌死亡。

本實驗以E.coliTOP10/pHNA(?；d體蛋白ACP特異性敏感工程菌)和E.coliTOP10/pHNF(脂肪酸合成酶FabI特異性敏感工程菌)為生物檢定菌,檢測10株內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物對靶點ACP或FabI的抑制活性,結(jié)果見表6。刺盤孢屬(Colletotrichumsp.)菌株E6和小叢殼屬(Glom erellasp.)菌株E7僅有針對FabI靶點的抗菌活性。小叢殼屬(Glom erellasp.)菌株E1和葉點霉屬(Phyllostictasp.)菌株E2具有靶向ACP和FabI的抗菌活性,且抗FabI的活性較強,抑制率達59%。

3 結(jié) 論

內(nèi)生真菌存在于目前所有已研究的植物中。細辛生長緩慢,通常從播種到開花結(jié)果需5～6 a[3],這給細辛有效成分的開發(fā)利用帶來很大困難。而許多植物內(nèi)生菌在長期的自然選擇下能夠產(chǎn)生與寄主植物相同或相似的具生物活性的次級代謝產(chǎn)物,這為發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物、開發(fā)新藥及保護瀕危植物提供了重要的開發(fā)和利用途徑[16]。

本文對3株不同來源的北細辛優(yōu)勢內(nèi)生真菌進行了分離鑒定,各自分離到的優(yōu)勢菌株種類和數(shù)量各不相同,表明不同種類和生長地區(qū)的北細辛其優(yōu)勢內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量存在差異。對北細辛中分離到的10株優(yōu)勢內(nèi)生真菌進行了靶向脂肪酸合成的抗菌活性以及抗腫瘤活性篩選,獲得3株活性較高的菌株小叢殼屬(Glom erellasp.)菌株E1、葉點霉屬(Phyllostictasp.)菌株E2和鐮孢菌(Fusariumsp.)菌株E9,具有一定的潛在應(yīng)用價值,有可能會為抗腫瘤抗菌新藥的研究開發(fā)利用提供一條新的途徑。今后將進一步確定這些菌株發(fā)酵液中抗腫瘤抗菌活性物質(zhì)的組分及相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu),探明這些內(nèi)生真菌是否產(chǎn)生與宿主北細辛相同或相似的抗腫瘤抗菌成分或是產(chǎn)生了新的活性物質(zhì),并評價其應(yīng)用前景。

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