陳明輝,王開勝

(1新疆兵團農(nóng)九師畜牧獸醫(yī)站,額敏 834601;2石河子大學(xué)科技處,石河子832003)

豕鏈球菌(Streptococcus porcinus),鏈球菌屬的一個種,鏈球菌屬細菌屬共有30多個種,蘭氏分類法利用其群特異性抗原,將鏈球菌屬細菌分為20多個血清型。鏈球菌屬細菌不同種之間的致病性存在著較大差異。豕鏈球菌主要感染豬[1],也有感染人的報道[2],會導(dǎo)致豬喉部膿腫,敗血癥,而且在肺炎病例中有時也會分離出這種病菌。但我國醫(yī)學(xué)和動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域均未見關(guān)于該菌感染的報道。

新疆塔城某農(nóng)場本地成年牛發(fā)生了一種以流涎,狂躁或低頭呆立,視力障礙,咽喉水腫,腦膜出血為特征的疾病,整個病程中死亡11頭,我們對送檢頻死期撲殺的病牛腦組織、心血、肝、淋巴結(jié)及脾臟進行了病原的分離、培養(yǎng)和APISTREP20的生化鑒定,采用平板法觀察了細菌綿羊血和兔血的溶血情況,采用鏈球菌乳膠凝集診斷試劑對兩株分離株進行了蘭氏血清學(xué)分型鑒定,根據(jù)NCSL標(biāo)準(zhǔn)對常見的抗生素進行了藥敏實驗,并分3個組進行了實驗動物的感染實驗,以期為今后的鑒定診斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

培養(yǎng)基:LB綿羊血平板,鏈球菌選擇血平板,亞碲酸鉀血平板以及各種鑒定培養(yǎng)基均按常規(guī)方法配制;APISTREP20生化鑒定試劑購自法國梅里埃公司產(chǎn)品。

鏈球菌乳膠凝集分型診斷試劑盒(購自法國梅里埃公司產(chǎn)品)。

藥敏實驗用抗生素:青霉素、氨芐西林、頭孢噻肟鈉、四環(huán)素、紅霉素、鹽酸林可霉素、氯霉素。

1.2 方法

1.2.1 病料的分離、培養(yǎng)

無菌采取病料的腦、心血、肝、脾、淋巴,分別接種于LB血清肉湯中,分別置于10%CO2和需氧37℃培養(yǎng)24h;將病料分別涂片,并用瑞士和姬姆薩染色,鏡檢、觀察。

1.2.2 分離菌的形態(tài)及菌落特性

將初代培養(yǎng)物接種于LB綿羊血平板,鏈球菌選擇血平板,亞碲酸鉀血平板觀察菌落特征;對肉湯和平板培養(yǎng)物進行革蘭氏染色,觀察菌體形態(tài)。

1.2.3 分離菌的培養(yǎng)及生化特性

分離株經(jīng)24hLB血清肉湯培養(yǎng)后,分別接種于LB血清肉湯中(培養(yǎng)液成分中分別含2%NaCl、6.5%NaCl;調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH為9.6)培養(yǎng),觀察其對高鹽、高堿的耐受性,另外接種于LB血清肉湯中,分別置于10℃、40℃,觀察其對低溫、高溫的耐受性。

分離菌經(jīng)24hLB綿羊血平板純培養(yǎng)后,挑取單個菌落,分別按照說明書進行APISTREP20(法國梅里埃公司產(chǎn)品)進行生化反應(yīng)。

1.2.4 分離菌的藥物敏感性

采用用藥敏紙片法來檢測對抗生素藥物的敏感性。

方法:將分離株分別接種Mueller-Hinton肉湯(5%綿羊血),37℃18～24h。用滅菌的棉拭子蘸取上述搖勻的肉湯培養(yǎng)物,均勻地涂布到直徑90mm的Mueller-Hinton瓊脂(5%綿羊血)表面,最后沿平板內(nèi)緣涂布1周,每一菌株涂2塊血平板。經(jīng)室溫干燥3～5min,用無菌鑷子將藥敏紙片緊貼于平板表面(每塊平板貼6種藥敏紙片),紙片與平板內(nèi)緣相距約8mm。37℃18～24h后記錄結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn):參照美國實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCLS)藥敏試驗紙片擴散法法規(guī)。

1.2.5 分離菌的血清學(xué)特性

采用鏈球菌乳膠凝集分型診斷試劑盒(Streptococcusgroupingkit)。取經(jīng)過生化鑒定后菌株的24hLB培養(yǎng)物,分別與試劑盒蘭氏分群A～G的乳膠診斷試劑做凝集試驗(按照說明書的方法進行),并且設(shè)空白和陽性對照。

1.2.6 分離菌的溶血特性

采用平板法(plateassay,PA)測定分離株的溶血特性。將鏈球菌接種于5%兔鮮血LB平板和5%綿羊鮮血LB平板,37oC培養(yǎng)48h后觀察溶血情況,菌落周圍出現(xiàn)溶血圈者判為溶血陽性。

1.2.7 分離菌的動物感染實驗

實驗組一。取病牛淋巴結(jié),腦組織無菌研磨,制成1∶4的懸液,蔡氏濾器過濾后,取0.2mL濾液腹腔接種于4只小白鼠(昆明系),取1mL濾液靜脈接種于2只實驗家兔,全部設(shè)立生理鹽水對照(2只小白鼠、1只家兔),觀察結(jié)果。

實驗組二。取病牛淋巴結(jié),腦組織無菌研磨,制成1∶4的懸液,直接取0.2mL懸液腹腔接種于4只小白鼠(昆明系),直接取1mL懸液靜脈接種于2只實驗家兔,全部設(shè)立生理鹽水對照(2只小白鼠,1只家兔),觀察結(jié)果。

實驗組三。將分離株培養(yǎng)于血清馬丁肉湯24h后,腹腔接種小白鼠(4只)0.2mL(麥?zhǔn)媳葷?含0.5億細菌),家兔(2只)耳緣靜脈接種1mL(麥?zhǔn)媳葷?含2.5億個細菌),全部設(shè)立生理鹽水對照,觀察。

實驗動物家兔及小白鼠均由石河子大學(xué)實驗動物中心提供,均為清潔級,實驗場所為二級生物安全實驗室。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離株的形態(tài)及菌落的特性

病料(腦組織和淋巴結(jié))涂片、瑞氏或姬姆薩染色均可看到小點狀的雙球菌,成對排列,并可在菌體周圍形成明顯的莢膜;肉湯底部可見少量絮狀沉淀,經(jīng)革蘭氏染色可見呈鏈狀排列的革蘭氏陽性球菌;該菌在鏈球菌選擇綿羊血平板上能形成針尖大、透明、圓形的β-溶血型小菌落;亞碲酸鉀綿羊血平板上能形成淡灰色、細小、光滑的β-溶血型小菌落。

2.2 培養(yǎng)特性、生化特性及溶血特征

API-20生化反應(yīng)結(jié)果(表1)與豕鏈球菌的生化反應(yīng)結(jié)果符合率為98%。

分離株在10℃低溫和40℃的高溫中可以正常生長,對高溫和低溫有耐受性;分離株在pH9.6的培養(yǎng)條件下不能生長。

2株分離株在綿羊血和兔血中均為β-溶血。

表1 分離株的API-20鏈球菌系統(tǒng)檢測結(jié)果表Tab.1 The API-20 Strep system results of the strains

2.3 藥物敏感實驗

分離株除對青霉素和四環(huán)素有耐藥性外,對其余的抗生素均敏感。

2.4 分離株的血清分型

Lancefield分群鑒定結(jié)果顯示,2株分離株均為蘭氏B型(表2)。

表2 分離株的乳膠凝集診斷分型試驗結(jié)果Tab.2 Lancefield Streptococcus grouping kit results of the strains

2.5 動物實驗

實驗組一。即病料經(jīng)蔡氏濾器處理后接種小白鼠和家兔組,接種2周內(nèi)均未見小白鼠和家兔有任何異常反應(yīng),家兔測量體溫亦正常,2周后撲殺剖檢觀察,未見任何異常病變,對照組亦正常。

實驗組二。即腦組織、淋巴組織研磨物接種小白鼠和家兔組,4只小白鼠在接種后分別在12h、17h、20h、26h,開始出現(xiàn)精神萎靡不振樣,縮作一團,被毛逆立,72h內(nèi)均未見死亡,72h后全部經(jīng)眼球放血致死后可從肝、脾、淋巴結(jié)和腦中分離出與病料分離株具有相同生物學(xué)特性的細菌。對照組正常。

家兔在接種后18h即出現(xiàn)發(fā)熱癥候群,精神萎靡,食欲不佳,72h內(nèi)未見死亡,72h后安樂死,可從肝、脾、淋巴結(jié)和腦組織中分離出與病料分離株具有相同生物學(xué)特性的細菌。對照組正常。

實驗三。即純培養(yǎng)物接種的4只小白鼠24～36h均死亡,亦能分離到與接種菌相同生物學(xué)特性的細菌。對照組正常。

家兔接種初體溫升高,未見死亡,72h后致死,也有相同的結(jié)果。對照組正常。

3 討論

本研究結(jié)果表明,從病死牛腦組織及淋巴結(jié)分離的兩株鏈球菌其形態(tài)血特性,菌落特性、培養(yǎng)特性、生化特性鑒定結(jié)果穩(wěn)定且相同,符合豕鏈球菌特征。

國際上,豕鏈球菌感染的報道和研究主要側(cè)重于人和豬[3],可引起豬流產(chǎn)并并發(fā)肺炎[4～5]。而從未見有關(guān)于牛的報道。

國際上鏈球菌屬細菌分類中常采用的方法為蘭氏分型法,本研究中采用鏈球菌乳膠凝集分型試劑對分離株進行了分型鑒定,結(jié)果為蘭氏B型,血清學(xué)分類上豕鏈球菌主要為 E、U、V、P等型[6～7]以及醫(yī)學(xué)中多見的B型[8]。

動物感染實驗(蔡氏濾器過濾組)基本可以排除病毒感染的可能性,病料和細菌的動物回歸實驗結(jié)果符合柯赫法則,表明分離株有一定的致病性。

溶血性是鏈球菌屬細菌毒力的一個重要標(biāo)志,分離株均對綿羊血和兔血產(chǎn)生了β-溶血,表明分離株具有一定的毒力。

根據(jù)目前的資料,我國還沒有任何關(guān)于動物和人的豕鏈球菌的任何報道,所以對此病菌應(yīng)給予足夠的重視。

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