譚秋芬,賈 薇,胡丹妮,李 鋒,陶 林,梁偉華,潘曉琳

(新疆地方病與民族高發(fā)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石河子832002)

本研究采用MassARRY Epi TYPER DNA甲基化分析技術(shù)定量分析宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1、正常對照組中CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)15個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài),探討CADM1基因CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)與宮頸鱗癌發(fā)生機(jī)制的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2007～2009年間石蠟包埋組織,宮頸鱗癌49例,CIN2/347例,CIN128例,對照宮頸組織24例(為子宮肌瘤行全子宮切除術(shù)后,經(jīng)病理診斷證實(shí)無宮頸病變)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取DNA 將10～15張約5um厚石蠟包埋組織蠟?zāi)ぶ糜?.0mL消毒離心管中;經(jīng)二甲苯脫蠟,無水乙醇脫苯,細(xì)胞裂解液及蛋白酶 K消化,苯酚-氯仿-異戊醇抽提,無水乙醇沉淀,適量 TE(pH=8.0)溶解DNA,沉淀12～24h后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA質(zhì)量鑒定 所提取DNA均經(jīng)β-globin PCR擴(kuò)增檢測DNA是否提取成功,使用Nanodrop ND-1000紫外分光光度儀檢測DNA濃度和純度。1.2.3 DNA亞硫酸氫鹽處理 使用 EZDNA甲基化處理試劑盒(Zymo Research,Orange County,CA)處理DNA,按照試劑盒提供步驟操作。

1.2.4 CADM1基因甲基化檢測 采用MassARRY Epi TYPERDNA甲基化分析技術(shù)技術(shù)(Sequenom,SanDiego,CA)定量分析CADM1基因的甲基化狀態(tài)。使用MassCLEAVE試劑盒(Sequenom)應(yīng)用PCR法在384孔板上擴(kuò)增目的基因片段,加入蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)混合液去除反應(yīng)體系中游離的核苷酸,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄,加入樹脂清除離子成分,混勻離心裂解反應(yīng)液后備用。使用MassARRAY Nanodispenser (Sequenom,SanDiego)從384孔板裂解反應(yīng)液中取出22nL入基質(zhì)芯片(Spectro-CHIPs;Sequenom,SanDiego),MassARRAY質(zhì)譜儀(Bruker-Sequenom)收集質(zhì)譜圖,經(jīng) EpiTYPER v1.0軟件(Sequenom)進(jìn)行分析。

1.2.5 HPV16E6DNA檢測 采用 PCR法檢測HPV16DNA,選用課題組前期經(jīng)測序確定為HPV16陽性樣本為陽性對照,PCR擴(kuò)增未見特異性目的片段的樣本為陰性對照,空白對照以高壓消毒雙蒸水代替DNA模板,取2μLPCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,BIO-RAD凝膠成像圖像分析儀觀察結(jié)果。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1Primer sequences

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。運(yùn)用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)和相關(guān)分析。運(yùn)用Cluster3.0軟件和TreeView軟件進(jìn)行聚類分析。以 P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DNA質(zhì)量鑒定

結(jié)果見圖1。由圖 1可見,β-globinPCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,均在268bp處出現(xiàn)目的片段(圖1),DNA純度 OD260/OD280在1.7～2.0之間,DNA濃度>50ng/μL,樣本 DNA均可用于PCR擴(kuò)增。

圖1 β-globin PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoretogram ofβ-globin amplified products

2.2 CADM1基因在宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1及正常組中的甲基化檢測結(jié)果

利用MassARRY Epi TYPER質(zhì)譜儀分析提供的圖譜數(shù)據(jù),精確定位到基因片段每個(gè)CpG單位的甲基化狀態(tài),用甲基化率量化每個(gè)CpG單位的甲基化程度。本實(shí)驗(yàn)148例樣本,每例樣本擴(kuò)增子中包含10個(gè)CpG單位(擴(kuò)增子中包含15個(gè)CpG位點(diǎn),經(jīng) T切后分為10個(gè)CpG單位,每個(gè)CpG單位包含單個(gè)或多個(gè)CpG位點(diǎn)),CpG單位總數(shù)為1480個(gè),其中 1402個(gè) CpG單位可被分析,可分析率達(dá)94.7%。1402個(gè)可被分析的CpG單位中,平均甲基甲率<30%的CpG單位為1227個(gè),占87.5%,甲基化水平較低,甲基化率>90%的CpG單位為140個(gè),占1.0%。應(yīng)用雙向聚類分析描繪宮頸鱗癌(n=49)、CIN2/3(n=47)、CIN1(n=28)與正常組(n=24)中的CADM1基因10個(gè)CpG單位甲基化率的分布趨勢,如圖2,顯示宮頸鱗癌組甲基化率高于CIN2/3、CIN1及正常對照組。

圖2 CADM1基因在宮頸148例樣本中的甲基化狀態(tài)聚類分析Fig.2Cluster diagram depicting Cp G Units methylation of CADM1

宮頸不同病變中,CADM1基因各CpG單位呈現(xiàn)不同水平的甲基化,CpG_2·3·4·5位點(diǎn)平均甲基化率在宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1、正常組均較高,平均甲基化率約50%;CpG_7、CpG_9.10位點(diǎn)平均甲基化率在宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1、正常組均較低,平均甲基化率<10%,如圖3。

圖3 CADM1基因CpG單位在正常、CIN1、CIN2/3、宮頸鱗癌組的平均甲基化率Fig.3 Group mean methylation of the Cp G units of CADM1

應(yīng)用 Kruskal-WallisH檢驗(yàn),顯示宮頸鱗癌組CpG_1、CpG_8、CpG_11、CpG_15位點(diǎn)甲基化率高于CIN2/3、CIN1及正常組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),如表2。CIN2/3、CIN1及正常組間甲基化率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1及正常對照組中CADM1基因CpG單位甲基化狀態(tài)的比較Tab.2 The comparison of individual Gp G units methylation of CADM1 ,bettween different cervical lesions and normal average

2.3 宮頸鱗癌中 CADM1基因甲基化與HPV16感染的相關(guān)性

應(yīng)用相關(guān)分析顯示,CADM1基因CpG_8、CpG_11、CpG_15甲基化水平與 HPV16感染呈正相關(guān)(HPV16陽性樣本36例,陰性樣本13例),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 宮頸鱗癌中HPV16檢測陽性與陰性樣本CADM1基因甲基化狀態(tài)比較Tab.3 Relationship of individual Cp G units methylation of CADM1 between HPV16 positive samples and negative sample s

3 討論

本文對CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)15個(gè)CpG位點(diǎn)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),在宮頸鱗癌、CIN2/3、CIN1、正常組中,CpG_2·3·4·5位點(diǎn)平均甲基化率均較高,CpG_7、CpG_9.10位點(diǎn)平均甲基化率均較低,不同CpG位點(diǎn)甲基化程度不同。宮頸鱗癌CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平高于 CIN2/3、CIN1、正常組,其中CpG_1、CpG_8、CpG_11、CpG_15四個(gè)位點(diǎn)甲基化率在宮頸鱗癌中明顯高于CIN2/3、CIN1及正常組,CIN2/3、CIN1及正常組間CpG位點(diǎn)甲基化水平無顯著差異。提示CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)特異性位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的改變可能在促進(jìn)CIN向?qū)m頸鱗癌轉(zhuǎn)化的過程中起著一定的作用。CADM1基因編碼的跨膜糖蛋白羧基端包括 FERM-和 PDZ-結(jié)合模序[10],FERM-和 PDZ-結(jié)合模序分別與 MPP3和DAL-1連接形成復(fù)合體,并與細(xì)胞骨架連接,可能與細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附、腫瘤抑制和免疫逃逸有關(guān)[11～13]。CADM1基因表達(dá)沉默在宮頸腫瘤中是頻發(fā)事件,伴有或不伴有等位基因缺失的啟動(dòng)子區(qū)甲基化是CADM1基因失活的主要方式[11]。CpG島通常位于基因的5′端啟動(dòng)子區(qū),也可延伸至基因的外顯子區(qū),啟動(dòng)子區(qū)的CpG被甲基化時(shí)基因轉(zhuǎn)錄受到抑制。有學(xué)者提出,基因啟動(dòng)子區(qū)CpG甲基化的密度與轉(zhuǎn)錄的抑制程度有關(guān)[14]。Steenbergen等[11]研究顯示,在宮頸鱗癌及 CIN2/3組中CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)所有CpG島均發(fā)生了甲基化,其檢出率分別為58%和35%,認(rèn)為宮頸鱗癌中CADM1基因甲基化頻率高、范圍廣。Overmeer等[6]以CADM1基因啟動(dòng)子區(qū)的三個(gè)區(qū)域?yàn)榘悬c(diǎn),結(jié)果顯示高密度(≥2個(gè)區(qū)域)甲基化與蛋白表達(dá)減低有關(guān),且在宮頸病變≤CIN1組與≥CIN3組之間有顯著差異,而單個(gè)區(qū)域甲基化在正常組和CIN1組中占有較大比例,認(rèn)為高密度甲基化可以作為診斷宮頸鱗狀上皮CIN3及以上病變的有效指標(biāo)。另有研究認(rèn)為DNA建立的甲基化模式是有區(qū)域特異性的,并非所有的CpG位點(diǎn)甲基化敏感度都一樣,少數(shù)CpG位點(diǎn)甲基化就可能有效地消弱基因啟動(dòng)子的活性[15,16]。有學(xué)者應(yīng)用MassARRYEpiTYPERDNA甲基化分析技術(shù)檢測前列腺腫瘤中8個(gè)基因的甲基化狀態(tài),發(fā)現(xiàn) RARB2基因CpG_10.11位點(diǎn)甲基化評分診斷前列腺癌的靈敏度和特異度分別為90.0%,92.59%,認(rèn)為基因單個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化的改變可以用于腫瘤的診斷[17]。因此,本研究結(jié)果提示特定CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的改變可能導(dǎo)致了基因表達(dá)沉默,造成腫瘤抑制喪失,在宮頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。

本研究中,在宮頸鱗癌中CADM1基因CpG_8、CpG_11、CpG_15三個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平與HPV16感染呈正相關(guān),提示 CADM1基因特定CpG位點(diǎn)的高甲基化狀態(tài)可能與 HPV感染協(xié)同導(dǎo)致了宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展。近年來研究證實(shí)單獨(dú)HPV感染不足以引起 HPV相關(guān)性腫瘤(如宮頸癌)的發(fā)生,遺傳和其他因素一起導(dǎo)致了侵襲性表型的形成。研究顯示 HPVDNA感染細(xì)胞必須獲得永生化表型和停泊非依賴性生長表型才能具有致瘤性,所有這些表型都為隱性性狀,提示這些表型可能與抑癌基因表達(dá)缺失有關(guān)[18]。另有研究發(fā)現(xiàn)在人類纖維母細(xì)胞中11p缺失與 HPV16誘導(dǎo)的停泊非依賴性有關(guān),當(dāng)人類11號染色體被導(dǎo)入到 Hela和SiHa細(xì)胞株中,其致瘤性喪失,表明11號染色體上存在抑癌基因[19]。早期發(fā)現(xiàn)11q23.2缺失中有一特殊的約700kb的區(qū)域能完全抑制肺癌細(xì)胞株A549的惡性表型,通過功能互補(bǔ)研究發(fā)現(xiàn)其抑制作用主要依賴其中100kb的區(qū)域,而CADM1是該區(qū)惟一基因[13]。高危型 HPV感染的CIN2/3到宮頸癌的演進(jìn)過程中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)由于啟動(dòng)子甲基化引起的CADM1基因表達(dá)沉默,但是CADM1mRNA在非瘤性 HPV永生化細(xì)胞株中表達(dá)豐富,提示CADM1基因表達(dá)沉默可能與 HPV永生化到致瘤性表型的轉(zhuǎn)化有關(guān)[11]。

本研究通過對CADM1基因多個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)定量分析,認(rèn)為CADM1基因特異性位點(diǎn)CpG_1、CpG_8、CpG_11、CpG_15的甲基化可能促進(jìn)了宮頸鱗癌的發(fā)生、發(fā)展,其中 CpG_8、CpG_11、CpG_15的甲基化可能與 HPV永生化到致瘤型表型的轉(zhuǎn)化有關(guān)。CADM1基因特異性CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)的改變可能導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)沉默,可能是宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)因素。

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