黃仁發(fā),康 雷,何澤云,滕久祥

(1.廣西中醫(yī)學院附屬瑞康醫(yī)院,廣西南寧 530011;2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南長沙 410007;3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,北京 100700)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是神經(jīng)內(nèi)科常見的危重急癥,具有高發(fā)病率、高致死率和高致殘率的特點。如何保護腦血腫周圍神經(jīng)細胞免于凋亡是降低腦出血高致殘率的重要手段。既往我們體內(nèi)外的研究表明,參麥注射液通過抑制血腫周圍腦組織缺氧誘導因子-1α的表達及抗細胞凋亡等機制發(fā)揮神經(jīng)保護作用[1、2]。本研究進一步探討腦出血血腫周圍腦組織熱休克蛋白 70(heatshock protein 70,HSP70)的表達以及參麥注射液對其的影響,為參麥注射液應用于腦出血的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級 SD大鼠 50只,雌雄各半,體重 200g±20g,購自湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.1.2 藥物 參麥注射液(SM,20mg/支)正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號 0307136。

1.1.3 儀器和試劑 SN-3腦立體定位儀、微量注射器、AO-8205型輪轉(zhuǎn)切片機、LHB11800型組織修整機、OPTON多功能光學顯微鏡、H-600透射電子顯微鏡(日本)、Ⅶ型膠原酶(sigma公司)、兔抗鼠 HSP70多克隆抗體(武漢博士德生物公司)、羊抗兔二體、SP試劑檢測盒(sigma公司)、DAB顯色試劑盒(武漢博士德公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物造模 按 Rosenberg[3]法造大鼠腦出血模型:大鼠腹腔注射 10%水合氯醛(400mg/kg)麻醉后,俯臥位固定于立體定位儀上,局部剪毛,75%酒精皮膚消毒,頭皮正中切口,暴露顱骨。使用《大鼠腦立體定位圖譜》進行蒼白球定位:前囟后1.4mm,中線右側(cè)旁開 3.2mm,深 5.6mm。手術(shù)刀鉆孔,用固定于立體定位儀上的微量注射器器緩慢抽取含 0.4UⅦ型膠原酶的滅菌生理鹽水(0.2u/μl)2μl,校準后垂直進針 5.6mm,緩慢注射,留針5min后拔出針頭,縫合皮膚,放回籠中飼養(yǎng)。假手術(shù)組以此方法注入等量滅菌生理鹽水。

1.2.2 分組與及給藥方法 按完全隨機方法將 50只大鼠分為 4組:正常組 5只,普通飼養(yǎng),自動飲水,不做任何處理;模型組 20只,組內(nèi)隨機分成腦出血后 1d、3d、5d、7d共 4個時間點,術(shù)前 24h以2m l生理鹽水腹腔注射,術(shù)后仍用生理鹽水注射(每天 1次),直至處死為止;參麥組 20只,動物分配及用藥方法均同模型組,參麥注射液 2m l腹腔注射。假手術(shù)組 5只,普通飼養(yǎng),動物分配及用藥方法均同模型組,術(shù)前 24 h以 2ml生理鹽水腹腔注射,術(shù)后仍用生理鹽水 2m l注射,每天 1次,直至第 3天處死為止。

1.2.3 評估 造模大鼠清醒后即觀察神經(jīng)系統(tǒng)病態(tài),后按時間點觀察爬桿記分。神經(jīng)系統(tǒng)病態(tài)包括軀體傾斜,立行欲倒,旋轉(zhuǎn)爬行,活動遲緩,易激惹。爬桿長 2m,寬 2.4cm,厚 4.4 cm,一端抬高 45°,術(shù)前 3d訓練大鼠由低向高爬行。計分方法為:將木條等分為 4段,每段計 6分,4段總分相加共 24分,不能爬計 6分,患肢拖行計 5分,跌下或滑倒 >3次計 4分,跌下或滑倒 <2次計 3分,四肢軟弱無力計2分,四肢支撐變寬計 1分。其中 24分為大鼠爬行記分的最高分,分數(shù)越高,表示肢體功能越差。

1.2.4 肉眼觀察 將實驗大鼠以 10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,放血處死大鼠,迅速開顱取腦組織,生理鹽水輕輕洗凈血污后,觀察鼠血腫吸收情況。

1.2.5 組織形態(tài)學電鏡觀察 按上述方法取出大鼠出血側(cè)腦組織。1%鋨酸固定,0.1M PBS漂洗,梯度丙酮脫水,Epon-812包埋,在 LHB11800型組織修整機上切片,醋酸鈾-醋酸鉛雙重染色,H-600型透射電子顯微鏡觀察、攝像。

1.2.6 免疫組化檢測血腫周圍區(qū) HIF1-α的表達 將空白切片常規(guī)脫蠟和水化,按試劑盒提供的使用方法檢測 HSP70的表達。左側(cè)非出血側(cè)大腦半球作為對照。HSP70表達陽性的細胞在光鏡下細胞漿呈棕黃色顆粒。陽性細胞計數(shù):在 40倍光學顯微鏡下,觀察每張切片出血中心區(qū)、出血周圍區(qū)、出血側(cè)海馬區(qū)和皮質(zhì)部位的每個網(wǎng)格(光學顯攝鏡 40倍下為 125μm×125μm)的 HSP70陽性細胞數(shù)。每個部位各觀察 5個視野,計數(shù)各視野內(nèi)的 HSP70陽性細胞,取其均值作為出血中心區(qū)、出血周圍區(qū)、海馬和皮質(zhì)部位的陽性細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后大鼠神經(jīng)系統(tǒng)病理體征

表1顯示,大鼠術(shù)后平均 45min麻醉清醒,假手術(shù)組大鼠清醒后未見明顯神經(jīng)系統(tǒng)病態(tài)。模型組和參麥組大鼠清醒后均出現(xiàn)活動遲緩、易激惹、站立不穩(wěn),病灶對側(cè)肢體無力、步伐增寬,爬行時軀體偏向病灶對側(cè),2組大鼠術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)病態(tài)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 大鼠術(shù)后神經(jīng)系統(tǒng)病態(tài)

2.2 大鼠爬桿計分結(jié)果

表2顯示,正常組和假手術(shù)組均未見明顯缺陷。模型組和參麥組均在第 1天計分最高,隨著時間的延長,計分逐漸下降,但參麥組大鼠 1d、3d、5d計分明顯低于模型組相應時間點,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表2 術(shù)后大鼠爬桿計分

表2 術(shù)后大鼠爬桿計分

注:模型組、參麥組大鼠術(shù)后 1d、3d、5d時爬桿計分比較:＊P<0.01;模型組、參麥組組內(nèi)各時間點爬桿計分比較:P<0.01

組 別 n 造模時間(d) 記分模 型 組 20 1 18.75±2.049＊15 3 15.20±1.207＊10 5 9.30±1.418＊5 7無明顯缺陷參 麥 組 20 1 16.70±1.41815 3 12.60±1.12110 5 7.50±0.972 5 7無明顯缺陷假手術(shù)組 5 3 無明顯缺陷正 常 組 5 — 無明顯缺陷

2.3 肉眼觀察

模型組和參麥組大鼠術(shù)后第 1天可見手術(shù)側(cè)腦腫脹,均出現(xiàn)血腫,說明造模成功,血腫面積見表3,2組比較無顯著性差異(P>0.05);術(shù)后第 3天血腫有所吸收,從第 5天起出血明顯減輕,術(shù)后 7d明顯吸收,但參麥組相對吸收明顯,模型組出血灶內(nèi)尚可見棕紅色的凝血塊,而參麥組則只見吸收后形成的中風囊。

2.4 電鏡觀察組織形態(tài)學變化

電鏡下觀察,正常組和假手術(shù)組海馬 CA1區(qū)錐體細胞核呈圓形、胞體內(nèi)細胞器豐富;模型組和參麥治療組 1d海馬 CA1區(qū)均出現(xiàn)了凋亡小體,模型組術(shù)后 3d凋亡小體增多,持續(xù)到術(shù)后 7d,細胞器結(jié)構(gòu)不完整(圖1),參麥組 7d時海馬 CA1區(qū)毛細血管和膠質(zhì)細胞水腫(圖1);參麥組術(shù)后 3d凋亡小體增多,但比模型組要少(圖2),7d時仍可看到凋亡小體,但細胞器結(jié)構(gòu)較完整;模型組 7d時,海馬 CA1區(qū)毛細血管和膠質(zhì)細胞水腫嚴重,參麥組 7d時海馬CA1區(qū)毛細血管和膠質(zhì)細胞輕度水腫(圖2)。

表3 2組大鼠術(shù)后 1d血腫面積比較(±s,n=5)

表3 2組大鼠術(shù)后 1d血腫面積比較(±s,n=5)

注:參麥組與模型組術(shù)后 1d血腫比較:t=0.53,★P>0.05

組 別 n 血腫面積(mm2)模型組 5 12.84±1.29★參麥組 5 13.37±1.68

2.5 大鼠腦出血后血腫中心區(qū)、缺血半暗帶區(qū)、術(shù)側(cè)海馬區(qū)和皮層區(qū) HSP70的表達

正常組和假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)和皮層區(qū)均有少量的 HSP70陽性信號表達(圖3和圖4),假手術(shù)組比正常組稍多,但二者比較差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。模型組術(shù)后第 1天于血腫中心區(qū)幾乎未見陽性信號表達,3d后可見少量的陽性細胞,5d時稍增多,而血腫周圍區(qū)、術(shù)側(cè)海馬區(qū)和皮層區(qū)陽性信號術(shù)后 1d時即增多,3d時達到高峰(圖5),以后逐漸下降,7d仍有陽性信號,各個表達部位的陽性細胞數(shù)以海馬區(qū)最多,手術(shù)對側(cè)海馬區(qū)和皮層區(qū)陽性信號也有所增加;參麥組血腫周圍區(qū)、術(shù)側(cè)海馬區(qū)和皮層區(qū)術(shù)后 1d時即增多,3d時達到高峰(圖6),以后逐漸下降,7d仍有較多的陽性信號,比模型組要多。模型組和參麥組各時間點于各部位的陽性細胞數(shù)與假手術(shù)組、正常組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);參麥組各時間點于血腫周圍區(qū)、海馬區(qū)和皮層區(qū)的陽性細胞數(shù)比模型組要多,2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),而 2組血腫中心區(qū)的陽性細胞數(shù)于 1d、3d、5d時差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05),于 7d時模型組陽性細胞數(shù)要多,2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表4)。

圖1 模型組第 3天(電鏡 ×3500)

圖2 參麥組第 3天(電鏡 ×3500)

圖3 正常組第 3天(×400)

圖4 假手術(shù)組(×3500)

圖5 模型組第 3天(×400)

圖6 參麥組第 3天(×400)

3 討論

HSP又稱“分子伴侶”,是一種進化上高度保守的蛋白,具有 4個家族[4]。熱休克蛋白 70(heat shock proteins 70,HSP70)是 HSPs中最保守、最主要、含量最豐富的一類,在應激后生成最為顯著,它作為分子伴侶不僅參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的折疊、裝配、降解和修復過程,以維護蛋白的自穩(wěn)系統(tǒng),在細胞的信息傳遞、生長、分化中具有重要的調(diào)控作用。同時它又可以作為一種內(nèi)源性保護物質(zhì)對臟器損傷產(chǎn)生自身保護作用[5、6]。近年對腦缺血大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn),HSP70可增加細胞耐缺氧能力,通過增加神經(jīng)細胞 B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukmia-2,bcl-2)的表達來抑制神經(jīng)細胞凋亡,從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

表4 大鼠腦出血后各部位 HSP 70陽性細胞數(shù)比較(±s,n=5)

表4 大鼠腦出血后各部位 HSP 70陽性細胞數(shù)比較(±s,n=5)

注:與模型組各同時間段比較:◇P<0.01,★P>0.05;參麥組與模型組組內(nèi)各同時間段比較:☆P<0.01,☆☆P<0.05,●P>0.05;模型組 3d時與假手術(shù)組比較:○P<0.01;假手術(shù)組與正常組比較:P>0.05

組別血腫區(qū) 周圍區(qū) 海馬區(qū) 皮層區(qū)模 型 組 1d 0.16±0.20☆ 10.36±1.319◇☆ 19.84±1.864◇☆ 9.48±1.447 ◇☆3d 2.68±1.108★☆ 14.80±1.803◇☆ 28.56±2.678◇☆○ 13.96±2.865◇☆○5d 3.28±1.208★ 12.84±1.344◇☆ 23.96±1.837◇☆ 11.72±1.400◇☆7d 3.12±1.236◇● 4.28±0.843 ◇ 17.16±1.491◇ 6.40±1.080◇參 麥 治 療 組 1d 0.20±0.408☆ 13.60±1.291☆ 24.16±1.344☆ 11.84±1.179☆3d 2.64±0.907● 29.08±2.397☆ 33.56±1.417☆ 17.44±1.044☆5d 3.44±1.895☆☆ 18.00±1.384☆ 28.08±1.470☆ 14.52±0.918☆7d 2.32±0.764 8.12±1.269 20.92±2.581 8.64±0.952假 手 術(shù) 組 3d — — 5.16±1.214 3.16±0.800正 常 組 — — 4.64±1.753 2.88±0.666

眾所周知,腦出血后存在廣泛的繼發(fā)性缺血性損害,其血腫周圍存在一個繼發(fā)性缺血半暗帶(ischamic Penumbra,IP),這個區(qū)域由于尚存在側(cè)支循環(huán),神經(jīng)細胞出現(xiàn)的是大量的凋亡而不是壞死,且早期僅神經(jīng)功能降低而依然能維持離子平衡而存活,如血流立即恢復,半暗帶區(qū)域的神經(jīng)細胞可恢復正常,但缺血時間過長或血流量繼續(xù)下降,則神經(jīng)細胞不可避免地發(fā)生壞死。腦出血無疑是一種應激狀態(tài),血腫周圍組織作為對應激的反應,必將在殘存的神經(jīng)細胞內(nèi)合成 HSP70增多,甚至有學者認為這些區(qū)域是 IP區(qū)存在的標志。而最近國內(nèi)的學者也證實,腦出血大鼠血腫周圍組織 HSP70的表達增加。

參麥注射液源于《干金要方》之生脈散,主要藥物為人參、麥冬,其主要功效為益氣養(yǎng)陰固脫?，F(xiàn)代藥理研究表明,參麥注射液通過抗凋亡的作用而減輕神經(jīng)細胞缺血損傷,已在臨床上廣泛應用于治療腦梗死,且取得較好的臨床療效。本人既往體內(nèi)外的實驗研究結(jié)果顯示,參麥注射液可能通過促進血腫吸收、抑制血腫周圍區(qū)HIF1-α表達及抑制神經(jīng)細胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。有關(guān)參麥注射液對ICH后 HSP70表達的影響,國內(nèi)尚未見報道,但王曉霞等的研究表明,參麥注射液能增加心肌缺血再灌注損傷模型心肌細胞 HSP70的表達,而減少心肌梗死面積,抑制心肌細胞的凋亡,并推測參麥注射液的保護作用系通過提高垂體-腎上腺系統(tǒng)的活性來增加心肌細胞 HSP70的表達而發(fā)揮增強機體抗應激能力。我們在本次實驗中觀察到,正常組和假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)和皮層區(qū)均有少量的 HSP70表達,模型組和參麥組術(shù)后第 1天,血腫中心區(qū)幾乎不表達 HSP70,而血腫周圍區(qū)、海馬區(qū)和皮層區(qū)陽性信號增多,3d時增多達到高峰,7d時仍有陽性信號;同時免疫組化結(jié)果表明,血腫中心區(qū)在 3d后可見少量的陽性細胞,5d～7d時稍增多,推測這是第 3天時血腫開始吸收,神經(jīng)膠質(zhì)細胞及新的毛細血管增生,缺氧誘導膠質(zhì)細胞和血管內(nèi)皮細胞表達 HSP70,從而產(chǎn)生保護作用并促進機體恢復。同時我們還發(fā)現(xiàn),ICH后陽性細胞數(shù)以海馬區(qū)最多,結(jié)合電鏡下海馬CA1區(qū)同期出現(xiàn)凋亡小體,說明上述區(qū)域的繼發(fā)性缺血可逆損傷可能通過誘導 HSP70的表達增多,從而增加神經(jīng)細胞對缺氧的耐受性,發(fā)揮神經(jīng)細胞保護作用。參麥組周圍區(qū)、海馬區(qū)和皮層區(qū)神經(jīng)細胞于各時間點神經(jīng)細胞的 HSP70表達明顯比模型組多,提示參麥注射液可能通過增強 HSP70的表達,提高機體應激能力,增加細胞耐缺氧能力,抑制細胞凋亡,挽救繼發(fā)性缺血損傷的神經(jīng)細胞來促進神經(jīng)功能的恢復。我們的研究為參麥注射液廣泛應用于腦出血的治療提供了理論依據(jù)。

[1]黃仁發(fā),何澤云,史偉.參麥注射液對腦出血后大鼠神經(jīng)細胞保護作用的實驗研究[J].山東中醫(yī)雜志,2007,26(1):42-45.

[2]黃仁發(fā),何澤云,史偉.參麥注射液對腦出血大鼠缺氧誘導因子 1-α表達的影響[J].遼寧中醫(yī)雜志,2008,35(3):453-455.

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