侯學(xué)霞,耿 震,郝 琴,張 洋,萬康林

中國(guó)6省萊姆病螺旋體主要宿主動(dòng)物鼠的初步調(diào)查

侯學(xué)霞,耿 震,郝 琴,張 洋,萬康林

目的 了解中國(guó)吉林、山西、甘肅、青海、貴州、湖南6省林區(qū)萊姆病螺旋體宿主動(dòng)物鼠的感染情況。方法在每個(gè)省各選取兩個(gè)采樣點(diǎn)進(jìn)行捕鼠,采用病原分離培養(yǎng)和巢式PCR方法對(duì)野鼠的脾臟、腎臟和膀胱進(jìn)行了病原學(xué)檢測(cè)。并通過基因測(cè)序方法確定基因型。結(jié)果從貴州黑線姬鼠中分離到了2株萊姆病螺旋體;從5省(貴州未檢測(cè)到)野鼠的脾臟和/或腎臟中檢查到了萊姆病螺旋體的特異片段,其中青海黃南(28.85%)和湖南石門(19.6%)兩地標(biāo)本的PCR陽性率較高,各地區(qū)陽性率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過序列同源性分析確定吉林、青海、甘肅和山西的基因型均為Borrelia garinii。湖南的基因型為Borrelia valaisiana。結(jié)論本次調(diào)查表明各地宿主動(dòng)物鼠的感染狀況不同,各地應(yīng)根據(jù)具體情況進(jìn)一步擴(kuò)大調(diào)查以明確當(dāng)?shù)氐闹饕拗鲃?dòng)物種類及攜帶病原體情況。

萊姆病螺旋體;宿主動(dòng)物;病原學(xué)檢測(cè)

萊姆病(Lyme disease)是一種人獸共患病,其病原體為伯氏疏螺旋體。蜱為其主要的傳播媒介,鼠類和一些小型哺乳動(dòng)物可作為宿主動(dòng)物,在不同國(guó)家和地區(qū)其宿主動(dòng)物也存在一定的差別〔1-2〕。美國(guó)已從多種動(dòng)物和和鳥類分離到該病原體,并認(rèn)為白腳鼠和白尾鹿是最重要的動(dòng)物宿主。我國(guó)已從白腹鼠、褐家鼠、黑線姬鼠和華南兔等動(dòng)物中分離得到萊姆病螺旋體〔3-4〕。為了解我國(guó)萊姆病螺旋體主要宿主動(dòng)物鼠的感染狀況,我們于2006年對(duì)中國(guó)吉林、山西、甘肅、青海、貴州和湖南6省進(jìn)行了鼠帶菌率的調(diào)查。

1 材料和方法

1.1 調(diào)查點(diǎn)選擇 每省選2個(gè)調(diào)查點(diǎn),吉林長(zhǎng)白、通化;山西垣曲、交城;甘肅迭部、民樂;青?；ブ?、黃南;貴州道真、務(wù)川;湖南瀏陽、石門,共12個(gè)調(diào)查點(diǎn)。

1.2 野鼠調(diào)查

1.2.1 病原體分離培養(yǎng) 在野外采用籠捕法抓活鼠,經(jīng)無菌操作取活鼠或死亡不超過16h鼠的脾臟和腎臟(接近髓質(zhì)的皮質(zhì)),取綠豆大小的組織,接種于BSKⅡ培養(yǎng)基,33℃培養(yǎng),7d后檢查,每周檢查1～2次,連續(xù)3個(gè)月培養(yǎng)為陰性棄去。

1.2.2 PCR檢測(cè) 鼠標(biāo)本DNA模板的制備

①取3～5mm見方(約50mg)的脾或腎組織在研磨器中加入500μL的 TRIzol,研磨,將懸液 15 000r/min,離心15min;

②棄上清,加入150μL無水乙醇,反復(fù)混勻后室溫靜置2min,15 000r/min,離心5min;

③棄上清,加入0.1μL/l檸檬酸鈉和70%乙醇(檸檬酸鈉∶乙醇 =1∶9)500μL,反復(fù)混勻,室溫靜置30min,15 000r/min,離心5min;

④棄上清,加入75%乙醇500μL,反復(fù)混勻,室溫靜置15min,15 000r/min,離心5min;

⑤棄上清,將DNA室溫干燥15min;

⑥加入 TE(p H=8.0)液50μL,混勻;

⑦置-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 宿主動(dòng)物鼠標(biāo)本中萊姆病螺旋體的檢測(cè) 采用巢式PCR方法檢測(cè)帶菌情況。引物根據(jù)參考文獻(xiàn)〔5〕,以伯氏疏螺旋體5S-23SrRNA間隔區(qū)兩側(cè)基因高度保守區(qū)合成內(nèi)外引物兩對(duì)。

第一輪上游:5′-CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC-3′

第一輪下游:5′-TAAGCTGACTAATACTAATTACCC -3′

第二輪上游:5′-TCCTAGGCATTCACCATA-3′

第二輪下游:5′-GAGTTCGCGGGAGA-3′

反應(yīng)條件見表1。

表1 PCR檢測(cè)反應(yīng)條件Table 1 PCR conditionsof reaction

1.3 測(cè)序及序列分析 將PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司測(cè)序,并用MegAlign軟件進(jìn)行聚類分析。

1.4 菌株和主要試劑 標(biāo)準(zhǔn)菌株B31、BSKⅡ培養(yǎng)基由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供;TRIzol購于上海生物工程有限公司;100bpDNALadder、TaqDNA 聚合酶、dNTP、瓊脂糖、購于華美生物公司。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本收集 2006年在我國(guó)6省山林地區(qū)共收集到野鼠463只,具體見表2。

2.2 病原檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 對(duì)6省共400余只野鼠脾臟、腎臟和膀胱進(jìn)行了病原分離培養(yǎng),僅從貴州黑線姬鼠標(biāo)本中分離到2株螺旋體,經(jīng)單克隆抗體鑒定均為萊姆病螺旋體。

2.2.2 Nested-PCR檢測(cè)結(jié)果(見表2) 其中青海黃南28.85%、湖南石門19.6%的帶菌率較高,而吉林長(zhǎng)白6.90%、甘肅民樂6.67%的帶菌率較低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.60,P<0.05)。

表2 中國(guó)六省不同地區(qū)鼠標(biāo)本PCR檢測(cè)結(jié)果Table 2 PCR results for rats in different regionsof the six provinces

2.2.3 測(cè)序結(jié)果 我們從每個(gè)省鼠的PCR陽性產(chǎn)物中隨機(jī)挑選一份送公司測(cè)序,序列用MegAlign軟件進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示,湖南的序列 HNm1.seq與Borrelia valaisiana基因型的標(biāo)準(zhǔn)菌株UK的序列較為接近;而吉林、青海、甘肅和山西的序列與Borrelia garinii基因型的標(biāo)準(zhǔn)菌株20047的序列較為接近。

圖1 中國(guó)六省鼠標(biāo)本PCR陽性產(chǎn)物序列聚類圖Fig.1 The dendrogram of the sequence of th PCR positioe produets of mouse in six provinces of China

3 討 論

本次調(diào)查顯示:通過巢式PCR方法從五省不同地區(qū)檢測(cè)到萊姆病螺旋體的特異片段,青海黃南(28.85%)和湖南石門(19.6%)兩地山林地區(qū)鼠的帶菌率為最高,各地區(qū)宿主動(dòng)物鼠之間帶菌率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.60,P<0.05),原因可能為這些地區(qū)的地理環(huán)境,氣候條件等影響鼠的種類,而萊姆病帶菌率主要受鼠種差異的影響,不同鼠種攜帶的萊姆病螺旋體能力不同〔6-8〕。并經(jīng)比對(duì)顯示,湖南存在Borrelia valaisiana基因型,這在我國(guó)是首次報(bào)道。吉林、青海、甘肅和山西存在Borrelia garinii基因型,這進(jìn)一步提示了野鼠為萊姆病螺旋體的重要儲(chǔ)存宿主〔9-10〕。同時(shí)也證明吉林、貴州、甘肅的萊姆病基因型同已報(bào)道的萊姆病主要基因型相符〔11-12〕。其中山西、青海首次被列為萊姆病宿主動(dòng)物調(diào)查地區(qū),并且第一次在山西省發(fā)現(xiàn)了Borrelia garinii基因型,在湖南省發(fā)現(xiàn)了Borrelia valaisiana基因型,具有重要的流行病學(xué)和臨床意義,這項(xiàng)調(diào)查為當(dāng)?shù)厝R姆病疫源地的發(fā)現(xiàn)和研究提供了重要證據(jù)。進(jìn)一步的研究將填補(bǔ)我國(guó)山西和湖南兩省萊姆病新基因型的流行病學(xué)特征及其引發(fā)各種臨床癥狀的進(jìn)展和臨床轉(zhuǎn)歸關(guān)系方面認(rèn)識(shí)的空白,為進(jìn)行有效防治提供重要的科學(xué)依據(jù)。但由于本研究從六省中每省只選取了兩個(gè)調(diào)查點(diǎn)采樣,這樣不能代表全省的情況,建議在每個(gè)省內(nèi)至少選取4～5個(gè)調(diào)查點(diǎn),因此尚需開展進(jìn)一步調(diào)查研究,每一個(gè)調(diào)查點(diǎn)應(yīng)該盡可能的從數(shù)量上多采集一些標(biāo)本,樣本量過少容易發(fā)生統(tǒng)計(jì)學(xué)偏倚。貴州的鼠標(biāo)本未能檢測(cè)到陽性,原因可能是樣本量過少,提示在今后的調(diào)查中應(yīng)該增加樣本量以減少偏倚。

與病原體分離培養(yǎng)相比,Nested-PCR技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、迅速的特點(diǎn),因此越來越得到廣泛應(yīng)用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道〔13〕,對(duì)現(xiàn)場(chǎng)捕獲的動(dòng)物組織直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其敏感性高于病原體分離培養(yǎng),不會(huì)存在螺旋體分離培養(yǎng)過程菌株的選擇作用,使結(jié)果更加接近于螺旋體在自然界中的原貌,而且通過核苷酸序列分析,還能夠獲得有關(guān)不同菌株之間差異的豐富信息,可以為進(jìn)一步深層次的研究提供線索。Nested-PCR技術(shù)的靈敏度高,假陰性少,是其他常規(guī)檢測(cè)萊姆病螺旋體感染方法(如:IFA,EL ISA,WB)所無法比擬的〔14〕。但是Nested-PCR最大的缺點(diǎn)是容易污染,由于DNA擴(kuò)增效率高,微量的污染即可變成陽性。只要操作者能創(chuàng)造一個(gè)超凈的環(huán)境,認(rèn)真仔細(xì)操作,Nested-PCR擴(kuò)增過程中的污染問題是可以避免的。

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Rats,the primary reservoir hosts of Borrelia burgdor feri,in six representative provinces,China

HOU Xue-xia,GENG Zhen,HAO Qin,ZHANG Yang,WAN Kang-lin
(Institute of Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention/State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control,Beijing 102206,China)

The objective of this study was to understand the status of rats,the reservoir hosts of Borrelia burgdorferi,in the six rep resentative provinces in China including Jilin,Shanxi,Gansu,Qinghai,Guizhou and Hunan.The rats were catched in two different areas in each p rovince and the pathogens were isolated and cultured.Nested-PCR was used to test Borrelia burgdorferi in spleen,kidney and bladder of rats.The sequence analysis was used to identify the genotype.Results indicated that two strains of Borrelia burgdorferi wereobtained from apodemus in Guizhou;the specific fragments of Borrelia burgdorferi were obtained in spleen and kidney of rats from all representative provinces in China expect Guizhou;the PCR positive ratewas higher in Huangnan(28.85%)and Shimen(19.6%);therewere statistical differences in theareas.The sequenceanalysis show s that the genotype in Jilin,Qinghai,Gansu and Shanxibelongs to Borrelia garinii,and in Hunan belongs to Borrelia valaisiana.The results indicated that there were different infection rate in rats infected in the six provinces,thus further investigation should conduct for the primary reservoir hosts and for the pathogens carrying situation in different areas of China.

Lyme disease spirochetes;reservoir hosts

R377

A

1002-2694(2010)11-1034-03

萬康林,Email:klwan1217@163.com

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206

2010-05-25;

2010-09-16