李峻嶺，王 琳,李麗華，李勝范，曹平安

(大連大學附屬新華醫(yī)院 腎臟內科，遼寧 大連 116021)

進行性血管鈣化是慢性腎功能衰竭(CRF)心血管事件發(fā)生率增高的重要原因。大量研究證實血管鈣化是一種類似于骨和軟骨形成的主動的調節(jié)過程，血管平滑肌細胞(VSMC)表達成骨細胞表型是血管鈣化過程的中心環(huán)節(jié)[1]。研究表明，高磷可誘導培養(yǎng)的VSMC鈣化，然而,磷如何影響血管鈣化,目前機制尚不完全清楚。核結合因子αl(Core Binding Factor α1,Cbfα1)又稱急性髓性白血病因子3(AML3)、Runx相關轉錄因子2(Runx2)和成骨細胞特異性因子2(OSF2)。Cbfα1控制成骨細胞分化的啟動，早期促進成骨細胞的分化，晚期可抑制其分化。Cbfα1在體外可誘導人和小鼠間充質干細胞向成骨細胞分化[2]。本研究進行大鼠主動脈VSMC體外培養(yǎng),觀察高磷對鈣化的影響,并探討其與Cbfα1的關系。

1 材料和方法

1.1 試 劑

大鼠胸主動脈平滑肌細胞株購自中科院上海細胞所；高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素購自Gibco公司；胎牛血清購自奧地利PAA公司；鈣測定試劑盒購自美國Sigma公司；BCA蛋白測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；核蛋白提取試劑盒和T ransAM AML3/ Runx2核轉錄因子活性檢測試劑盒購自美國Active Mortif公司；骨鈣素放射免疫試劑盒購自北京東亞免疫技術研究所。兔抗鼠平滑肌α肌動蛋白單克隆抗體購自Zymed公司,SP免疫組化試劑盒和DAB顯色劑購自北京中山生物技術公司。

1.2 大鼠血管平滑肌細胞株的培養(yǎng)

將大鼠血管平滑肌細胞株置于25 mL培養(yǎng)瓶中，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基5 mL，靜置于37℃，CO2濃度為5%的孵箱培養(yǎng)。2 d換液1次，待細胞融合覆蓋瓶底80%～90%后，以0.25%的胰蛋白酶消化傳代。在載玻片上培養(yǎng)的細胞融合后，采用免疫組化α-SMA染色對血管平滑肌細胞株進行鑒定。

1.3 誘導鈣化

傳5代后的細胞經0.25%的胰蛋白酶消化后接種于六孔板中，待細胞貼壁后，換成磷濃度分別為1.4 mmol/L(正常磷濃度)和2.4 mmol/L(高磷濃度)的培養(yǎng)基。2種培養(yǎng)基的鈣濃度均為2.0 mmol/L。培養(yǎng)3、6、9 d。換用不同培養(yǎng)基的第1天記為第0天。

1.4 鈣沉積定量

各組細胞D-Hanks液洗滌細胞3次后，0.6 mmol/L鹽酸脫鈣1 d。鹽酸懸液中鈣含量用氨羧絡合劑方法測定。脫鈣后的細胞用D-Hanks液洗滌細胞3次后，0.1 mmol/L NaOH-0.1%SDS(十二烷基硫酸鈉)溶解細胞，BCA法測定蛋白含量。用蛋白含量標化鈣含量。

1.5 Von Kossa染色

第9天的培養(yǎng)細胞在戊二醛中固定后，加入5%硝酸銀，避光、室溫孵育30 min。三餾蒸滌細胞3次，紫外光下放置30 min，蘇木素伊紅復染，磷酸鈣沉積染為黑色。

1.6 骨鈣素測定

每個培養(yǎng)孔加入磷濃度分別為1.4 mmol/L或2.4 mmol/L的培養(yǎng)基，孵育3 d，吸出上清液，骨鈣素的濃度用放射免疫法測定。

1.7 cbfa1活性的測定

每個培養(yǎng)孔加入磷濃度分別為1.4 mmol/L或2.4 mmol/L的培養(yǎng)基，分別于培養(yǎng)第3、6、9天收集細胞，用核蛋白提取試劑盒提出各組細胞的蛋白質，用BCA比色法測定蛋白質含量，吸取5 μg蛋白質提取物，用細胞裂解液稀釋至20 μL，采用ELISA試劑盒測定cbfa1的活性。

1.8 統(tǒng)計學方法

每組指標均計算均數(shù)±標準差,組間比較采用t檢驗，所有檢驗分析均使用SPSS 10.0 軟件，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 血管平滑肌細胞形態(tài)學和鑒定

5代后倒置顯微鏡下單個平滑肌細胞為梭狀或帶狀(圖1)。經免疫組化α-SMA染色后，細胞胞漿內a-SMA豐富表達，呈細絲狀沿細胞縱軸排列。95%為陽性，純度符合實驗要求(圖2)。

2.2 磷誘導牛血管平滑肌細胞鈣化沉積

圖1第5代VSMC,單個血管平滑肌細胞為梭狀或帶狀(×40)

Fig 1 Photomicrograph of VSMC of the fifth generation. Single VSMC presented spindle-shaped or girdle-shaped (×40)

圖2免疫組化α-SMA染色后，細胞胞漿內棕色陽性信號豐富表達，呈細絲狀沿細胞縱軸排列(×400)

Fig 2 Photomicrograph of VSMC containing a-SMA-like immunoreactivity. Brown deposit was abundantly located in intracytoplasm. Brown deposit presenting filament-shaped was arrayed along longitudinal axis of VSMC (×400)

正常磷濃度組細胞鈣含量在9 d內無明顯變化。高磷濃度組第3、6、9天細胞鈣含量與第0天相比，差異有顯著性意義(P<0.01)。高磷濃度組在第3、6、9天細胞鈣含量與同一時間正常磷濃度組比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組在不同時間血管平滑肌細胞的鈣沉積(μg/mg蛋白)Tab 1 Calcium deposition in VSMC in different time in the two groups(μg/mg protein)

1)與第0天比較P<0.01；2)與同一時間正常磷濃度組比較P<0.05；3)與同一時間正常磷濃度組比較P<0.01

2.3 鈣化血管平滑肌細胞的形態(tài)學特征

經Von Kossa染色,在高磷濃度組培養(yǎng)基中生長的細胞見大量的黑色顆粒狀沉著，彌漫性分布于整個細胞，主要是細胞外區(qū)域(圖3A)。在正常磷濃度組培養(yǎng)基中的細胞卻幾乎看不到這種沉積的存在(圖3B)。

2.4 骨鈣素的測定

第3天高磷濃度組上清液骨鈣素含量為(14.62±2.93)pg/μg蛋白，而正常磷濃度上清液骨鈣素含量為(2.83±0.64)pg/μg蛋白。兩者比較，差異具有顯著性意義(P<0.01)。

2.5 Cbfα1活性的檢測

正常磷濃度組細胞Cbfα1活性在9 d內無明顯變化。高磷濃度組在第6天和第9天細胞Cbfα1活性與第0天相比，差異有顯著性意義(P<0.05)。高磷濃度組在第3天細胞Cbfα1活性與正常磷濃度組比較，差異無顯著性；而高磷濃度組在第6天和第9天細胞Cbfα1活性與同一時間正常磷濃度組比較，差異有顯著性意義(P<0.05)，見表2。

圖3 鈣化血管平滑肌細胞

A：Von Kossa染色,高磷濃度組培養(yǎng)基中生長的細胞見大量的黑色顆粒狀沉著 (×200)；B：Von Kossa染色, 正常磷濃度組培養(yǎng)基中的細胞卻幾乎看不這種沉積的存在 (×200)

Fig 3 Von Kossa stains. Copious black particle deposit was presented in medium containing high phosphate (the left Photomicrograph ×200). Seldom deposit was presented in medium containing normal phosphate(the right Photomicrograph ×200)

表2 各組在不同時間血管平滑肌細胞的Cbfα1活性(吸光度)Tab 2 Cbfα1 activity of VSMC in different time in the two groups(absorption factor)

1)與第0天比較P<0.05;2)與同一時間正常磷濃度組比較P<0.05

3 討 論

心血管疾病是慢性腎臟病(CKD)患者致殘和致死的主要原因，超過50%CKD 5期的患者死于心血管疾病，其風險比普通人群高出20～30倍。組織學和影像學的研究證明，在CKD的患者，血管鈣化非常普遍，常從年輕時就開始，且比一般人群更加嚴重[3]。流行病學和臨床資料發(fā)現(xiàn)血管鈣化與粥樣硬化斑塊數(shù)量、心肌梗死和心臟驟停等心血管事件的發(fā)生都密切相關，目前被認為是強有力的心血管病死率和總病死率的預測因素[4]。

血管鈣化過去一直被認為是一種被動的過程。新近認為，血管鈣化是一種類似于骨和軟骨形成的主動的調節(jié)過程，主要特征是血管壁的細胞，尤其是VSMC發(fā)生骨樣變化的主動調節(jié)過程。許多實驗均發(fā)現(xiàn)血管鈣化與高血磷有關[5]。本研究通過細胞培養(yǎng)實驗也證實高磷與平滑肌細胞鈣化有密切關系。當用磷濃度(1.4 mmol/L) 培養(yǎng)基培養(yǎng)，細胞鈣化不明顯，而當磷濃度為2.4 mmol/L時，細胞明顯鈣化,且隨著培養(yǎng)時間延長, 細胞鈣化越來越顯著。這提示高磷能促進血管平滑肌細胞鈣化，并且這種作用具時間和劑量的依賴性。形態(tài)學觀察磷濃度2.4 mmol/L培養(yǎng)時可見到細胞大量黑色顆粒狀沉積(經Von Kossa 染色證實為磷酸鹽礦物質)，這與國內外一些細胞實驗結果一致[6]。骨鈣素又稱骨 Gla 蛋白，含有 3個羧基谷氨酸基團，主要由骨細胞和成骨細胞合成及分泌, 被認為是成骨細胞最終分化的特異性指標，是反映機體骨代謝變化靈敏、可靠的指標[7]，其在血管鈣化期間分泌增加并與鈣化程度呈正相關 。骨鈣素的出現(xiàn)，表明表達成骨細胞表現(xiàn)型的細胞在血管鈣化的發(fā)生過程中起中心作用。本實驗中，與磷濃度1.4mmol/L培養(yǎng)基中的平滑肌細胞相比，磷濃度為2.4 mmol/L培養(yǎng)基中平滑肌細胞表達的骨鈣素水平明顯增高。

多項研究發(fā)現(xiàn)Cbfα1在鈣化血管中膜和內膜均有表達而正常血管幾乎無表達。Cbfα1在體外可誘導人和小鼠間充質干細胞向成骨細胞分化[8]。Cbfα1作為成骨細胞分化的特異性轉錄因子對成骨細胞的生長分化、軟骨細胞的成熟發(fā)育及牙齒的分化發(fā)育有重要作用[9]，其基因缺失突變可引起遺傳性骨病。Cbfα1基因突變小鼠的胚胎中僅有微弱的堿性磷酸酶的表達，幾乎不表達骨橋蛋白和骨鈣蛋白，骨鈣素有3個結合Cbfα1的啟動區(qū)域。骨橋蛋白、骨鈣蛋白和堿性磷酸酶在骨鈣化后期都下調，證明Cbfα1的缺失導致成骨細胞成熟的中止發(fā)生于分化早期[10]。本實驗中,在正常磷濃度時細胞Cbfα1活性無明顯變化。而磷濃度2.4 mmol/L時細胞Cbfα1活性增強，且隨時間延長逐漸增強。這表明隨著鈣化的加重，Cbfα1表達逐漸增強。

一項橫斷面研究經過多元回歸分析顯示，血磷水平升高是頸動脈內膜和中膜厚度增加的獨立危險因素之一[11]。高血磷如何誘導血管鈣化的機制目前還不完全清楚?？赡軝C理有：①近期研究表明磷可調節(jié)細胞信號的傳導和基因表達。高磷可刺激體外培養(yǎng)的VSMC表達堿性磷酸酶，誘導轉錄因子cbfal及骨鈣素產生，且誘導骨橋素表達依賴于VSMC細胞膜Na/Pi共轉運體和堿性磷酸酶的活性；上調Cbfα1，表達成骨細胞表型，即促進成骨相關性蛋白基因表達并抑制平滑肌細胞特異性基因表達，最終引起細胞鈣化[12]。②細胞內磷水平升高后會引起部分細胞發(fā)生凋亡，這些凋亡小體是鈣化結晶的基礎。高磷和(或)高鈣可明顯誘導VSMC凋亡，使用凋亡抑制劑后，VSMC鈣化減少20%[13]。③細胞內高磷刺激潛在的礦化物質如基質小泡、堿性磷酸酶、鈣結合蛋白和含膠原的細胞外基質的分泌[13]。

高磷能誘導血管平滑肌細胞發(fā)生鈣化，這種鈣化與磷濃度、磷作用時間有關。高磷培養(yǎng)基還可誘導血管平滑肌細胞表達cbfα1，這說明cbfα1參與并調控血管鈣化，但其具體作用仍有待更深入的實驗進一步證實。

[1] Chwn NX,Moe SM.Vascular calcification in chronic kidney disease[J].Sem Nephrol,2004,24:61-68.

[2] Lien CY，Lee OK，Su Y．Cbfb enhances the osteogenic differentiation of both human and mouse mesenchymal stem cells induced by Cbfα-1 via reducing its ubiquitination-mediated degradation[J]．Stem Cells,2007,25:1462-1468.

[3] Block G，Port FK．Calcium phosphate metabolism and cardiovascular disease in patients with chronic kidney disease[J].Semin Dial，2003,16:140-147.

[4] 付平，唐萬欣.慢性腎臟病患者血管鈣化的診治進展[J].中國血液凈化，2008,7:233-235.

[5] Giachelli CM. The emerging role of phosphate in vascular calcification[J].Kidney Int,2009,75:890-897.

[6] 王英,王梅. 高鈣、高磷對體外培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細胞鈣化的作用[J].中國血液凈化,2008,7:85-89.

[7] Davies MR,Hruska KA.Pathophysiological mechanisms of vascular calcification in end-stage renal disease[J].Kidney Int,2001,60:472-479.

[8] Lien CY,Lee OK,Su Y.Cbfb enhances the osteogenic differentiation of both human and mouse mesenehymal stem cells induced by Cbfa 1 via reducing its ubiquitination-mediated degradation[J]．Stem Cells，2007,25:1462-1468.

[9] Kojima H,Uemura T.Strong and rapid induction of osteoblast differentiation by cbfa1/til-1 overexpression for bone regeneration[J].J Bio Chem,2005,280:2944-2953.

[10] 白宇,張柳,呂志偉.辛伐他汀在人骨髓基質干細胞向成骨細胞分化過程中的作用[J].中國骨質疏松雜志,2007,13:381-384.

[11] Ishimura E，Taniwaki H,TabataT．elal．Cross-sectional association of serum phosphate with carotid intima-medial thickness in hemodialysis patients[J]．Am J Kidney Dis，2005，45:859-865.

[12] 張穎娟,鄭法雷.慢性腎臟病血管鈣化機制研究進展—抑制與促進血管鈣化兩類因子的重要作用[J].國際泌尿系統(tǒng)雜志,2008,28:505-509.

[13] Reynolds JL，Joannides AJ，Skepper JN,et al.Human vascular smooth muscle cells undergo vesicle-mediated calcification in response to changes in extracellular calcium and Phosphate Concentrations:a potential mechanism for accelerated vascular calcification in ESRD[J]．J Am Soc Nephrol,2004,15:2857-2867.