苗迎秋，鄭叢龍

(大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622)

現(xiàn)臨床許多抗腫瘤藥物如阿霉素、長(zhǎng)春新堿、紫衫醇等能通過啟動(dòng)凋亡機(jī)制殺傷腫瘤細(xì)胞。其作用過程:藥物抵達(dá)腫瘤細(xì)胞→與靶點(diǎn)結(jié)合→細(xì)胞功能改變或細(xì)胞內(nèi)損傷→感受器損傷→信號(hào)傳導(dǎo)→凋亡機(jī)制啟動(dòng)→細(xì)胞死亡[1]。 隨著細(xì)胞凋亡研究的逐步深入，許多學(xué)者認(rèn)識(shí)到對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的抑制，可導(dǎo)致腫瘤對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐藥性，即多藥耐藥(MDR)[2]。MDR的發(fā)生是制約臨床治療效果的主要因素。尋找有逆轉(zhuǎn)作用而毒副作用小的化療增敏劑,對(duì)提高腫瘤治療水平具有重要意義。目前，臨床上應(yīng)用的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑如鈣離子通道抑制劑(如鹽酸維拉帕米等)和環(huán)孢霉A及其衍生物,由于毒副作用限制其應(yīng)用。為了尋找高效、 低毒、作用靶點(diǎn)廣泛的腫瘤耐藥逆轉(zhuǎn)劑,許多學(xué)者把目光轉(zhuǎn)向了天然藥物。中藥資源豐富,作用靶點(diǎn)多,可針對(duì)多藥耐藥機(jī)制復(fù)雜的特點(diǎn)。中藥川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)為中藥川芎的有效成分之一，具有鈣通道阻滯活性，臨床主要用于治療心腦血管疾病等。近年來發(fā)現(xiàn)它可部分糾正阿霉素對(duì)小鼠腹水癌的抗藥性[3]，以及逆轉(zhuǎn)有多藥耐藥表型的MCF-7/adr細(xì)胞對(duì)多柔比星的耐藥性[4]，所以本研究通過細(xì)胞凋亡現(xiàn)象來觀察川芎嗪對(duì)細(xì)胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7/S：由吉林省腫瘤研究所提供；人乳腺癌耐藥細(xì)胞系MCF-7/adr: 本實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)建立。

1.1.2 主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)液和胎牛血清Gibco/BRL公司生產(chǎn)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)為美國(guó)Sigma產(chǎn)品；酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1，v/v)混合液、Hoechst/PI(碘化丙啶)、RNaseA、cell lysis buffer(10 mmol/L Tris-HCl buffer:pH 8.0，10 mmol/L EDTA，0.5% Triton X-100)TAE buffer為Solarbio產(chǎn)品。

1.1.3 藥 品：阿霉素(ADR 浙江海正藥業(yè))；足葉乙甙(VP-16 貴州漢方制藥)；長(zhǎng)春新堿(VCR 廣州白云山明興制藥)；紫衫醇(PTX 貴州漢方制藥)；長(zhǎng)春花堿(VBL 日本和光藥業(yè))；逆轉(zhuǎn)劑鹽酸維拉帕米(Ver 新華醫(yī)院腫瘤科提供)；川芎嗪(TMP 上海第一生化藥業(yè))。

1.2 方 法

1.2.1 耐藥細(xì)胞株MCF-7/adr的建立：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7/S細(xì)胞 2×106個(gè)接種到10 mL RPMI 1640完全培養(yǎng)基的平皿中，置5 %CO2、相對(duì)濕度90 %、溫度37℃的培養(yǎng)箱中。24 h后待細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)，先以終濃度為160 ng/mL的ADR培養(yǎng)液沖擊細(xì)胞，72 h后棄含藥培養(yǎng)液,PBS洗3遍,換新鮮RPMI 1640完全培養(yǎng)液，換液1次/2 d洗去死亡細(xì)胞，待形成細(xì)胞克隆時(shí)傳代,恢復(fù)穩(wěn)定生長(zhǎng)后再次沖擊，3次后再提高ADR濃度如此反復(fù)間歇作用直至細(xì)胞可在濃度為80 ng/mL的ADR培養(yǎng)液中維持培養(yǎng)。再用20 μg/mL ADR作用2 h后,消化傳代24 h后細(xì)胞恢復(fù)健康，于含80 ng/mL的ADR培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，反復(fù)沖擊用藥。通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生長(zhǎng)曲線測(cè)定，MTT法測(cè)定細(xì)胞對(duì)ADR等5種抗癌劑的敏感性、耐藥性等常規(guī)測(cè)定MCF-7/adr符合MDR細(xì)胞株。

1.2.2 MTT法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞的無毒濃度和TMP、Ver對(duì)MCF-7/adr耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用：MCF-7/adr細(xì)胞株脫離ADR 2周后,取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期MCF-7/S和MCF-7/adr細(xì)胞4×104個(gè)/mL 100 μL分別接種到96孔培養(yǎng)板中，置5 %CO2，相對(duì)濕度90 %，溫度37℃的培養(yǎng)箱中,24 h后待細(xì)胞呈單層貼壁生長(zhǎng)后，加各藥物相應(yīng)濃度100 μL，和逆轉(zhuǎn)劑作用時(shí)加抗癌劑相應(yīng)濃度50 μL，TMP或Ver 50 μL。培養(yǎng)72 h后，每孔加25 μL MTT(5 mg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去孔內(nèi)原有液體，每孔加200 μL二甲基亞砜(DMSO),振蕩至結(jié)晶完全溶解后，酶標(biāo)儀上以570 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光光度值(A)。相對(duì)抑制率(%)=(1-加藥孔A值/對(duì)照孔A值)×100%，IC50計(jì)算器軟件計(jì)算50 %細(xì)胞生長(zhǎng)抑制時(shí)的藥物濃度(IC50),耐藥指數(shù)(RI)=耐藥細(xì)胞IC50/親本細(xì)胞IC50，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)前IC50/耐藥細(xì)胞逆轉(zhuǎn)后IC50。

1.2.3 倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察TMP逆轉(zhuǎn)前、后細(xì)胞形態(tài)的變化：取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期MCF-7/adr細(xì)胞制成2×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液，1 mL/孔的比例接種到6孔培養(yǎng)板中，置5 %CO2，相對(duì)濕度90 %，溫度37℃的培養(yǎng)箱中,24 h培養(yǎng)生長(zhǎng)后，各藥物溶液加1 μL,空白孔加DMSO 1 μL,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。加入20 μL 的1 mM Hochest 33342和1 mg/mL PI混合物(1∶1，v/v)，5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min，熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，活細(xì)胞被熒光色素處理后呈現(xiàn)藍(lán)色，死亡細(xì)胞和凋亡細(xì)胞的凋亡小體呈現(xiàn)紅色。

1.2.4 凋亡細(xì)胞DNA片段檢測(cè)：取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期MCF-7/adr細(xì)胞制成1×106個(gè)/mL細(xì)胞懸液，直徑9 cm的平皿中，置5 %CO2，相對(duì)濕度90%，溫度37℃的培養(yǎng)箱中,24 h培養(yǎng)生長(zhǎng)后，各種藥物溶液加10 μL，空白孔只加DMSO 10 μL。5% CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，用細(xì)胞刮刀回收各樣本細(xì)胞，離心(3000 r /min, 5 min，4℃)去除上清，用低溫的PBS洗兩次。加入細(xì)胞溶解液500 μL，4 ℃，靜置45 min后，離心(13000 r /min, 45 min，4 ℃)取上清移至1.5 mL離心管中，加入500 μL酚：氯仿：異戊醇(25∶24∶1，v/v)混合液，反復(fù)顛倒混勻90 min，常溫離心13000 r /min, 15 min，取上層移至1.5 mL離心管中，重復(fù)上述操作。取上層于1.5 mL離心管中，加入氯仿500 μL反復(fù)顛倒混勻30 min，13000 r /min, 常溫離心15 min，取上層500 μL于1.5 mL離心管中，加入50 μL 5 mol/L氯化鈉、1 mL乙醇，-20℃放置，取出離心(13000 r /min,45 min，4 ℃)，去除上清，用70 %乙醇500 μL洗凈，離心室溫風(fēng)干。用TAE buffer溶解，加RNase A最終濃度400 μg/mL，37℃作用2 h，定量，加樣緩沖液調(diào)整1 μg/孔，1.8 %瓊脂糖凝膠電泳25 min，1 mg/mL溴化乙錠染色30 min，脫色30 min，用Dolphin view檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用 SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)軟件, 采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2．1 MCF-7/adr細(xì)胞株的耐藥性檢測(cè)

2．1．1 阿霉素誘導(dǎo)的MCF-7/adr細(xì)胞形態(tài)變化：倒置顯微鏡下MCF-7/S和MCF-7/adr細(xì)胞均呈上皮樣單層排列，細(xì)胞大小不一，為多角形；MCF-7/S邊界清楚，多偽足；MCF-7/adr細(xì)胞邊界不清，核大，細(xì)胞體積增大，由原來體積相對(duì)較小的細(xì)長(zhǎng)的梭形變?yōu)轶w積膨脹的不規(guī)則形狀，核分裂像增多,見圖1。MCF-7/adr的生長(zhǎng)周期(Td)：(49.56±1.27)h 與MCF-7/S的Td:(41.23±2.61)h 比較，差異有顯著性意義，P<0.01。

圖1 ADR誘導(dǎo)后的MCF-7/S與MCF-7/adr在外觀形態(tài)的區(qū)別Fig 1 The comparison of cell shape of MCF-7/S cell and MCF-7/adr cell after treated with ADR

2.1.2 不同抗癌劑對(duì)細(xì)胞株的IC50及耐藥指數(shù)測(cè)得的結(jié)果：運(yùn)用MTT方法測(cè)得各抗癌劑對(duì)ADR誘導(dǎo)的MCF-7/adr細(xì)胞株的IC50明顯增加，結(jié)果見表1。對(duì)ADR、VP-16、VCR 、PTX 和VBL的RI分別為145.7、41.7、72.2、488.4 和286.8，顯示出明顯的多藥耐藥表型。

表1 不同抗癌劑對(duì)細(xì)胞的IC50和RI的測(cè)定結(jié)果Tab1 IC50 and RI of cell treated with various anticancer drugs

1)MCF-7/S對(duì)抗癌藥的IC50；2)MCF-7/adr 對(duì)抗癌藥的IC50(P<0.01，MCF-7/S vs MCF-7/adr)

2．1．3 TMP和Ver逆轉(zhuǎn)后不同抗癌劑對(duì)耐藥細(xì)胞株的IC50結(jié)果：運(yùn)用MTT方法測(cè)得TMP細(xì)胞最大無毒濃度為320 μg/mL，確定Ver逆轉(zhuǎn)濃度為5 μg/mL。結(jié)果顯示，TMP逆轉(zhuǎn)后各抗癌劑對(duì)MCF-7/adr細(xì)胞株的IC50明顯降低，逆轉(zhuǎn)效果雖不及Ver，但也具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

2．2 倒置顯微鏡觀察TMP逆轉(zhuǎn)前、后MCF-7/adr細(xì)胞形態(tài)的變化

取濃度分別為3、20、10、8和5 μg/mL的ADR、VP-16、VCR、PTX 和VBL作用細(xì)胞48 h后，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)良好，TMP逆轉(zhuǎn)后，可見變圓、脫落的細(xì)胞增多(圖2)。

2．3 熒光顯微鏡觀察TMP逆轉(zhuǎn)后細(xì)胞形態(tài)

經(jīng)Hochest 33342和 PI染色后，熒光顯微鏡下可見TMP逆轉(zhuǎn)后抗癌劑誘導(dǎo)的細(xì)胞核濃縮和凋亡小體(圖3箭頭處)典型細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象。

表2 Ver和TMP逆轉(zhuǎn)后不同抗癌劑對(duì)MCF-7/adr細(xì)胞的IC50和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)Tab 2 IC50 and reverse multiple of MCF-7/adr cell line of anticancer drugs after treated with Ver and TMP

1) 加逆轉(zhuǎn)劑前抗癌劑對(duì)MCF-7/adr的IC50；2)加Ver后抗癌劑對(duì)MCF-7/adr的IC50；3)加TMP后抗癌劑對(duì)MCF-7/adr的IC50(P<0.01，TMP逆轉(zhuǎn)前 vs TMP逆轉(zhuǎn)后)

圖2 倒置顯微鏡觀察TMP逆轉(zhuǎn)前、后MCF-7/adr細(xì)胞的形態(tài) A：ADR；B：ADR+TMP；C：VP-16 ；D：VP-16+TMP；E：VCR；F：VCR+TMP；G：PTX；H：PTX+TMP ；I：VBL；J：VBL+TMPFig 2 The cell shape of MCF-7/adr cell line treated with TMP or not under inverted microscope and fluorescence microscope

圖3 熒光顯微鏡觀察TMP逆轉(zhuǎn)后MCF-7/adr細(xì)胞的形態(tài)A：TMP；B：ADR+TMP；C：VP-16+TMP；D：VCR+TMP；E：PTX+TMP；F：VBL+TMPFig 3 The cell shape of MCF-7/adr cell line treated with TMP or not under fluorescence microscope

2．4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)TMP逆轉(zhuǎn)前、后細(xì)胞凋亡DNA片段結(jié)果

取濃度分別為3、10、8和5 μg/mL的ADR、VCR、PTX 和VBL作用細(xì)胞48 h后，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示無DNA片段，TMP逆轉(zhuǎn)后，結(jié)果顯示檢測(cè)出DNA片段，見圖4。

圖4瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)TMP逆轉(zhuǎn)前、后抗癌劑誘導(dǎo)MCF-7/adr細(xì)胞凋亡的DNA片段

Fig 4 The change of DNA fragment of MCF-7/adr apoptosis cell line induced by anticancer drugs treated with TMP or not

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，利用ADR誘導(dǎo)的MCF-7/adr細(xì)胞顯示出很好的多藥耐藥表型；TMP有效地逆轉(zhuǎn)了MCF-7/adr細(xì)胞對(duì)ADR、VP-16、VCR、PTX 和VBL的耐藥性，其逆轉(zhuǎn)倍數(shù)雖不及Ver，但與逆轉(zhuǎn)前相比差異有顯著性意義，P<0.01；通過凋亡小體熒光染色觀察和DNA片段測(cè)定，結(jié)果顯示TMP有效逆轉(zhuǎn)了MCF-7/adr細(xì)胞對(duì)非細(xì)胞毒性劑量的抗癌藥物引起的凋亡誘導(dǎo)。

腫瘤細(xì)胞對(duì)多種抗癌藥物產(chǎn)生抗藥性，即多藥耐藥,阻礙了腫瘤生物治療的進(jìn)展,是腫瘤化療失敗的重要原因。探究多藥耐藥腫瘤治療的新策略,是目前腫瘤防治研究的熱點(diǎn)。多藥耐藥基因及其產(chǎn)物P-gp糖蛋白過度表達(dá)，在一定程度上限制了人類腫瘤化療的成功。P-gp 可將結(jié)構(gòu)和功能不同的化合物,如抗癌藥物(長(zhǎng)春新堿、阿霉素)、細(xì)胞毒藥物(秋水仙堿、嘌呤霉素)、免疫抑制劑(環(huán)孢素 A、 FK506)等泵出細(xì)胞外[5]。許多抗腫瘤藥物是通過誘導(dǎo)凋亡殺傷細(xì)胞來抑制腫瘤生長(zhǎng)的。而對(duì)P-gp的另一重要發(fā)現(xiàn)是其具有凋亡抑制作用。該發(fā)現(xiàn)為腫瘤耐藥與細(xì)胞凋亡耐受之間在分子水平上建立了有機(jī)的聯(lián)系[6]。目前研究認(rèn)為，細(xì)胞凋亡抑制亦可能是腫瘤耐藥的主要機(jī)制之一[7]。近年來的研究表明，P-gp 可能直接或間接地參與細(xì)胞的分子代謝、增殖、分化等方面的調(diào)控,揭示P-gp具有潛在的多重生理功能,尤其是它可抵抗死亡受體配體 FasL、腫瘤壞死因子(TNF)、射線等誘導(dǎo)的caspase 依賴性凋亡，而顆粒酶B、孔形成蛋白、六甲撐雙乙酰胺(HMBA)等誘導(dǎo)的caspase 非依賴性凋亡不受P-gp的影響，提示P-gp在細(xì)胞凋亡中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用[8]。

非細(xì)胞毒性劑量的川芎嗪能通過下調(diào)P-gp的表達(dá)而逆轉(zhuǎn)MDR[4，5], 其可能的機(jī)制有: ①鈣通道阻滯劑與抗腫瘤藥物競(jìng)爭(zhēng)P-gp的結(jié)合位點(diǎn)，從而抑制其跨膜泵作用，使抗腫瘤藥物的細(xì)胞外排降低，提高細(xì)胞內(nèi)瘤藥物濃度而逆轉(zhuǎn)耐藥[9]；②有研究推測(cè) TMP 在競(jìng)爭(zhēng)P-gp藥物結(jié)合位點(diǎn)的同時(shí)，還可能通過直接抑制P-gp的活性而影響P-gp功能[10]；③TMP不僅可阻斷外鈣內(nèi)流,而且也可直接作用于鈣庫(kù)，阻斷內(nèi)鈣釋放，通過以上兩條途徑,降低細(xì)胞中鈣濃度[11]。胞內(nèi)鈣濃度降低可以抑制鈣依賴型蛋白激酶C(PKC)的活化。同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)TMP在人外周血淋巴細(xì)胞中抑制PKC的活化[12]。有研究提示PKC 可以促進(jìn)P-gp磷酸化,增強(qiáng)其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能,維持細(xì)胞MDR表型,而抑制PKC活性則可以降低P-gp磷酸化水平,逆轉(zhuǎn)腫瘤 MDR[13,14],可以據(jù)此推測(cè) TMP 還可能通過PKC而抑制P-gp的活性和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能。盡管TMP逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的具體機(jī)制尚不明了,但深入研究P-gp與凋亡現(xiàn)象之間的內(nèi)在聯(lián)系，是揭示P-gp本質(zhì)、 研究開發(fā)抗MDR 新藥、探索克服MDR 新途徑的基礎(chǔ)。同時(shí)，TMP還具有價(jià)格低廉、 毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)，在臨床有良好的應(yīng)用前景，有待進(jìn)一步研究開發(fā)。

[1] 朱興虎，李建勇，夏學(xué)鳴.白血病細(xì)胞耐藥與細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)·生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè),2002,22(4):4012-4031.

[2] 劉玲，何玲，劉國(guó)卿.P糖蛋白與細(xì)胞凋亡及腫瘤多藥耐藥的關(guān)系[J].藥學(xué)進(jìn)展，2005，29(3)：102-104.

[3] 胡艷平，劉健，王慶端，等. 川芎嗪和維拉帕米糾正阿霉素對(duì)小鼠艾氏腹水癌的抗藥性[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1993,28(1)：75-78.

[4] 解霞，郝立宏，高清波，等.川芎嗪逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性及其機(jī)制的研究[J].中華腫瘤防治雜志，2006，13(18)：1368-1370.

[5] Marzolini C, Paus E, Buclin T, et al.Polymorphisms in human MDR1 ( P -glycoprotein): recent advances and clinicalrelevance[J].Clin Pharmacol Ther, 2004,75(1):13-33.

[6] 劉玲,何玲,劉國(guó)卿.P糖蛋白與細(xì)胞凋亡及腫瘤多藥耐藥的關(guān)系[J].藥學(xué)進(jìn)展，2005， 29(3)：101-105.

[7] Yang E，Korsmeyer J S.Molecular thanatopsis:a discourse on the bcl22 family and cell death[J].Blood，1996，88:386-401.

[8] Johnstone R W, Ruefli A A， Smyth M J.Multiple physiological functions for multidrug transporter P-glycoprotein[J].Trends Biochem Sci， 2000,25(1):1-6.

[9] Lee CH.Reversing agents for ATP-binding cassette (ABC)transporters: application in modulating multidrug resistance(MDR)[J].Curr Med Chem Anti-Canc A gents,2004,4(1):43-52.

[10] 宋娟,唐靖,何娟,等.川芎嗪對(duì) Caco-2 細(xì)胞 P-糖蛋白功能和表達(dá)的影響[J].中南藥學(xué),2007,5(5):440-443.

[11] 徐浩.川芎嗪心血管藥理與鈣拮抗作用[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2003,23(5):376-377.

[12] 劉先勝,徐永健, 張珍祥,等.川芎嗪對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞蛋白激酶 C通道的影響[J].中國(guó)病理生理雜志,2003,19(4):507-510.

[13] Hanauske AR，Sundell K,Lahn M. The role of protein kinase C-alpha (PKC-alpha) in cancer and its modulation by thenovel PKC-alpha-specific inhibitor aprinocarsen [J].Curr Pharm Des,2004,10(16):1923-1936.

[14] Zhan M,Yu D,Liu J,et al.Transcriptional repression of protein kinase Calpha via Sp1 by wild type p53 is involved in inhibition of multidrug resistance1 P-glycoprotein phosphorylation[J].J Biol Chem,2005,280 (6):4825-4833.