武建亮，許登高，喬利英，劉文忠

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，太谷 030801）

β3腎上腺素能受體 （beta－3 adrenergic receptor，ADRB3）是一種G蛋白耦聯(lián)的膜表面受體，屬于G蛋白耦聯(lián)受體超家族的成員之一。具有調(diào)節(jié)脂肪分解和能量消耗的作用，其生理功能主要是作用于脂肪組織，通過交感神經(jīng)系統(tǒng)來刺激褐色脂肪組織和白色脂肪組織中的脂肪分解產(chǎn)生熱量［1］。在人類中ADRB3編碼的蛋白質(zhì)序列在64位點(diǎn)存在Trp64Arg突變，而Trp64Arg突變可減弱脂肪分解的活性［2］，Trp64Arg多態(tài)性還與肥胖、2－型糖尿病、高血壓等癥狀有密切關(guān)系［3－4］。在綿羊ADRB3基因中，共檢出 13 種不同的基因型［5－6］，ADRB3 多態(tài)性與羔羊的存活率、初生重和胴體組成都存在關(guān)聯(lián)效應(yīng)［7－9］。對ADRB3基因多態(tài)性的研究為綿羊分子育種體系的建立提供重要的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 本研究以12個綿羊品種（系）為研究對象，共采集962只個體的血液樣品。其中廣靈大尾羊（Guangling Fat－tailed sheep，GLT，n＝35）、大尾寒羊（Fattailed Han sheep，LTH，n＝22）、小尾寒羊（Small－tailed Han sheep，STH，n＝146）、晉中綿羊（Jinzhong sheep，JZH，n＝40）、山西肉用綿羊（Shanxi Dam Line，SDL，n＝270）、山西細(xì)毛羊（Shanxi Fine－wooled sheep，SFW，n＝40）、杜泊羊（Dorpor，DRP，n=45）、考力代羊（Corriedale，CRD，n=53）、特克塞爾羊 （Texel，TXL，n=38）、南非肉用美利奴羊（South Africa Mutton Merino，SMM，n=198）、陶賽特羊（Polled Dorset，DST，n=36）、德國肉用美利奴羊（German Mutton Merino，GMM，n=39）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用酚-氯仿抽提法提取綿羊全基因組DNA。

1.2.2 PCR-SSCP分析 根據(jù)GenBank公布的綿羊ADRB3基因序列（登錄號：DQ269497），通過軟件Primer 5.0自行設(shè)計(jì)1對引物。引物序列為：Forward 5’-CTAGCTCAGTTCTTTCTCTGC-3’和 Reverse 5’-CCCAACTCCCAACCCGATC-3’，由上海英駿生物有限公司合成。擴(kuò)增產(chǎn)物為綿羊ADRB3基因部分內(nèi)含子序列，擴(kuò)增片段長度為265 bp。PCR擴(kuò)增采用15 μL體系，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min，35個循環(huán)（94℃變性30 s，63℃退火 30 s，72℃延伸 30 s），72℃延伸 10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，取2 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入8 μL變性緩沖液，經(jīng)98℃熱變性10 min，立即置于冰上冰浴10 min，取10 μL經(jīng)過8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。電泳條件：4℃、120 V、5 W電泳12 h。采用硝酸銀染色法染色，凝膠成像系統(tǒng)成像后判斷帶型。

1.2.3 克隆測序 通過PCR-SSCP檢測后挑選不同基因型的個體進(jìn)行克隆測序。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈割膠，用試劑盒純化回收后，用pMG-T載體連接試劑盒（北京天根）連接轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆經(jīng)質(zhì)粒提取檢測后送北京諾塞基因有限公司測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析 用 Goudel（2001） 的 FSTAT（Version 2.9.3）軟件計(jì)算每個品種（系）該基因位點(diǎn)的等位基因頻率、等位基因豐度（rs）和基因多樣性（Hs）?；蚨鄻有缘挠?jì)算公式如下：

式中，nk為第i個種群的個體數(shù)，Pik為第k個種群中Ai的等位基因頻率，Hok為第k個種群的觀察雜合度。用Popgene 3.2軟件計(jì)算有效等位基因數(shù)（Ne）。用MEGA 4.0軟件進(jìn)行序列比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果。由圖1可見，引物PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致，擴(kuò)增條帶整齊、特異性強(qiáng)、產(chǎn)量高，結(jié)果理想，可用于后續(xù)研究。

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測結(jié)果

2.2 PCR-SSCP分析 對ADRB3基因5’端設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增片段長265 bp，適合做SSCP分析。通過對12個品種（系）962個個體的PCR-SSCP檢測，聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所研究綿羊的ADRB3基因在該擴(kuò)增片段上存在多態(tài)性，共檢測出 A、B、C、D、E、F、G 和 H 八種不同帶型，分別代表8種不同的基因型。

圖2 綿羊ADRB3基因的PCR-SSCP結(jié)果

2.3 綿羊ADRB3基因遺傳多態(tài)性分析

2.3.1 等位基因頻率 在所檢測的ADRB3基因位點(diǎn)中有多態(tài)性，共檢測到8種等位基因。該基因片段的不同基因型在12個綿羊品種（系）中的頻率列于表1。在不同的綿羊品種（系）中所檢出的基因型也有所不同，基因型B和C在12個品種（系）中頻率較高，為優(yōu)勢基因型，基因型H只在南非肉用美利奴綿羊中檢出，為該綿羊品種特有的基因型。

表1 各基因型在不同綿羊品種中的頻率

2.3.2 有效等位基因數(shù)和等位基因豐度 就本研究中綿羊ADRB3基因位點(diǎn)而言，總?cè)后w有效等位基因數(shù)為2.240，等位基因豐度即獨(dú)立于樣本大小的等位基因數(shù)為6.515（表2）。有效等位基因數(shù)最多的為小尾寒羊，等位基因豐度最高的為廣靈大尾羊，有效等位基因數(shù)和等位基因豐度最小的種群均是山西細(xì)毛羊。

2.3.3 基因多樣性 12個綿羊品種（系）中，ADRB3基因位點(diǎn)的基因多樣性范圍為0.050～0.729（表2），山西細(xì)毛羊的最小，小尾寒羊的最大，除山西細(xì)毛綿羊外，ADRB3基因在不同綿羊品種（系）中均表現(xiàn)出高度或中度多態(tài)性，具有較高的遺傳多樣性。

2.4 綿羊ADRB3基因部分序列核苷酸變異 序列測定及比對結(jié)果表明，8種不同基因型中共包含10個SNPs，其中基因型A包含一個A堿基的插入。綿羊ADRB3基因部分序列核苷酸變異與基因型情況見表3。

表2 不同綿羊品種（系）中有效等位基因數(shù)、等位基因豐度和基因多樣性無偏估計(jì)值

表3 綿羊ADRB3基因部分序列核苷酸變異與基因型

3 討論

3.1 綿羊ADRB3基因多樣性 本研究通過PCR－SSCP對綿羊ADRB3基因多態(tài)性分析，共檢出8種不同的基因型，這與Byun等［5］對新西蘭綿羊檢測出8種基因型和Yang等［6］對中國藏系綿羊檢測出13種基因型的結(jié)果是相似的，都表明綿羊ADRB3基因存在較高的遺傳多樣性。而造成差異的原因可能是所研究的綿羊品種（系）不同而導(dǎo)致的，也可能是所選取的該基因序列片段不同而引起的。Forrest等［7－9］的研究表明，ADRB3 基因的不同基因型與羔羊的初生重、日增重、胴體組成以及羔羊的抗寒性存在著關(guān)聯(lián)效應(yīng)。因此基于ADRB3多態(tài)性與綿羊不同的生長、生產(chǎn)性能之間的關(guān)聯(lián)性應(yīng)該進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。

3.2 綿羊遺傳資源的保護(hù) 從前人的研究和本實(shí)驗(yàn)的研究來看，山西地方綿羊品種相對來說具有豐富的遺傳資源，是人類寶貴的基因庫，應(yīng)該加以保護(hù)和利用［10－11］。本研究對ADRB3基因的遺傳多樣性檢測，為我國綿羊的地方品種遺傳資源提供了一些依據(jù)。就山西地方綿羊品種而言，晉中綿羊和廣靈大尾羊的基因多樣性值均大于0.5，表明其遺傳多樣性較為豐富，而山西細(xì)毛羊的基因多樣性值僅為0.05，說明其遺傳多樣性貧乏，應(yīng)該給予重視，加以保種。尤其是隨著畜禽品種雜交改良的開展，大量國外優(yōu)良高產(chǎn)品種的引入以及近年來農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整等因素的影響，晉中綿羊和廣靈大尾羊也不可避免地受到?jīng)_擊，如果不及時對晉中綿羊和廣靈大尾羊進(jìn)行品種特性研究和保護(hù)，晉中綿羊和廣靈大尾羊?qū)⒅氐肝覈渌鼮l?；蛞褱缃^的地方家畜品種的覆轍。從生物遺傳多樣性和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的角度來看，對該品種的保護(hù)已刻不容緩。

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