陳曉光， 韋藤幼， 賈守潔， 童張法

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西南寧530004)

葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根，習(xí)稱野葛。葛根中的葛根素具有調(diào)節(jié)血壓、增加冠脈血流量、改善腦循環(huán)、抑制血小板聚集、抗氧化自由基等作用，臨床應(yīng)用于冠心病、心絞痛均取得了明顯的療效［1］。但用于注射液中葛根素純度要求高，否則易引起發(fā)熱、過(guò)敏性皮疹、過(guò)敏性休克等癥狀［2］。目前用于葛根素純化的方法有結(jié)晶法、溶劑萃取法［3］和柱層析法［4-5］等。傳統(tǒng)的冷卻結(jié)晶［6］及超聲波結(jié)晶［7］對(duì)分離葛根素衍生物效果較差，往往需要在結(jié)晶前用酸水解法分解葛根素衍生物，并且產(chǎn)率都在1.5%以下。溶劑萃取法與柱層析法雖然也可得到高含量的葛根素，但需要經(jīng)過(guò)反復(fù)萃取或?qū)游?，工藝較繁瑣，規(guī)模生產(chǎn)成本較高。

溶析法結(jié)晶法［8］操作溫度低，但是它的過(guò)飽和度不易控制，得到的晶體顆粒小，純度低。本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)［9］的方法，提出了改進(jìn)溶析結(jié)晶法，并用其對(duì)葛根異黃酮進(jìn)行提純，得到葛根素的純度達(dá)到87.8%，得率為89.3%，在純度和得率上遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)結(jié)晶法和超聲波結(jié)晶法。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

葛根異黃酮，采用產(chǎn)自陜西省的野葛根Pueraria lobata(Willd.)Ohwi，按文獻(xiàn)［10］方法提取制備，經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)葛根素含量為45%。葛根素標(biāo)準(zhǔn)品(98%，購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)1107522200511);甲醇(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠);冰醋酸(分析純，廣東汕頭市西隴化工廠);甲醇，(一級(jí)色譜純，廣東汕頭市西隴化工廠)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

S212型恒速攪拌器(上海申順生物科技有限公司)、DDD-320型多功能電子蠕動(dòng)泵(上海之信儀器有限公司)、Agilent 1200型高效液相色譜儀(美國(guó)安捷侖公司)、SK3300LH型超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲波儀器有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 傳統(tǒng)醋酸冷卻及超聲波結(jié)晶 稱取葛根異黃酮5.00 g，加入10倍冰醋酸，在90℃下溶解(冷卻法)或在超聲波中振蕩40 min(超聲波法)，然后轉(zhuǎn)移至室溫下冷卻1 h，過(guò)濾，真空干燥，得到初結(jié)晶葛根素，兩種方法各實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.2 改進(jìn)溶析結(jié)晶 稱取葛根異黃酮15.00 g，用15 mL甲醇使其剛好完全溶解，得到的溶解液。各取一定量的冰醋酸分別做為溶析液和底物，在一定溫度及攪拌速度下，將溶解液與溶析液緩慢滴加到底物中，加入完畢后繼續(xù)攪拌2 h，過(guò)濾，洗滌，真空干燥，得到結(jié)晶葛根素。

1.4 分析方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱為 ZORBAX.SB-C18(5 μm，4.6 mm×150 mm)，流動(dòng)相為甲醇-水(25∶75)，流速為1.0 mL/min，室溫，檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取葛根素對(duì)照品5 mg，定容于10 mL的量瓶中。在上述色譜條件下進(jìn)樣，進(jìn)樣量分別為2、4、6、8、10 μL，記錄色譜峰面積。在 2 ～10 μL 時(shí)，色譜峰面積與進(jìn)樣量呈線性關(guān)系。線性回歸方程為:Y=2 054.5X －121.02，r=0.999 8，線性范圍:1 ～5 μg。

1.4.3 葛根素樣品的制備 精密稱取提純后的葛根素約16.4 mg，定容于25 mL的量瓶中。在上述色譜條件下進(jìn)行分析，進(jìn)樣量為6 μL，記錄色譜峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)晶條件對(duì)葛根素純度和得率的影響

2.1.1 結(jié)晶溫度 圖1為攪拌速率60 r/min，底物用量為溶解液0.8倍，溶解液與溶析液用量比為1∶1，滴加時(shí)間為3 h時(shí)，不同結(jié)晶溫度對(duì)葛根素得率與純度的影響。從圖中可以看出，葛根素的純度與得率隨著溫度的變化均存在最佳值。這是因?yàn)闇囟壬?，溶液黏度減小，有利于晶體的生長(zhǎng)，但溶解度下降，結(jié)晶困難，50℃為最佳溫度。

圖1 結(jié)晶溫度對(duì)葛根素得率及純度的影響

2.1.2 攪拌速率 圖2為溫度50℃，底物用量為溶解液0.8倍，溶解液與溶析液用量比為1∶1，滴加時(shí)間為3 h時(shí)，攪拌速率與葛根素得率和純度的關(guān)系。從圖中可以看出，開(kāi)始時(shí)葛根素的純度與得率隨著攪拌速率的提高而上升，在60 r/min時(shí)達(dá)到最大值后降低。這是因?yàn)閿嚢杩梢源龠M(jìn)傳質(zhì)，有利于維持均勻的過(guò)飽和度，可以提高葛根素的純度和得率。但是攪拌速率過(guò)大，影響了晶核的形成與晶體的生長(zhǎng)，故純度與得率均下降。

圖2 攪拌速率對(duì)葛根素得率及純度的影響

2.1.3 底物用量 圖3為溫度50℃，攪拌速率60 r/min，溶解液與溶析液用量比為1∶1，滴加時(shí)間為3 h時(shí)，不同底物用量對(duì)葛根素得率與純度的影響。從圖中可以看出，葛根素的純度隨著底物用量的增加而升高，而得率則隨著底物用量的增加而降低。這是因?yàn)殡S著底物用量的增加，結(jié)晶母液的黏度降低，有利于晶體的生長(zhǎng)，故純度增大，但隨著底物用量增大，結(jié)晶母液的溶解度變化不大，由于底物用量的加大，致使部分葛根素溶于底物，導(dǎo)致葛根素的得率降低。為了保證葛根素較高的收率和純度，所以最佳的底物用量為溶解液0.8倍。

2.1.4 滴加時(shí)間 圖4為溫度50℃，攪拌速率60 r/min，底物用量為溶解液0.8倍，溶解液與溶析液用量比為1∶1時(shí)，不同滴加時(shí)間的影響。從圖中可以看出，葛根素的純度隨滴加時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，得率則隨滴加時(shí)間的延長(zhǎng)存在最佳值為4h。這是因?yàn)榈渭訒r(shí)間短、速度快時(shí)，體系的結(jié)晶速度跟不上加料速度，導(dǎo)致過(guò)飽和度過(guò)大，在體系中出現(xiàn)了二次成核現(xiàn)象，雖然收率高，但葛根素晶體顆粒小、純度低;滴加時(shí)間長(zhǎng)、速度慢時(shí)，由于過(guò)飽和度過(guò)太小，結(jié)晶速度慢，效果也差。只有控制合適的加料速度，使滴加速度與晶體生長(zhǎng)速度同步，在一定的得率下得到的晶體純度才最高。

圖3 底物用量對(duì)葛根素得率及純度的影響

圖4 結(jié)晶時(shí)間對(duì)葛根素得率及純度的影響

2.1.5 溶解液與溶析液比例 圖5為溫度50℃，攪拌速率60 r/min，底物用量為溶解液0.8倍，滴加時(shí)間為3 h時(shí)，溶析液與溶解液用量比例對(duì)葛根素得率與純度的影響。從圖中可以看出，葛根素的純度與得率隨著溶析液與溶解液用量比的增大而提高，在1∶1時(shí)達(dá)到最大值后，隨著溶析液與溶解液的比例增加而降低。這是因?yàn)殡S著溶析液與溶解液用量比的增大，結(jié)晶母液的過(guò)飽和度增大，葛根素結(jié)晶的成核速率與生長(zhǎng)速率也增大，因此葛根素的純度與得率也隨之提高。但是當(dāng)溶析液與溶解液用量比超過(guò)1∶1以后，結(jié)晶母液的溶解度趨近于不變，而溶析液相對(duì)過(guò)多，不僅影響了晶體的生長(zhǎng)，而且溶解了部分葛根素，導(dǎo)致了得率和純度下降。

圖5 溶析液與溶解液之比對(duì)葛根素得率及純度的影響

2.2 不同結(jié)晶方法的比較

表1給出了傳統(tǒng)法、超聲波法與改進(jìn)溶析法結(jié)晶在結(jié)晶時(shí)間、晶體純度與得率方面的比較。傳統(tǒng)法與超聲波法相比，在普通加熱條件下的分子運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度相對(duì)于超聲波條件下的分子運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度弱，有利于晶體的成長(zhǎng)，因而加熱條件下所得的葛根素晶體純度最高。超聲波結(jié)晶屬于刺激結(jié)晶，浸膏的醋酸溶液處于超聲波條件下，促使葛根素分子驟然加速聚集，導(dǎo)致新相的晶核能夠迅速生成，因此超聲波結(jié)晶要比加熱結(jié)晶速度快，但是超聲波結(jié)晶是驟變的過(guò)程，影響因素頗多，在加速葛根素結(jié)晶的形成過(guò)程中，也相應(yīng)加速了部分雜質(zhì)在醋酸中的析出，導(dǎo)致了純度的下降。而改進(jìn)溶析結(jié)晶法是利用了底物維持了結(jié)晶過(guò)程的過(guò)飽和度，使得葛根素在結(jié)晶過(guò)程中能夠始終保持著合適的過(guò)飽和度，這樣既保證了較高的晶體得率，又保證了較高的晶體純度，而且結(jié)晶時(shí)間也不是太長(zhǎng)。從表中可知，改進(jìn)溶析法所得到的葛根素在晶體純度和得率上都遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)法和超聲波法。

表1 不同結(jié)晶方法結(jié)果比較(n=3)

2.3 不同純化階段的液相色譜圖對(duì)照

圖6 結(jié)晶前(A)后(B)葛根素的液相譜圖的比較

圖6中，A為結(jié)晶前葛根異黃酮的液相譜圖，其中葛根素的含量為45%，3′-甲氧基葛根素含量為7.32%，還有其它雜質(zhì);B為經(jīng)改進(jìn)溶析法結(jié)晶后用一定濃度的醋酸洗滌干燥后葛根素的液相譜圖，經(jīng)檢測(cè)葛根素含量提高到87.8%，并且3′-甲氧基葛根素、大豆苷元和其他雜質(zhì)也基本被除去。

3 結(jié)論

在葛根素不同結(jié)晶方法的比較中，雖然改進(jìn)溶析結(jié)晶法耗時(shí)較長(zhǎng)，但與傳統(tǒng)法、超聲波法結(jié)晶相比，葛根素晶體的純度與得率提高了很多。改進(jìn)溶析結(jié)晶法能夠有效除去3′-甲氧基葛根素、大豆苷元等葛根素衍生物，提高了葛根素的純度。

改進(jìn)溶析結(jié)晶法純化葛根素的最佳工藝為:水浴溫度為50℃，攪拌速度為60 r/min，溶析液與溶解液的用量比為1∶1，底物用量為溶解液0.8倍，滴加時(shí)間為4 h條件下結(jié)晶，葛根素的純度可達(dá)到87.76%，得率為89.3%。

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