李秋菲，王小亮，繩金房

(1.陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安 710061; 2.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，陜西 西安 710061)

藥品的質(zhì)量控制不僅與其生產(chǎn)過程密切相關(guān)，同時也與實驗室質(zhì)量管理緊密相連。因此藥品微生物質(zhì)量控制顯得尤為重要，而我國藥典至今未收錄“微生物實驗室質(zhì)量管理”的相關(guān)規(guī)定。筆者將美國藥典(USP31/NF26)“微生物實驗室質(zhì)量管理規(guī)范”章節(jié)譯出，以期為醫(yī)藥工作者提供幫助，同時也為我國新版藥典的修訂提供參考。微生物實驗室質(zhì)量管理規(guī)范(good laboratory practices)的內(nèi)容主要包括無菌操作技術(shù)、培養(yǎng)基質(zhì)量控制、實驗菌株控制、設(shè)備控制、實驗記錄和數(shù)據(jù)評估以及工作人員培訓(xùn)等。由于微生物檢測數(shù)據(jù)的變異性較大，因此實驗結(jié)果的可靠性及重現(xiàn)性依賴于所用方法及良好的實驗室質(zhì)量管理規(guī)范。

1 培養(yǎng)基的制備、儲存及質(zhì)量控制

1.1 制備

可選擇脫水干粉培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方各成分配制培養(yǎng)基。生產(chǎn)商對脫水干粉培養(yǎng)基和配制好的培養(yǎng)基應(yīng)附有使用說明，不同的培養(yǎng)基其制備方法不同(如加熱、添加添加劑、pH調(diào)節(jié))，因此按照說明操作非常重要。配制好的培養(yǎng)基應(yīng)標(biāo)示有效期、儲存條件及促生長試驗的試驗菌株等。水是微生物培養(yǎng)基配制時常用的溶劑，純化水最常用，特殊情況下可用去離子水或蒸餾水。配制培養(yǎng)基時，脫水干粉培養(yǎng)基應(yīng)完全溶解在水中，需要時可加熱助溶，但不能過度加熱(炭化)，以防止培養(yǎng)基中的熱敏成分遭到破壞;使用的設(shè)備應(yīng)能控溫、攪拌及混合。培養(yǎng)基制備過程中，如果玻璃器具未清洗干凈，可能會帶入抑菌物質(zhì)，因此要去除容器的殘留物并用純化水清洗干凈。培養(yǎng)基的滅菌應(yīng)按照生產(chǎn)商提供的參數(shù)或驗證過的滅菌方法進行，還應(yīng)提供培養(yǎng)基對特定生物指示菌株的無菌保證水平(SAL)。高壓蒸氣滅菌最常用，煮沸滅菌法可避免培養(yǎng)基中熱不穩(wěn)定成分的破壞，特殊培養(yǎng)基需采用過濾除菌法。

滅菌方法和條件可通過培養(yǎng)基的無菌檢查和促生長試驗評估。若采用高壓蒸氣滅菌法，應(yīng)驗證其滅菌周期，以確定合適的裝載模式。一般情況下，用驗證過的滅菌器進行滅菌，滅菌器生產(chǎn)商一般推薦用121℃及15 min。高壓滅菌器的載荷影響加熱速率，載荷越大，滅菌周期越長。滅菌鍋達到所需溫度較慢時，會導(dǎo)致培養(yǎng)基過度加熱而降解，因此必須注意滅菌周期驗證達到所需的無菌保證水平(SAL)。滅菌后的培養(yǎng)基不能繼續(xù)放在滅菌器內(nèi)，那樣也會破壞培養(yǎng)基。不適宜的加熱及滅菌條件，可引起購買的培養(yǎng)基及自制培養(yǎng)基發(fā)生一系列變化，如顏色改變、澄清度降低、凝膠程度改變或pH改變。

對于每批培養(yǎng)基的pH，應(yīng)在培養(yǎng)基冷卻至室溫后于無菌操作條件下測定，瓊脂培養(yǎng)基采用平頭pH計，液體培養(yǎng)基采用可浸沒的pH計。培養(yǎng)基的pH范圍應(yīng)在規(guī)定范圍的±0.2之內(nèi)，除非有驗證說明可接受更寬的pH范圍。

對于制備好的培養(yǎng)基，應(yīng)用合適的平板和試管檢查以下項目:容器或蓋子是否破碎，填裝是否均等;固體培養(yǎng)基表面是否因脫水而使表面不平整或破碎;是否存在溶血、炭化或顏色改變，在冷凍過程中形成晶體;氣泡過多;微生物污染情況、指示劑的指示狀態(tài)(如果適宜的話);檢查批號及有效期并作記錄，記錄培養(yǎng)基的無菌檢查結(jié)果。

1.2 儲存

培養(yǎng)基生產(chǎn)商或供應(yīng)商應(yīng)采用適宜的運輸、溫度控制及儲存條件以確保水分消耗降到最低，制備好的培養(yǎng)基應(yīng)有防護措施。培養(yǎng)基應(yīng)有明確的標(biāo)示批號、配制時間、有效期和相應(yīng)的鑒別試驗，并按要求儲存。制備好的培養(yǎng)基在室內(nèi)應(yīng)按照驗證條件儲存。瓊脂培養(yǎng)基不應(yīng)在0℃以下儲存，因為冷凍會破壞凝膠的結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)基不應(yīng)暴露在強光或高溫下。如果要延長儲存期，瓊脂平板可密封包裹或放置于容器中以防止水分散發(fā)。固體培養(yǎng)基只限再融化1次，以免因過度加熱或可能的污染而使質(zhì)量難以保證。再融化時可采用水浴或流通蒸氣加熱的方法。使用微波爐或加熱板進行加熱時，一定要注意因過度加熱而破壞培養(yǎng)基或因玻璃破碎而燙傷操作人員。已溶化的培養(yǎng)基可放置在45～50℃水浴中，但不得超過8 h。從水浴中取出培養(yǎng)基，在傾注之前應(yīng)先擦干容器外壁的水，不能將水帶入無菌培養(yǎng)基中。處理使用過的培養(yǎng)基及過期培養(yǎng)基時，應(yīng)按照地方當(dāng)局的生物危害安全程序進行。

1.3 質(zhì)量控制

實驗室可以自制培養(yǎng)基，但為了方便，多數(shù)實驗室使用脫水干粉培養(yǎng)基或直接購買平板或瓶裝的培養(yǎng)基。生產(chǎn)商力圖從生物來源上標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)基的原材料，但自然來源帶來的差異不可避免，因此必須考慮各批培養(yǎng)基之間的差異。不管是實驗室自制還是生產(chǎn)商配制的培養(yǎng)基，其質(zhì)量均取決于制備過程。不適宜的制備過程會對微生物生長及試驗結(jié)果重現(xiàn)產(chǎn)生不良影響，其結(jié)論也不可靠。制備的培養(yǎng)基均應(yīng)進行質(zhì)量控制。對于實驗室自制培養(yǎng)基，按常規(guī)質(zhì)量控制，項目包括pH、促生長試驗及有效期測定;若按相關(guān)驗證方法進行配制和滅菌過程受控，那么同一批脫水培養(yǎng)基的促生長試驗可只進行一次;若培養(yǎng)基的制備未經(jīng)驗證，則都應(yīng)進行促生長試驗測試。對于特殊培養(yǎng)基，測試菌株可在廠家說明的基礎(chǔ)上選擇，也可包括有代表性的環(huán)境分離菌株。

培養(yǎng)基的有效期指的是促生長試驗應(yīng)滿足要求的期限。培養(yǎng)基的貨架期取決于培養(yǎng)基處方及其各成分的穩(wěn)定性、容器的類型及密閉狀況。當(dāng)一批培養(yǎng)基不滿足促生長試驗測試時，應(yīng)啟動不符合事件調(diào)查，并提出糾正和預(yù)防措施，使問題不再出現(xiàn)。如果原因不清或沒有相關(guān)的糾正措施，任何不合格培養(yǎng)基均不得使用。

鑒別微生物時，常用染色劑如革蘭染色劑和氧化酶染色劑。對染色劑的質(zhì)量控制類似于微生物生長培養(yǎng)基，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)控制菌，按照生產(chǎn)商說明書在鑒別試驗前進行測試。應(yīng)特別注意用于環(huán)境檢測的培養(yǎng)基的質(zhì)量控制。此培養(yǎng)基應(yīng)進行終端滅菌和加倍包裹，若未進行終端滅菌，則須進行100%預(yù)培養(yǎng)檢查，這樣可防止環(huán)境監(jiān)測時的外來污染而得出假陽性結(jié)果。對于表面接觸法取樣平板，若提高培養(yǎng)基瓊脂含量，也必須經(jīng)驗證。

2 微生物菌株的保藏與復(fù)壯

標(biāo)準(zhǔn)一致的菌種保藏與復(fù)壯對測試結(jié)果至關(guān)重要。微生物菌種的活力及生物特性取決于適宜的處理及儲存方法，實驗室將菌種的保藏與復(fù)壯方法標(biāo)準(zhǔn)化，會減少污染幾率及降低微生物特性的改變。授權(quán)檢驗測試的菌種應(yīng)來自國家菌種保藏中心，可以是冰凍的、冷凍干燥的、斜面或現(xiàn)成的形式，使用之前應(yīng)進行純度、鑒別確認測試?，F(xiàn)成的培養(yǎng)物應(yīng)進行純度、一致性和接種量確認，經(jīng)常使用的微生物菌種最好進行基因分析確認(如DNA指紋、16SrRNA基因序列或用適宜的探針進行PCR分析)。菌種的制備及復(fù)壯應(yīng)按照供應(yīng)商提供的說明或經(jīng)過驗證的方法進行，對貯存培養(yǎng)物建議采用“種子批”技術(shù)儲存。

來自國家菌種保藏中心的原始菌株可在適宜的培養(yǎng)基上進行復(fù)蘇和增殖。原始菌株培養(yǎng)物(第1代菌株)在防凍培養(yǎng)基中制成混懸液，再轉(zhuǎn)移至冷凍瓶，在-30℃或更低的溫度下冷凍保存，直至使用。如果在-70℃或以低壓冷凍干燥技術(shù)保存，菌株可長期保存。冷凍的菌懸液在1個月或1周內(nèi)可傳代作為工作菌株一旦打開使用，則不應(yīng)再重新凍存，剩余部分應(yīng)該棄去。應(yīng)盡量減少工作菌株的傳代次數(shù)，以降低次級培養(yǎng)物的表型變異概率。

3 實驗室設(shè)備的維護

大部分設(shè)備(培養(yǎng)箱、水浴和高壓滅菌鍋)在購進時應(yīng)按驗證過的標(biāo)準(zhǔn)進行安裝驗證、運行驗證和試用驗證。另外，定期的校準(zhǔn)(通常為1年)也很必要。對于新購進的設(shè)備，應(yīng)按質(zhì)量管理部門(QAU)制定的操作規(guī)范進行驗證。微生物實驗室儀器(pH計和分光光度儀)使用時應(yīng)定期進行校準(zhǔn)和測試來證實其是否正常，校準(zhǔn)和測試周期由儀器的種類和測試數(shù)據(jù)的重要性來決定。

4 實驗室的布局和操作

微生物實驗室的設(shè)計和布局應(yīng)考慮質(zhì)量規(guī)范和安全影響因素，最大可能地降低微生物的交叉污染，使微生物樣品在處理時被污染的可能性降至最低。一般來說，實驗室分為潔凈區(qū)域、無菌區(qū)域及普通區(qū)域。如有可能，無菌產(chǎn)品的試驗操作和培養(yǎng)，應(yīng)在無菌區(qū)域環(huán)境中進行;如果不能達到完全隔離潔凈區(qū)和普通區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)，可采取其他措施或無菌規(guī)范來降低污染的可能性，包括使用防護布、清潔與消毒等。在實驗室適當(dāng)?shù)奈恢脴?biāo)示處置微生物泄漏災(zāi)害的方法，應(yīng)對所有相關(guān)的技術(shù)人員進行防范安全事故的培訓(xùn)。

樣品如有微生物生長，需要進一步的實驗室分析來確證被污染，可將樣品及時從潔凈區(qū)轉(zhuǎn)移至普通區(qū)，進行次級培養(yǎng)、染色、微生物鑒別及其他測試。如有可能，發(fā)現(xiàn)有菌落生長的樣品不應(yīng)在潔凈區(qū)打開，因分離被污染的樣品和材料會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。試驗人員不能在普通區(qū)檢測樣品，必須采取特殊措施包括穿防護衣、戴手套并認真進行手消毒。無菌樣品不能在普通區(qū)操作。理想情況下，所有的微生物樣品包括那些非無菌產(chǎn)品，應(yīng)該在特殊區(qū)域或完全無菌的條件下采樣。預(yù)防樣品的微生物外來污染很重要，實驗設(shè)施的設(shè)計應(yīng)使原材料及輔料能在可控條件下進行抽樣，包括適宜的無菌采樣設(shè)備。采樣系統(tǒng)不可能總處于無菌環(huán)境下，如水系統(tǒng)，但對在非無菌條件下的采樣，應(yīng)說明可能引起的結(jié)果可靠性問題。對于環(huán)境檢測采樣，在裝載和卸載儀器時需進行嚴(yán)格無菌處理，如有可能，采樣儀應(yīng)在檢測區(qū)中安裝微生物回收培養(yǎng)基。

實驗室內(nèi)任何關(guān)鍵實驗步驟，如原料藥及制劑的無菌檢查，生物制品生產(chǎn)用菌種增殖和細胞培養(yǎng)等均應(yīng)在控制區(qū)操作。隔離器應(yīng)有更好的抗污染能力，使檢測結(jié)果的假陽性率降低，常用于無菌檢測試驗。隔離器需經(jīng)兩方面的驗證，一是確保隔離器內(nèi)檢測環(huán)境符合要求，二是預(yù)防由于使用消毒劑引起的假陰性結(jié)果。

5 檢測人員的培訓(xùn)

參與藥品生產(chǎn)各個環(huán)節(jié)的每一位工作人員均應(yīng)受過相關(guān)專業(yè)教育培訓(xùn)，具有相關(guān)的工作經(jīng)歷。微生物檢測監(jiān)督及管理人員應(yīng)有微生物專業(yè)知識并不斷更新，以提高操作技能。微生物實驗室應(yīng)制訂特定的操作規(guī)程，這一規(guī)程在培訓(xùn)中發(fā)揮兩方面的作用:首先，規(guī)程要求微生物實驗者為獲得精密度及重現(xiàn)性好的結(jié)果而必須采用的方法，可作為培訓(xùn)的基礎(chǔ);其次，可通過追蹤操作規(guī)程了解微生物工作者所受到的相關(guān)培訓(xùn)，包括規(guī)程名稱和數(shù)量。培訓(xùn)內(nèi)容應(yīng)根據(jù)各個實驗室工作人員的特殊性及其工作性質(zhì)而定，培訓(xùn)記錄應(yīng)是現(xiàn)行有效的。

定期的工作評價在質(zhì)量檢測中非常必要，評價內(nèi)容包括衛(wèi)生學(xué)、傾注平板、無菌操作技術(shù)、處理文件的能力及其他微生物檢測工作所必備的能力。負責(zé)監(jiān)管的微生物實驗室主管應(yīng)經(jīng)過相應(yīng)的教育或相關(guān)技能的培訓(xùn)，如監(jiān)管技巧、實驗室安全、制度管理、實驗結(jié)果分析、技術(shù)報告書寫、相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)以及其他指導(dǎo)實驗室關(guān)鍵工作等方面的培訓(xùn)。

6 文件

對于實驗室測試及控制方法的文件應(yīng)能進行充分說明，主要包括但不限于以下幾方面:微生物工作者的培訓(xùn)及能力證明;設(shè)備的驗證、校準(zhǔn)及保養(yǎng);測試時，設(shè)備性能的檢測(如24 h或7 d的制圖記錄);培養(yǎng)基的制備、無菌檢查、促生長試驗及靈敏度測定;培養(yǎng)基的詳細記錄及控制測試，有特殊要求的關(guān)鍵成分的測試;數(shù)據(jù)及其計算、驗證，質(zhì)量部或質(zhì)量部經(jīng)理審核意見，數(shù)據(jù)偏差的調(diào)查分析(若需要)。

7 實驗記錄的保存

數(shù)據(jù)及研究記錄對微生物實驗室至關(guān)重要，原則是測試必須按照SOP進行。SOP的內(nèi)容是實驗測試的實際操作，實驗室的記錄應(yīng)是確認數(shù)據(jù)真實性的關(guān)鍵證據(jù)。實驗室最低要求的記錄應(yīng)該包括以下內(nèi)容:測試物質(zhì)，微生物名稱，程序編號，測試結(jié)果的文件，偏差(如果需要);管理者審核簽名，試驗參數(shù)(所用設(shè)備、所用微生物培養(yǎng)物及培養(yǎng)基批次)。應(yīng)記錄設(shè)備的運轉(zhuǎn)情況，并按照SOP的規(guī)定定期進行校正并做好保養(yǎng)記錄，必要時應(yīng)準(zhǔn)備記錄薄或其他形式的記錄。另外，還應(yīng)記錄設(shè)備的溫度(水浴溫度、培養(yǎng)箱溫度、滅菌器溫度)以備追蹤檢查。指導(dǎo)性的SOP及其修正應(yīng)明確地記錄，修改的數(shù)據(jù)應(yīng)劃一條線去除，同時附上簽名，原始數(shù)據(jù)不應(yīng)擦掉或覆蓋。試驗結(jié)果包括最初的平板計數(shù)應(yīng)予保留，以便復(fù)核及按照計算重現(xiàn)最終的測試結(jié)果。數(shù)據(jù)處理方法應(yīng)在SOP中規(guī)定。所有的實驗室記錄應(yīng)備案保存以防災(zāi)難性損失，正式記錄的保存及取回應(yīng)有程序文件規(guī)定。

8 測試結(jié)果

由于以下幾方面原因，微生物試驗的測試結(jié)果很難解釋說明:微生物在自然環(huán)境及環(huán)境污染物中普遍可見，尤其與人類關(guān)系密切的特殊微生物;實驗室進行樣品處理過程及實驗操作時，存在的潛在污染;環(huán)境或樣品中的微生物分布不均勻;微生物測試結(jié)果的差異很大。因此，預(yù)期結(jié)果的微小變化可能意義不是很大?；谖⑸锓治龅倪@些特點，實驗室應(yīng)最大程度地避免外來污染。同樣重要的是，必須以更廣闊的微生物視角來解釋結(jié)果，不僅要考慮自然界中存在的微生物，而且也要考慮對藥品組分、賦形劑或測試環(huán)境中可能存在的微生物，以及考慮微生物的生長特性(尤其是液體培養(yǎng)基中真菌的生長)。

當(dāng)檢測的結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)或另外建立的定量目標(biāo)不符時，需要進行調(diào)查，總的來說應(yīng)重視兩方面的原因:實驗室操作或者環(huán)境條件帶來無效的結(jié)果、產(chǎn)品本身帶有一定程度的污染或特殊微生物的存在。對邊緣數(shù)值應(yīng)作全面的評估，所有可影響檢測結(jié)果的觀察條件、檢測數(shù)據(jù)條件和因素均應(yīng)予以充分考慮，包括測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的偏離程度，重要的是試驗結(jié)果的偏離是否有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗室環(huán)境、樣品保護措施、被測物的歷史測定結(jié)果及特性，尤其是與相關(guān)的微生物存活及增殖特性的關(guān)系應(yīng)在調(diào)查中考慮。另外，與檢測者的交流可提供有關(guān)測定結(jié)果可靠性及過程適宜性方面有價值的信息。若確認實驗操作是檢測數(shù)據(jù)偏離的原因，則要針對問題制訂相應(yīng)的改正措施。應(yīng)按照修正并經(jīng)過驗證的措施，對條件進行嚴(yán)格監(jiān)控并對糾正措施的適宜性進行評價。如果測試結(jié)果偏離是確定的，必須記錄備案。實驗室也應(yīng)有程序保證確認測試，如規(guī)定程序和指導(dǎo)原則無法保證測試結(jié)果，應(yīng)取樣重測。