裴鳳群

(平煤醫(yī)療集團(tuán)職業(yè)病醫(yī)院 河南 平頂山 467000)

1 實驗材料

1.1 實驗藥物

濃縮到每mL相當(dāng)于3.338g生藥西紅花水提物。獲取過程:新疆西紅花200g,水2500mL,加熱到沸騰,然后提取1.0h,然后對混合液過濾,最后把濾液濃縮提純到實驗所需濃度。

1.2 實驗動物

大鼠乳鼠:出生5～7d的Wistar。

1.3 實驗試劑

氧化低密度脂蛋白,乙酸乙酯,α-苯基-N-叔丁基氮氧化物。

1.4 實驗儀器

超凈工作臺,MCO-15AC型CO2培養(yǎng)箱,H2S-H型恒溫水浴振蕩器,LDZ4-0.8型離心機(jī),MK型倒置顯微鏡,QL-901旋渦混合器,ESR200D-SRC型電子自旋共振波譜儀。

2 實驗方法及過程

2.1 培養(yǎng)大鼠原代心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(rCMEC)

首先進(jìn)行大鼠的原代培養(yǎng)rCMEC,然后再進(jìn)行傳代培養(yǎng),傳代培養(yǎng)前需先進(jìn)行rCMEC鑒定,培養(yǎng)出的第三代細(xì)胞用于實驗[1]。

2.2 實驗方法

(1)配制自旋捕獲劑PBN:取溫浴無菌PBS,把準(zhǔn)確稱取的PBN放入其中進(jìn)行溶解,然后把其置于磁力攪拌器上進(jìn)行攪拌,攪拌時間30min左右,成為200mmol.L-1,PH=7.4的PBN飽和溶液,實驗時候把飽和溶液加入到等量的培養(yǎng)基中,最后得到濃度為100mmol.L-1的PBN溶液,作為電子自旋捕獲劑。(2)自由基的捕集及內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng):把內(nèi)皮細(xì)胞以每孔0.8mL接種于24孔板,密度為1.5×105個/mL,24h細(xì)胞貼壁后,把其分為空白對照組、模型對照組、西紅花水提物組等6組。各組共同孵育24h。然后,各組均換成100μg.mL-1的ox-LDL的無血清培養(yǎng)基0.25mL,同時將終濃度為100mmol.L-1的PBN0.25mL加入各組,并小心吹打均勻。于37℃時,孵育45min,然后把培養(yǎng)板取出來,用細(xì)胞刀,小心刮取細(xì)胞,將收集到的細(xì)胞懸液置于于5mLEP管中,盡快提取送檢[2]。(3)自由基的提取過程把0.4mL乙酸乙酯加入到每個EP管中,混勻。3000rpm,離心10min;把上層無色液體60μL小心吸取到樣品管中,放入ESR波譜儀中測定。測定條件:X波段,400G的掃描寬度,3385G的中心磁場,3.2G的調(diào)制幅度,20mW的微波功率,增益:4×105,室溫下測溫。

2.3 數(shù)據(jù)分析

以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示結(jié)果,采用方差分析(ANOVA)進(jìn)行多組間比較,統(tǒng)計學(xué)顯著性設(shè)定P<0.05。

3 結(jié)果

用各組譜線第二峰的高度來表示每組細(xì)胞自由基與PBN形成的自旋加合物信號的相對強(qiáng)度。實驗發(fā)現(xiàn)與空白組比較,模型組中自旋加合物信號峰值明顯較高,具有顯著性差異,而各個西紅花給藥組信號峰值呈現(xiàn)了不同程度降低,500μg.mL-1和20μg.mL-1信號峰值的降低更為顯著。提示西紅花水提物能夠減少ox-LDL損傷的微血管內(nèi)皮細(xì)胞自由基生成,具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化損傷的作用。

4 討論

目前,檢測自由基最直接和最有效的方法和技術(shù)是電子順磁共振(EPR)也叫電子自旋共振(ESR),但是對自由基的要求較高,首先自由基必須相對穩(wěn)定,而且要達(dá)到一定濃度才能用電子順磁共振(EPR)技術(shù)檢測。而實際上,化學(xué)反應(yīng)中及生物體系內(nèi)產(chǎn)生的自由基大部分是不穩(wěn)定的,自旋捕集技術(shù)則因不受其限制解決了這一技術(shù)上的難題。自旋捕集技術(shù)就是為了檢測和辨認(rèn)短壽命自由基,將一種不飽和的抗磁性物質(zhì)加入要研究的反應(yīng)體系,生成壽命較長的自旋加合物,便于用ESR檢測[3]。

鑒于本實驗是對細(xì)胞中的自由基進(jìn)行檢測,難免受到血清、培養(yǎng)基、溫度和氧氣等因素的干擾,所以選擇 PBN作為本實驗的自旋捕集劑比較合適,能相對客觀地表現(xiàn)出細(xì)胞受到氧化損傷時,氧化應(yīng)激形成的自由基信號的強(qiáng)弱。本實驗發(fā)現(xiàn)西紅花水提物500μg.mL-1和20μg.mL-1的組細(xì)胞懸液中自由基信號明顯減弱,即模型組與對照組間有顯著性差異(P<0.05),進(jìn)一步揭示了西紅花水提物抗ox-LDL損傷的可能機(jī)制。

[1]黃元慶,魯建華.枸杞總黃酮類化合物抗脂質(zhì)過氧化研究[J].衛(wèi)生研究,1999,28(2):115～116.

[2]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學(xué)[M].第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2002:1202.

[3]伍靜,姚尚龍,楊艷,等.異丙酚對鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的保護(hù)作用[J].中華麻醉學(xué)雜志,2002:112.