彭南妮，薛立群，袁安文，凌理軍，吳珊

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院與動(dòng)物科技學(xué)院，長沙 410128; 2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳 518000)

研究報(bào)告

雄性受體小鼠性腺對移植卵巢卵母細(xì)胞生長發(fā)育的影響

彭南妮1，2，薛立群1，袁安文1，凌理軍1，吳珊1

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院與動(dòng)物科技學(xué)院，長沙 410128; 2.深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，深圳 518000)

目的探索雄性受體性腺對移植卵巢卵母細(xì)胞生長發(fā)育的影響。方法將1日齡小鼠卵巢移植入成年雄鼠腎囊下，將雄性受體小鼠分為性腺摘除組和性腺在位組，于21 d回收移植卵巢，以評(píng)價(jià)雄性小鼠性腺對新生小鼠卵巢移植體卵母細(xì)胞生長發(fā)育的影響。結(jié)果移植后21 d，性腺摘除組和性腺在位組卵巢回收率分別為80.0%和92.9%，移植體生長增大;每個(gè)卵巢平均回收卵母細(xì)胞數(shù)分別為(30.4±4.3)和(42.4±11.1)個(gè)，兩者差異不顯著(P＞0.05);性腺摘除組回收的均為GV期卵母細(xì)胞，性腺在位組大部分為GV期卵母細(xì)胞，有的達(dá)到MII期。結(jié)論雄性受體小鼠能夠支持移植卵巢卵母細(xì)胞的生長發(fā)育，雄性受體的性腺對其影響不明顯。

小鼠;移植;性腺;卵巢;卵母細(xì)胞

卵巢移植被認(rèn)為是延續(xù)和保存雌性生殖能力的一種有效方法，研究表明，在雌性受體中卵巢同體、異體和異種移植能夠存活、排卵和維持性周期［1，2］，并可利用原位移植或體外受精輔助生殖技術(shù)獲得新生后代［3～5］。與此同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)成熟卵巢異性移植可獲得更多的卵泡發(fā)育效果［6，7］;在正常雄性受體中新生仔鼠幼稚型卵巢移植體可以發(fā)育成熟和產(chǎn)生有腔卵泡［8］，并在促性腺激素的刺激下可以誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟［9］。然而，在Cox等［10］的研究中發(fā)現(xiàn)，將16日齡胎兒、3和10日齡新生小鼠卵巢移植到成年雌鼠腎囊下，受體切除或保留自身卵巢，28 d后移植體的卵泡發(fā)育方式在切除卵巢的受體中與原位成鼠卵巢相似;在保留自身卵巢的受體中，胎兒和3日齡新生小鼠卵巢的移植體卵泡發(fā)育未超過早期有腔階段，但10日齡新生小鼠卵巢的移植體卵泡充分發(fā)育，移植后8周形成黃體。這表明在雌性受體中，受體自身卵巢可影響移植卵巢卵泡的發(fā)育。盡管卵巢移植體在雄性受體內(nèi)可以維持卵泡及卵母細(xì)胞的發(fā)育，但雄性受體性腺對卵巢移植體的卵母細(xì)胞發(fā)育是否存在影響尚缺乏足夠的了解。為此，本研究通過比較卵巢卵母細(xì)胞在去性腺受體小鼠和保留性腺受體小鼠中生長發(fā)育能力差異，探索雄性受體性腺對移植卵巢卵母細(xì)胞生長發(fā)育的影響，并為發(fā)展初生期卵巢異性異位移植技術(shù)積累基礎(chǔ)資料，為深入探討影響卵巢及卵母細(xì)胞生長發(fā)育的基本生理因素提供新實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組:昆明小鼠來源于中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部【SCXK(湘)2006—0002】，采用1日齡雌鼠作為卵巢供體，10～12周齡雄鼠作為卵巢移植受體，隨機(jī)將卵巢移植受體分為摘取性腺組(Ⅰ組，5只)和性腺在位組(Ⅱ組，6只)進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)小鼠在自然光照、22～25℃環(huán)境溫度條件下飼養(yǎng);自由飲水、采食，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 主要試劑與儀器:Leibovitz 15(L－15) (Invitrogen)，新生牛血清(NBS)(北京鼎國生物科技有限公司)，L15*:L15+10%NBS+100 IU/mL青霉素+100 IU/mL鏈霉素。體視顯微鏡(Motic，SMZ－168)，顯微照相系統(tǒng)(Motic，Moticam 350)，潔凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司，VS－1300L－U)，倒置顯微鏡(Leica，DMIL)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 供體卵巢采集:斷頸處死1日齡供體雌鼠，體視顯微鏡下摘取卵巢，放入L15*液中，去掉卵巢周圍的包膜，顯微照相，放入L15*液中備用。

1.2.2 腎囊下卵巢移植、受體性腺摘除和移植體回收:腎囊下卵巢移植參照Liu等［11］的方法，受體腹腔注射1%戊巴比妥鈉每只0.25～0.3 m L，進(jìn)行全身麻醉，背部剪毛，沿背中線剪開皮膚，鈍性分離皮下組織，在腹壁剪一小口，暴露左腎臟，用一銳利鑷在腎囊上撕開一個(gè)小口，用自制玻璃吸管吸住卵巢送入腎囊下，移植卵巢2～3枚(Ⅰ組共移植10枚，Ⅱ組共移植14枚)，還納腎臟，縫合切口(圖1)。操作在潔凈工作臺(tái)中體視顯微鏡下進(jìn)行。移植完成后，將實(shí)驗(yàn)I組小鼠的性腺摘除。雄性受體陰囊處用75%的酒精消毒，剪開一小口，稍擠壓腹部，暴露兩側(cè)睪丸。將睪丸和副睪鈍性摘除，在摘除后用青、鏈霉素消毒，縫合切口。以移植當(dāng)天為第0天，于移植后第21天斷頸處死受體，取出卵巢移植腎，對移植卵巢(移植體)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.3 受體的一般狀態(tài)觀察:對受體進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，觀察受體手術(shù)后的活動(dòng)、飲食及切口愈合情況。

1.2.4 移植卵巢形態(tài)學(xué)觀察:觀察1日齡卵巢、移植體的形態(tài)與生長發(fā)育狀況，并在體視顯微鏡下進(jìn)行顯微照相。

1.2.5 卵母細(xì)胞的收集與形態(tài)學(xué)觀察:將移植體從腎囊內(nèi)剝離出來，放入L15*液中，在體視顯微鏡下用4號(hào)針頭刺破有腔卵泡，釋放出卵母細(xì)胞［3］，在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)評(píng)價(jià)、顯微照相，記錄各組收集的卵母細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 受體鼠術(shù)后一般狀態(tài)觀察

在保溫條件下，受體鼠均于施術(shù)1～4 h后逐漸蘇醒，無1例死亡。術(shù)后受體鼠恢復(fù)活動(dòng)，攝食正常，手術(shù)切口無感染，愈合良好。

2.2 卵巢移植體的回收與形態(tài)學(xué)觀察

I組和II組卵巢回收率分別為80.0%(Ⅰ組回收8枚)和92.9%(Ⅱ組回收13枚)，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，組間差異不顯著(P＞0.05)。剛分離的1日齡卵巢呈腎形，淺黃色，富含血管(圖2);移植21 d后，兩組中卵巢移植體均生長增大，呈圓形或腎形，乳白色，表面有網(wǎng)狀血管分布(圖3、4)，有的移植體表面可見透明小點(diǎn)，體視顯微鏡下可辨其為大的有腔卵泡(圖4);卵巢移植體能從移植部位剝離下來(圖5、6)。

2.3 卵母細(xì)胞的回收和形態(tài)學(xué)觀察

I組和II組中每個(gè)卵巢移植體平均回收卵母細(xì)胞數(shù)分別為30.4±4.3和42.4±11.1，經(jīng)t檢驗(yàn)，組間差異不顯著(P＞0.05)。

兩組中，回收卵母細(xì)胞大部分為裸卵，處在GV期，生發(fā)泡(germinal vesicle，GV)明顯(圖7);有的有卵丘細(xì)胞包裹，為卵丘－卵母細(xì)胞復(fù)合體(圖8);在II組中，有少數(shù)移植體可回收到排出第一極體(First polar body，pb1)的卵母細(xì)胞，說明其已經(jīng)完成了第一次成熟分裂，達(dá)到了M II期，為成熟卵母細(xì)胞(圖9)。

3 討論

在本實(shí)驗(yàn)中，去性腺組和性腺保留組受體小鼠的卵巢移植體均生長增大，移植卵巢的回收率達(dá)80.0%以上，說明雄性受體小鼠的生理環(huán)境也能夠很好的支持1日齡卵巢的生長發(fā)育，滿足新生鼠未成熟卵巢發(fā)育的基本需求，提示卵巢移植受體的性別差異因素并不明顯影響未成熟卵巢的發(fā)育及成熟，在兩性分離的動(dòng)物個(gè)體中性別以外的生理因素仍是保證卵巢及卵母細(xì)胞生長發(fā)育的基礎(chǔ)。此外，腎囊下移植部位的特殊性也為卵巢移植體的存活和發(fā)育提供了基本保障。腎臟血管豐富，宜于移植體發(fā)生血管再生;同時(shí)，新生小鼠卵巢的免疫原性低［12］，腎囊下被認(rèn)為是一個(gè)免疫缺陷區(qū)［13］，使移植卵巢能在移植期內(nèi)生長增大，免疫排斥不明顯。

相關(guān)報(bào)道表明，以雌性動(dòng)物為卵巢移植受體時(shí)，移植未成熟卵巢組織的卵泡發(fā)育受供體卵巢的年齡和受體的性腺狀態(tài)影響［10，14，15］。在保留自身卵巢的受體，胎兒和3日齡卵巢的移植體卵泡發(fā)育未超過早期有腔階段，但10日齡卵巢的移植體卵泡充分發(fā)育［10］。然而本實(shí)驗(yàn)未能觀察到雄性受體性腺對新生小鼠卵巢移植體具有顯著阻止腔卵泡發(fā)育的影響。1日齡小鼠卵巢異位移植到去性腺和保留性腺的雄性成年小鼠中，卵泡能從原始卵泡階段發(fā)育到有腔卵泡階段，回收到GV期卵母細(xì)胞，并且平均回收卵母細(xì)胞數(shù)差異不顯著，說明雄性小鼠性腺不對移植卵巢卵泡的生長發(fā)育產(chǎn)生明顯的抑制性影響。因此，在卵巢異性移植中保留雄性受體性腺不僅可以簡化卵巢移植手術(shù)過程，而且能夠保證卵巢移植的成功率。

本實(shí)驗(yàn)中，摘除性腺的雄性受體中未發(fā)現(xiàn)成熟卵母細(xì)胞，而性腺在位的移植體卵巢中有生長發(fā)育到第一極體的卵母細(xì)胞。這可能與雄激素具有促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟的作用有關(guān)。Hammes［16］的研究認(rèn)為睪酮是哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞成熟的促進(jìn)劑，Gill等［17］研究也表明性腺類固醇能夠調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂。

(本文圖1～9見彩插8。)

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Effect of Gonad of M ale Recipient on the Developm ent of A llografted Ovaries and Their Oocytes

PENG Nan－ni1，2，Xue Li－qun1，YUAN An－wen1，LING Li－jun1，WU Shan1
(1.College of Veterinary Medicine and Animal Science＆Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China;

Objective To investigate the effect of gonad of male recipient on development of neonatal ovary allograft and its oocytes.M ethods The ovaries from one－day－old mice were transplanted underneath the kidney capsule of male recipient with or without gonad.The ovarian grafts were collected at 21 days after transplantation and examined by histopathology.ResultsIt was found that the ovarian grafts increased in size，the recovery rate and average number of oocytes collected from each graft in both groups were 92.9%and 80.0%，42.4±11.1 and 30.4±4.3，respectively.The difference was not significant(P＞0.05).The oocytes collected from the grafts in castrated male recipients were at the GV stage，and except a few at metaphase II stage most of the oocytes in intact male recipients developed at GV stage..ConlusionThe results indicate that the grafted ovarian oocytes can develop in male recipient mice and the gonad of male recipient has no significant effects on oocyte development.

Mouse;Transplatation;Gonad;Ovary;Oocytes

Q813.3

A

1005－4847(2010)02－0142－03

2009－08－25

湖南省重點(diǎn)科技項(xiàng)目(編號(hào):01NKY1002－01);湖南省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):2007TP4024)。

彭南妮(1964－)，女，研究方向:生殖醫(yī)學(xué)。E－mail:nnpeng@126.com

袁安文。E－mail:yuananwen@yahoo.com.cn

2.Reproductive Medicine Center of Luo－Hu Hospital Shenzhen，Shenzhen 518000，China)