張 念， 華茉莉， 姜仁吉， 孔德云

(上海醫(yī)藥工業(yè)研究院，上海200040)

紅車(chē)軸草(Trifolium pratense L.)為豆科(Leguminosae)車(chē)軸草屬多年生草本植物，又名紅三葉草(Red Clover)、紅花苜蓿和三葉草等，因植物中含有較為豐富的異黃酮，其提取物已被全球廣泛應(yīng)用于各種保健品或飲食增補(bǔ)劑中，用于預(yù)防乳腺癌、改善骨質(zhì)疏松、婦女更年期綜合癥等［1-5］，許多國(guó)家因此將其納入法定標(biāo)準(zhǔn)，美國(guó)藥典-國(guó)家處方集的飲食增補(bǔ)劑分冊(cè)(Botanical official monographs in USP30-NF25)就收載紅車(chē)軸草植物、植物粉末、植物提取物、片劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。在我國(guó)，紅車(chē)軸草的植物資源十分豐富，南北各地均有野生分布和大面積栽培，每年對(duì)歐美市場(chǎng)出口大量的紅車(chē)軸草提取物，其中多為醇提取物的初級(jí)加工品，同時(shí)我國(guó)外經(jīng)貿(mào)部于2005年頒布實(shí)施的紅車(chē)軸草提取物外貿(mào)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)與國(guó)際現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)存在較大差異，因此對(duì)其開(kāi)展系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，不僅為其工藝改進(jìn)、質(zhì)量升級(jí)提供技術(shù)支撐，也為我國(guó)相關(guān)產(chǎn)品的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制訂提供研究依據(jù)。為此，作者對(duì)紅車(chē)軸草乙醇提取物進(jìn)行了化學(xué)成分的研究，從中分離并鑒定了13個(gè)單體化合物，分別為鷹嘴豆芽素A(Ⅰ)、芒柄花素(Ⅱ)、德鳶尾素 (Ⅲ)、紅車(chē)軸草素(Ⅳ)、染料木素(Ⅴ)、大豆苷元 (Ⅵ)、槲皮素(Ⅶ)、山柰酚(Ⅷ)、芒柄花苷(Ⅸ)、德鳶尾苷(Ⅹ)、三十烷醇(Ⅺ)、熊果酸(Ⅻ)、β-谷甾醇(ⅩⅢ)。通過(guò)文獻(xiàn)查閱，確定化合物Ⅹ、Ⅺ、Ⅻ為首次從該植物中分離得到。

1 儀器與材料

RY-2型熔點(diǎn)測(cè)定儀，天津分析儀器廠;INOVA-400型核磁共振儀，Varian公司;MAT-212磁式質(zhì)譜儀，Waters公司;Q-TOF質(zhì)譜儀，Waters公司;半制備型液相色譜儀(Delta600 Pump，UV2487 Detector)，Waters公司。柱層析硅膠，100～200目，青島海洋化工廠，批號(hào)080601;薄層層析硅膠H，青島海洋化工公司，批號(hào)070910;薄層層析硅膠板，HSGF254，煙臺(tái)芝罘黃務(wù)硅膠開(kāi)發(fā)試驗(yàn)廠，批號(hào)080915;葡聚糖凝膠，SephadexLH-20，Pharmacia公司，批號(hào)SH00001;色譜柱 CAPCELL PAK C18，20 mm I.D. ×250 mm，5 μm;所用化學(xué)試劑，均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司及上海振興化工一廠。

藥材于2007年10購(gòu)自江西，經(jīng)上海醫(yī)藥工業(yè)研究院中藥研究室吳彤副研究員鑒定為豆科植物紅車(chē)軸草(Trifolium pratense L.)，藥材樣品保存于中藥研究室備查。

2 提取與分離

紅車(chē)軸草干燥藥材3 kg，切段，以20倍量80%乙醇回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮得稠浸膏約400 g，所得浸膏以甲醇溶解，濾液加適量硅膠拌樣，進(jìn)行硅膠(100～200目)柱層析，以石油醚、石油醚-乙酸乙酯、乙酸乙酯-甲醇梯度洗脫，薄層色譜檢識(shí)跟蹤合并相同或相似洗脫流份，所得各洗脫部位再經(jīng)薄層層析硅膠柱層析，并結(jié)合SephadexLH-20凝膠柱層析、薄層制備、反相液相制備色譜等方法，分離得到13個(gè)單體化合物，其中包括8個(gè)異黃酮成分和2個(gè)黃酮成分。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物Ⅰ:黃色針狀結(jié)晶(CH3OH)，mp 212～214 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.36(1H，s，H-2)，12.91(1H，s，OH-5)，10.90(1H，s，OH-7)，7.47(2H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′)，6.98(2H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′)，6.37(1H，d，J=2.1 Hz，H-8)，6.20(1H，d，J=2.1 Hz，H-6)，3.77(3H，s，OCH3)。13CNMR(DMSO-d6)δ:154.3(C-2)，122.9(C-3)，180.1(C-4)，161.9(C-5)，99.0(C-6)，164.3(C-7)，93.7(C-8)，157.5(C-9)，104.4(C-10)，122.9(C-1′)，130.1(C-2′)，113.7(C-3′)，159.2(C-4′)，113.7(C-5′)，130.2(C-6′)，55.2(OCH3)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道鷹嘴豆芽素A基本一致［6］，鑒定該化合物為鷹嘴豆芽素 A(Biochnain A)。

化合物Ⅱ:無(wú)色針狀結(jié)晶(CH3OH)，mp 250～252 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:10.79(1H，s，H-7)，8.32(1H，s，H-2)，7.96(1H，d，J=8.7 Hz，H-5)，6.93(1H，dd，J=8.7，2.4 Hz，H-6)，6.85(1H，d，J=2.4 Hz，H-8)，7.50(2H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′)，6.98(2H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′)，3.77(3H，s，OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:153.2(C-2)，124.2(C-3)，174.6(C-4)，127.3(C-5)，115.2(C-6)，162.6(C-7)，102.1(C-8)，157.5(C-9)，116.6(C-10)，123.2(C-1′)，130.1(C-2′)，113.6(C-3′)，158.9(C-4′)，113.6(C-5′)，130.1(C-6′)，55.1(OCH3)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道芒柄花素基本一致［7-10］，鑒定該化合物為芒柄花素(Formononetin)。

化合物Ⅲ:淡黃色針狀晶(CH3OH)，mp 236～237 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.42(1H，s，H-2)，12.92(1H，s，OH-5)，9.61(1H，s，OH-4′)，7.38(2H，d，J=8.0 Hz，H-2′，6′)，6.82(2H，d，J=8.0 Hz，H-3′，5′)，6.87(1H，s，H-8)，6.17(2H，s，OCH2O)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:154.5(C-2)，122.1(C-3)，180.9(C-4)，141.4(C-5)，129.6(C-6)，154.5(C-7)，89.5(C-8)，153.0(C-9)，107.4(C-10)，120.9(C-1′)，130.2(C-2′)，115.1(C-3′)，157.5(C-4′)，115.1(C-5′)，130.0(C-6′)，102.9(-OCH2O-)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道德鳶尾素基本一致［6，11，13］，鑒定該化合物為德鳶尾素(Irilone)。

化合物Ⅳ:無(wú)色針狀結(jié)晶(CH3OH)，mp 272～273 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:5.33(1H，s，H-2)，12.95(1H，s，OH-5)，10.88(1H，s，OH-7)，9.05(1H，s，OH-3′)，7.02(1H，brs，H-6′)，6.95(2H，m，H-2′，5′)，6.36(1H，d，J=1.5 Hz，H-8)，6.21(1H，d，J=1.5 Hz，H-6)，3.80(3H，s，OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:55.7(OCH3)，154.3(C-2)，122.2(C-3)，180.2(C-4)，162.0(C-5)，99.0(C-6)，164.3(C-7)，93.9(C-8)，157.6(C-9)，104.5(C-10)，123.3(C-1′)，116.4(C-2′)，146.1(C-3′)，147.7(C-4′)，112.0(C-5′)，119.8(C-6′)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照［13］，鑒定該化合物為 5，7，3′-三羥基-4′-甲氧基異黃酮，即紅車(chē)軸草素(Prat-ensein)。

化合物Ⅴ:無(wú)色針狀結(jié)晶(CH3OH)，mp 293～295 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.30(1H，s，H-2)，12.94(1H，s，OH-5)，10.86(1H，s，H-7)，9.58(1H，s，H-4′)，7.36(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)、6.80(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.37(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)、6.21(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:153.9(C-2)，121.2(C-3)，180.2(C-4)，162.0(C-5)，99.0(C-6)，164.3(C-7)，93.7(C-8)，157.4(C-9)，104.5(C-10)，122.3(C-l′)，130.2(C-2′)，115.1(C-3′)，157.6(C-4′)，115.1(C-5′)，130.2(C-6′)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道染料木素基本一致［10，12，14，15］，鑒定該化合物為染料木素(Genistein)。

化合物Ⅵ:無(wú)色針狀結(jié)晶(CH3OH)，mp 311～312 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:10.76(1H，s，H-7)，9.51(1H，s，H-4′)，8.27(1H，s，H-2)，7.95(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，6.93(1H，dd，J=8.5，2.0 Hz，H-6)，6.86(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，7.36(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.79(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:152.8(C-2)，122.5(C-3)，174.7(C-4)，127.3(C-5)，115.1(C-6)，162.5(C-7)，102.1(C-8)，157.4(C-9)，116.6(C-10)，123.5(C-l′)，130.1(C-2′)，114.9(C-3′)，157.1(C-4′)，114.9(C-5′)，130.0(C-6′)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道大豆苷元基本一致［14-16］，鑒定該化合物為大豆苷元(Daidzein)。

化合物Ⅶ:黃色粉末(CH3OH)，mp 306～308℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.48(1H，s，OH-5)，10.79(1H，brs，OH-7)，9.59(1H，brs，OH-3)，9.30(2H，brs，H-3′，4′)，6.39(1H，d，J=1.8 Hz，H-8)，6.17(1H，d，J=1.8 Hz，H-6)，7.66(1H，d，J=2.0 Hz，H-2′)，7.53(1H，dd，J=8.5，2.0 Hz，H-6′)，6.87(1H，J=8.5 Hz，H-5′)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其1H-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道槲皮素基本一致［15］，且該化合物與槲皮素對(duì)照品在多種溶劑系統(tǒng)展開(kāi)的薄層色譜，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，故鑒定該化合物為槲皮素(Quercetin)。

化合物Ⅷ:黃色針狀結(jié)晶(CH3OH)，mp 276～278 ℃。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.46(1H，s，OH-5)，10.78(1H，brs，OH-7)、10.10(1H，brs，OH-3)，9.39(1H，brs，OH-4′)，8.02(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.92(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.17(1H，d，J=1.5 Hz，H-6)，6.42(1H，d，J=1.5 Hz，H-8)。13CNMR(DMSO-d6)δ:175.9(C-4)，163.9(C-7)，160.7(C-9)，159.2(C-4′)，156.2(C-5)，146.8(C-2)，135.8(C-3)，129.5(C-2′，6′)，121.7(C-1′)，115.6(C-3′，5′)，103.0(C-10)，98.2(C-6)，93.5(C-8)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道山柰酚基本一致［17］，因而鑒定該化合物為山柰酚(Kaemferol)。

化合物Ⅸ:白色針狀結(jié)晶(CH3OH)，mp 213～216 ℃。ESI-MS(m/z):453［M+Na］+，267［M-Glucose］－。1H-NMR(DMSO-d6)δ:8.44(1H，s，H-2)，8.06(1H，d，J=9 Hz，H-5)，7.25(1H，d，J=2 Hz，H-8)，7.15(1H，dd，J=9.2 Hz，H-6)，7.53(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，7.00(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，5.12(1H，d，J=7.0 Hz，anomeric H)，3.79(3H，s，OCH3)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:174.7(C-4)，161.5(C-7)，159.0(C-4′)，157.1(C-8a)，153.7(C-2)，130.1(C-2′，6′)，126.9(C-5)，124.0(C-1′)，123.4(C-3)，118.5(C-4a)，115.6(C-6)，113.6(C-3′，5′)，103.4(C-8)，99.9(C-1″)，77.2(C-3″)，76.5(C-5″)，73.1(C-2″)，69.6(C-4″)，60.6(C-6″)，55.2(OCH3)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值對(duì)照［8］，鑒定該化合物為芒柄花素-7-O-β-D-葡萄糖 苷 (7-O-β-D-glucosyl-7-hydroxy-4′-methoxyisflavone)，即芒柄花苷(ononin)。

化合物Ⅹ:白色晶體(CH3OH)，mp 188～189℃。ESI-MS(m/z):483［M+Na］+，459［MH］－。1H-NMR(DMSO-d6)δ:12.86(1H，s，OH-5)，8.30(1H，s，H-2)，7.45(2H，d，J=7.2 Hz，H-2′，6′)，7.08(1H，d，J=7.2 Hz，H-3′，5′)，6.72(1H，s，H-8)，6.092(2H，s，OCH2O)，4.88(1H，d，J=7.2 Hz，anomeric H)。13C-NMR(DMSO-d6)δ:180.7(C-4)，157.3(C-4′)，154.8(C-5)，153.9(C-9)，153.1(C-2)，141.5(C-7)，130.1(C-2′，6′)，129.7(C-6)，124.0(C-1′)，121.8(C-3)，116.0(C-3′，5′)，107.6(C-10)，102.8(OCH2O)，100.3(C-1″)，89.4(C-8)，77.1(C-3″)，76.6(C-5″)，73.2(C-2″)，69.7(C-4″)，60.7(C-6″)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)數(shù)值對(duì)照［18］，鑒定該化合物為 5-羥基-6，7-亞甲二氧基異黃酮-4′-O-葡萄糖苷(5-hydroxy-6，7-methylenedioxyisoflavone-4′-glucoside)，即德鳶尾苷(Irilone-4′-glucoside)，為首次從該植物中分離得到。

化合物Ⅺ:白色片狀結(jié)晶(CHCl3)，mp 86.5～87.5 ℃。EI-MS(m/z):420［M+H2O］－，392，363，181，153，139，125，111，83，97，69，57(100)，43。其質(zhì)譜信息經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，并結(jié)合其裂解規(guī)律及相關(guān)文獻(xiàn)［19］，確定該化合物為三十烷醇(Triacontanol)，為首次從該植物中分離得到。

化合物Ⅻ:白色粉末(CH3OH)，mp 277～278℃。ESI-MS(m/z):479［M+Na］+，455［MH］－。1H-NMR(DMSO-d6)δ:11.954(1H，s，-COOH)，5.12(1H，d，J=10 Hz，H-12)，4.29(1H，d，J=4.5 Hz，H-3)，0.66，0.83，0.85，0.86，1.02 提示有5 個(gè)季碳甲基(3H，s)，δ0.79(3H，d，J=6 Hz)，δ0.90(3H，d，J=6 Hz)為叔碳甲基。13C-NMR(DMSO-d6)δ:178.3(COOH)，138.2(C-13)，124.6(C-12)。依據(jù)其理化性質(zhì)及其波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道熊果酸基本一致［20］，且該化合物與熊果酸對(duì)照品在多種溶劑系統(tǒng)展開(kāi)的薄層色譜，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，鑒定該化合物為熊果酸(Ursolic acid)，為首次從該植物中分離得到。

化合物す:白色針晶(CHCl3-CH3OH)，mp 136～138 ℃。EI-MS(m/z):414［M］+，396，381，329，303，273，255，231，213，199，145，95，69，55，43。其質(zhì)譜信息經(jīng)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索與β-谷甾醇吻合，且該化合物與β-谷甾醇對(duì)照品在多種溶劑系統(tǒng)展開(kāi)的薄層色譜，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)，因而鑒定該化合物為β-谷甾醇(β-sitosterol)。

［1］Han K K，Soares J M，Haidar M，et al.Benefits of soy isoflavone therapeutic regimen on Menopausal symptom［J］.Obstet Gynecol，2002，99(3):389-394.

［2］Peterson G，Barnes S.Genistein inhibition of the growth of human breast cancer cells:independence from estrogen receptors and the multi-drug［J］.Biochem Bioph Res Co，1991，179(1):661-667.

［3］Agnusdei D，Zacchei F，Bigazzi S，et al.Metabolic and clinical effects of ipriflavone in established post-menopausal osterporosis［J］.Drugs Exp Clin Res，1989，15(2):97-104.

［4］Yamazaki I，kinoshita M.Calcitonin secreting property of ipriflavone in the presence of estrogen［J］.Life Sci，1986，38(7):1535-1541.

［5］Alekel D L，Germain A S，Peterson C T，et al.Isoflavone-rich soy protein isolate attenuates bone loss in the lumbar spine of permenopausal women［J］.Am J Clin Nutr，2000，72(3):844-852.

［6］黃勝陽(yáng)，屠鵬飛.紅車(chē)軸草異黃酮化合物的分離鑒定［J］.北京大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2004，40(4):544-549.

［7］張培成，毋 艷，于德泉.海南黃檀化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28(6):527-530.

［8］吳 軍，屠鵬飛，趙玉英，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯中異黃酮和紫檀烷類(lèi)化合物的分離和結(jié)構(gòu)鑒定［J］.中草藥，2001，32(7):583-585.

［9］海力茜，張慶英，梁 鴻，等.多序巖黃芪化學(xué)成分研究［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，38(8):592-595.

［10］黃文哲，段金廒，李正亮.懷槐的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，31(1):8-10.

［11］Ali A A，EL-Emary N A，EI-Moghazi M A.Three isoflavonoids from Iris gemanica［J］.Phytochemistry，1983，22(9):2061-2063.

［12］吉文亮，秦民堅(jiān)，王崢濤，等.射干的化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32(3):197-199.

［13］Stevenson P C，Veitch N C.Isoflavones from the roots of Cicer judaicum［J］.Phytochemistry，1996，43(3):695-700.

［14］石 鋮，石任兵，劉 斌，等.銀翹散抗流感病毒有效部位群化學(xué)成分的分離與鑒定［J］.中國(guó)中藥雜志，2003，28(1):43-47.

［15］余冬蕾，楊學(xué)東，郭 劍，等.喬木刺桐化學(xué)成分的研究［J］. 中國(guó)中藥雜志，2000，25(6):353-355.

［16］陸江海，趙玉英，喬 梁，等.醉魚(yú)草化學(xué)成分研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2001，26(1):41-43.

［17］高錦明，張鞍靈.中國(guó)沙棘果實(shí)黃酮成分的研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，14(3):52.

［18］Dhar K L，Kalla A K.A new isoflavones from Iris germanica［J］.Phytochemistry，1973，12(3):734-735.

［19］叢甫珠.質(zhì)譜在天然有機(jī)化學(xué)中的應(yīng)用［M］.北京:科學(xué)出版社.1987:52，755.

［20］段文達(dá)，張 堅(jiān)，謝 剛，等.白花泡桐花的化學(xué)成分研究［J］. 中藥材，2007，30(2):168-170.