王艷華,殷 宏,張德林,付寶權(quán)

弓形蟲抗原表位研究進展*

王艷華,殷 宏,張德林,付寶權(quán)

弓形蟲是一種呈全球分布的專性細胞內(nèi)寄生原蟲,廣泛寄生于人和動物的有核細胞內(nèi),能引起嚴重的人獸共患寄生蟲病。因此,對弓形蟲及弓形蟲病的研究日趨得到學(xué)者們的重視。由于弓形蟲生活史較復(fù)雜,抗原成分多,每種抗原在體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫效應(yīng)不同,實驗證明,單價亞單位疫苗免疫效果和單一抗原診斷試劑檢測效果均不理想,研制多表位疫苗和診斷試劑必然是一個新的發(fā)展趨勢。因此,正確而詳細地了解蛋白質(zhì)表位對疾病的診斷以及設(shè)計疫苗分子結(jié)構(gòu)具有重要理論和現(xiàn)實意義。本文就弓形蟲表位研究進展加以綜述。

1 抗原表位及分類

抗原表位(epitope)又稱抗原決定簇(antigenic determination),是指抗原分子上能刺激機體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細胞并能夠被其識別的一個免疫活性區(qū)。免疫細胞通常難以借助其表面受體識別整個蛋白質(zhì)分子,而僅識別抗原肽分子上的表位,嚴格來說,抗體的特異性是針對表位而不是針對完整的抗原分子的〔1〕。表位一般只占5～7個氨基酸或單糖殘基的大小,最多不超過30個氨基酸殘基。按與抗原受體細胞結(jié)合不同,分為B細胞抗原表位和T細胞抗原表位;按表位結(jié)構(gòu)不同分為連續(xù)性抗原表位和非連續(xù)性抗原表位,前者又稱線型表位,是由肽鏈上順序連續(xù)的氨基酸組成,后者又稱構(gòu)象型抗原表位,是由空間鄰近但順序上不連續(xù)的氨基酸組成〔2〕。線型表位多見于T細胞表位,也可見于B細胞表位,構(gòu)象型表位只見于B細胞表位。

一個蛋白質(zhì)抗原,它不但含有與免疫識別密切相關(guān)的B細胞、T細胞、CT L細胞、NK細胞等表位結(jié)構(gòu),同時還含有一些對于保護性免疫不利的結(jié)構(gòu)。此外,表位間的相對位置、構(gòu)象特征、表位側(cè)翼順序等與表位功能的表達密切相關(guān)。再有MHC限制位(Agretope)、組織位(Histotope)等相關(guān)結(jié)構(gòu)對表位的功能表達亦具有影響。許多研究發(fā)現(xiàn),天然蛋白質(zhì)在引發(fā)免疫反應(yīng)時,不能滿足清除病原體的需要。究其原因,一是因為隱匿的保護性表位功能未能表達,因而所引發(fā)的保護性免疫不夠強大。二是所引發(fā)的免疫反應(yīng)發(fā)生了免疫偏移(Deviation),甚至造成T、B細胞間或T細胞亞群間互相殘殺從而加重感染。因此,對于抗原性的研究不得不從天然抗原整個分子水平向表位水平過渡。另外,就同一表位而言,表位內(nèi)氨基酸殘基對抗原性的貢獻也有不同,表位內(nèi)各氨基酸殘基的組成和順序決定了抗原的特異性〔3〕。

2 弓形蟲抗原表位研究方法

2.1 噬菌體展示技術(shù) 噬菌體展示技術(shù)是Smith等〔4〕于 1985 年創(chuàng)建的 。1988 年 Parmley 等〔5〕提出通過構(gòu)建隨機肽庫可以了解抗體識別的抗原表位的設(shè)想。1990年Scott等〔6〕首次將噬菌體隨機肽庫應(yīng)用于抗原定位,自此,國內(nèi)外學(xué)者進行了大量的相關(guān)研究。

噬菌體展示技術(shù)是研究蛋白抗原表位的強有力工具,利用隨機肽庫中可以同時獲得蛋白抗原線型表位和構(gòu)象型表位,而且這種方法不必預(yù)先確定蛋白質(zhì)的氨基酸序列。其基本原理是將待選基因片段定向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)基因區(qū),使外源多肽或蛋白質(zhì)表達并展示于噬菌體表面,并保持特定的空間構(gòu)象,然后通過特異性親和作用來篩選特異性蛋白或多肽。這項技術(shù)被廣泛應(yīng)用于弓形蟲抗原表位研究,極大地推動了弓形蟲抗原表位的研究進程。

2001年Beghetto等〔7〕首次用孕婦患者血清篩選弓形蟲cDNA λ噬菌體展示文庫,對篩選出來的陽性克隆進行序列分析,發(fā)現(xiàn)與弓形蟲致密顆粒抗原GRAl的序列相一致,利用抗體反應(yīng)實驗證實存在一個24肽優(yōu)勢免疫表位。

2003年Beghetto等〔8〕利用患者血清篩選弓形蟲cDNA λ噬菌體展示文庫,獲得了GRA3、SAG1、GRA1、GRA7、GRA8和 MIC5的B細胞表位。而且,還鑒定了編碼GRA3和MIC3基因的兩個免疫顯性區(qū)。2002年 Robben等〔9〕將弓形蟲基因組DNA＜500bp的短基因片段插入到絲狀噬菌體M13基因Ⅲ區(qū),構(gòu)建了弓形蟲全基因噬菌體文庫,用抗GRA3的單克隆抗體篩庫,得到GRA3的抗原表位。

國內(nèi),2003年吳翔〔10〕等以純化的弓形蟲免疫兔血清IgG篩選噬菌體隨機12肽庫,獲得的27個克隆中有24個能與弓形蟲單克隆抗體及免疫兔血清發(fā)生反應(yīng),混合最強的4個陽性克隆免疫小鼠,1月后用致死量弓形蟲攻擊感染,其存活時間明顯長于對照組。2004年林綺萍等〔11〕用同樣的方法對弓形蟲表位進行了篩選,獲得了弓形蟲抗原的有效模擬表位,對其中的一個陽性克隆插入的肽段進行序列測定,其序列為 5'- CTTCAGT TGGATCGGGCTCCGT TT TGGAAT CAGGGT-3',對應(yīng)氨基酸序列為:LQLDRAPFWNQG,與Gen-Bank的弓形蟲已知序列無一級結(jié)構(gòu)的同源性,對表位的免疫保護效果研究表明獲得的表位能誘導(dǎo)對弓形蟲的部分保護作用。

噬菌體展示技術(shù)憑借著自己獨特的優(yōu)勢,在生物科學(xué)研究和應(yīng)用中的前景已經(jīng)逐漸地顯現(xiàn)出來。其優(yōu)點是:①生產(chǎn)成本低廉。由于不需復(fù)雜費時的后期純化過程,使成本大大降低。②噬菌體顆粒穩(wěn)定性好,非常適用研究和應(yīng)用。③可模擬天然多肽表位結(jié)構(gòu)或功能。④噬菌體作為表位載體在無佐劑的情況下具有較好的免疫原性。

2.2 抗原表位預(yù)測法 采用免疫信息學(xué)方法對抗原表位進行預(yù)測已成為表位定位必不可少的工具,可減少盲目性,提高表位預(yù)測的準確性,大大降低實驗費用,是一種經(jīng)濟而有效的方法。

1994年 Godard等〔12〕利用軟件對 SAG1表位進行預(yù)測,然后合成這些表位(48～67,82～102,213～230,238～256和279～285肽)并對這些表位進行了鑒定。發(fā)現(xiàn)238～256肽存在T細胞表位。在不需要任何載體蛋白的情況下,不管是通過口服還是肌肉注射進行免疫,這種肽均能誘導(dǎo)B細胞和T細胞免疫反應(yīng)。

1996年Saavedra等〔13對弓形蟲 ROP2表位進行預(yù)測,選出一些表位(197～216、393～ 410和501～524肽)人工合成,以弓形蟲ROP2特異性人 T細胞克隆(TCC32)識別合成肽。獲得2個T細胞表位(197～216和501～524肽)。

2007年曹利民等〔14〕應(yīng)用BioSun軟件對6個目前研究較多的弓形蟲主要抗原分子SAG1、SAG2、SAG3、GRA 1、GRA6和P35中的B細胞表位進行了預(yù)測,并從每個分子中選出2個抗原性較高的表位。構(gòu)建了12個原核表達質(zhì)粒,有11個表位基因能有效表達重組融合蛋白;經(jīng)Western blot鑒定,獲得3個弓形蟲B細胞表位,為進一步構(gòu)建弓形蟲復(fù)合表位抗原診斷弓形蟲病奠定了基礎(chǔ)。

2008年張玉英等〔15〕利用生物信息學(xué)軟件對SAG3基因結(jié)構(gòu)和功能進行預(yù)測分析,推測SAG3的氨基酸功能域可能位于65～198位與206～326位之間。

盡管許多預(yù)測表位的免疫信息學(xué)方法已被建立和應(yīng)用,但由于機體內(nèi)免疫應(yīng)答機制的復(fù)雜性,表位預(yù)測還不能完全反應(yīng)體內(nèi)實際情況;而且許多預(yù)測方法存在一定的局限性,有待完善。相信隨著免疫學(xué)、信息學(xué)、分子生物學(xué)各領(lǐng)域的研究人員密切合作,表位預(yù)測的研究將取得突破性進展。

另外,還有些學(xué)者將基因分段進行表達,然后利用單抗或多抗來篩選出能引起陽性反應(yīng)的片段,以獲得抗原表位。

1993年 Murray等〔16〕對弓形蟲 GRA2 C 末端59氨基酸的片段研究發(fā)現(xiàn)它至少存在3個B細胞表位。

1998年 Mevelec等〔17〕對截短的弓形蟲 GRA4抗原性和免疫原性進行了研究,發(fā)現(xiàn)其C末端的11個氨基酸存在一個主要的B細胞表位,第二個B細胞表位識別的頻率較低,位于318～334氨基酸,在N端25～276的氨基酸序列中沒有明顯的B細胞表位存在。

2003年李越希等〔18〕根據(jù)弓形蟲GRA6蛋白和P30蛋白的氨基酸序列,通過計算機分析,篩選出其中較強的抗原表位,用PCR方法分別擴增了內(nèi)含這兩種蛋白抗原表位的基因片段,成功的構(gòu)建含兩者抗原表位的融合蛋白工程菌并進行了表達,ELISA法證實該蛋白有較好的抗原性和特異性,可用作抗原檢測弓形蟲抗體。

3 弓形蟲抗原表位研究的應(yīng)用

3.1 弓形蟲多表位疫苗研究 人工設(shè)計的復(fù)合多表位疫苗可預(yù)防疾病的各個階段或同時預(yù)防多種疾病,因而被認為是將來疫苗發(fā)展的理想方向。在弓形蟲表位疫苗研究方面,國內(nèi)外都進行了大量的研究工作,既有單個表位疫苗功能的研究有又多表位疫苗的研究。

2007年,范久波等〔19〕采用生物信息學(xué)方法對新基因2B9G1、7C3-C3進行表位預(yù)測,PCR擴增編碼3個表位的基因片段,構(gòu)建了單表位、雙表位、多表位疫苗質(zhì)粒,但遺憾的是其保護性如何未見報道。

2008年,譚逵等〔20〕對弓形蟲新基因wx2進行表位分析預(yù)測,制備了新基因的單表位核酸疫苗和雙表位核酸疫苗。結(jié)果3種新基因的表位疫苗均能產(chǎn)生一定的保護效應(yīng),使實驗小鼠的存活時間明顯延長,且雙表位疫苗優(yōu)于單表位疫苗。證實DNA類表位疫苗的研制可作為弓形蟲疫苗研究的策略之一。

2008年叢華等〔21〕將已知的弓形蟲主要抗原SAG1、GRA1 、ROP2和GRA4的表位串聯(lián)起來,制備了多表位核酸疫苗并對其進行了評價。結(jié)果證實該疫苗能引起重要的體液免疫和細胞免疫反應(yīng)并能延長用致死量的 RH株速殖子感染小鼠的存活時間。

史霖等〔22〕構(gòu)建成含 SGA1、GRA1、GRA4 和GRA2多個T、B細胞表位的弓形蟲DNA疫苗。以該多表位DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,可誘導(dǎo)其產(chǎn)生特異性的體液和細胞免疫應(yīng)答,免疫小鼠對致死劑量弓形蟲 RH株速殖子的感染攻擊具有部分抵抗作用,免疫小鼠存活期顯著延長。

多表位疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有很多優(yōu)勢,首先其安全性好,且誘發(fā)的免疫應(yīng)答針對性強。其次,表位疫苗能剔除免疫反應(yīng)中的某些不利因素,如負性調(diào)節(jié)的基因及非特異性成分,以及可以避免完整抗原與宿主同源性而引起的自身免疫反應(yīng)等危害。表位疫苗也可通過選擇適當?shù)拿庖叻绞?能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生很強的細胞免疫,這對細胞內(nèi)寄生的弓形蟲尤其重要。

3.2 弓形蟲多表位診斷試劑研究 由于弓形蟲在人體和動物中寄生呈多階段性,而不同階段蟲體的抗原具有特異性,所以以單一抗原尤其是階段特異性的單一抗原制備的試劑盒,對弓形蟲病進行檢測容易出現(xiàn)漏檢現(xiàn)象。從弓形蟲某些特異性抗原,尤其是不同階段蟲體共有抗原中選出優(yōu)勢抗原表位,將它們串聯(lián)起來進行表達,獲得基因重組多表位抗原,用其作為診斷抗原檢測弓形蟲病理論上有望克服漏檢現(xiàn)象。國內(nèi)外學(xué)者對多表位抗原在弓形蟲免疫檢測中的應(yīng)用前景進行了探討。

2003 年 Beghetto 等〔23〕用含有 GRA3、SAG1、GRA1和GRA7表位的重組抗原建立了弓形蟲IgG抗體親和力試驗,可以區(qū)分孕期弓形蟲急性和隱性感染。

國內(nèi),楊培梁等〔24-25〕用含 SAG1、ROP2、GRA2抗原表位重組可溶性抗原建立ELISA方法,對兔和小鼠的急慢性弓形蟲感染血清進行了檢測。結(jié)果檢測的141份小鼠血清,其中慢性感染弓形蟲小鼠血清117份、正常小鼠血清24份,檢測體系的敏感性為88.88%,特異性為91.67%,一致性為89.36%。檢測的24份兔血清,其中急性感染弓形蟲兔血清18份,正常兔血清6份,陽性血清檢出率為94.4%,總一致性為91.5%。證明以弓形蟲多表位重組抗原構(gòu)建的ELISA試劑盒既可以檢測弓形蟲急性感染血清,又可以檢測弓形蟲慢性感染血清,具有一定的應(yīng)用前景。

4 小 結(jié)

多表位抗原在對抗原成分選擇上具有多樣性,在具體操作上也因各種先進的分子生物學(xué)手段和完善的基因工程技術(shù)而具有可行性。但截止到目前,盡管已設(shè)計出了一些多表位肽疫苗和診斷試劑,但仍存在一些問題需要解決:①多肽單獨應(yīng)用其免疫原性較差,可能是因為外源多肽在體內(nèi)降解較快。②抗原表位的選擇,怎樣才能選擇出能使機體獲得最佳免疫保護或適用于檢測急、慢性診斷試劑的抗原表位,目前缺乏實驗和理論依據(jù)。③免疫佐劑的使用,特別是新型免疫佐劑如CpG和QS21如何與抗原表位聯(lián)合應(yīng)用才能取得最佳效果,尚待進一步研究。④對于CD1呈遞和直接呈遞尚缺乏尋找表位的方法。⑤缺乏合理弓形蟲疫苗評估方法。在自然條件下多是以緩殖子、包囊和卵囊的形式感染宿主,引起宿主的慢性感染。而選用強毒株速殖子進行攻擊感染,常常引起的是實驗動物的急性感染死亡,因而不能全面客觀評估疫苗的保護性。另外,攻擊劑量也值得進一步進行研究。

〔1〕周光炎.免疫學(xué)原理〔M〕.上海:上?？萍汲霭娑?2000:36-37.

〔2〕Barlow DJ,Edwards MS,Thornton JM.Continuous and discontinuous protein antigenic determinants〔J〕.Nature,1986,322(6081):747.

〔3〕吳玉章,朱錫華.對表位生物學(xué)研究的認識和體會〔J〕.上海免疫學(xué)雜志,1998,18(1):1-2.

〔4〕 Smith GP.Filamentous fusion phage:novel ex pression vectors that display cloned antigens on the virion surface〔J〕.Science,1985,228(2):1315-1317.

〔5〕Parmley SF,Smith GP.Antibody-selectable filamentous fd phage vectors:affinity purification of target genes〔J〕.Gene,1988,73:305-318.

〔6〕Scott J K,Smith G P.Searching for peptide ligands with an epitope library〔J〕.Science,1990,249(1):386-390.

〔7〕Beghetto E,Pucci A,Minenkova O,et al.Identification of a human immunodominant B-cell epitope within the GRA1 antigen ofToxoplasma gondiiby phage display of cDNA libraries〔 J〕.International Journal for Parasitology,2001,31(14):1659-68.

〔8〕Beghetto E,Spadoni A,Buffolano W,et al.Molecular dissection of the human B-cell response againstToxoplasma gondiiinfection by lambda display of cDNA libraries〔J〕.Int J Parasitol,2003,33(2):163-173.

〔9〕Robben J,Hertveldt K,Bosmans E,et al.Selection and identification of dense granule antigen G RA3 byToxoplasma gondiiwhole genome phage display 〔J〕.J Biol Chem,2002,277(20):17544-17547.

〔10〕吳翔,蔣立平,蔡力汀,等.隨機肽庫篩選弓形蟲特異性抗原表位誘導(dǎo)保護性免疫的研究〔J〕.中國人獸共患病雜志,2003,19(4):42-44.

〔11〕林綺萍,吳少庭,翁亞彪,等.等弓形蟲有效抗原表位的篩選及其對小鼠免疫保護性的研究〔J〕.中國熱帶醫(yī)學(xué),2004,4(5):685-688.

〔12〕 Godard I,Estaquier J,Zenner L,et al.Antigenicity and immunogenicity of P30-derived peptides in experimental models of toxoplasmosis〔 J〕.Molecular immunology,1994,31(17):1353-1363.

〔13〕Saavedra R,Becerril M A,Dubeaux C,et al.Epitopes recognized by human T lymphocy tes in the Rop2 protein antigen ofToxoplasma gondii〔J〕.InfectImmun,1996,64(9):3858-3862.

〔14〕曹利民.潘宇紅.盧志賢,等.剛地弓形蟲主要抗原B細胞表位的篩選及鑒定〔J〕.國際醫(yī)學(xué)寄生蟲病雜志,2007,19(1):24-27.

〔15〕張玉英,賀新紅,陳莎麗,等.弓形蟲SA G3基因克隆及生物信息學(xué)分析〔J〕.中國病原生物學(xué)雜志.2008.3(6):428-430.

〔16〕Murray A,M ercier C,Decoster A,et al.Multiple B-cell epitopes in a recombinant GRA2 secreted antigen ofToxoplasma gondii〔J〕 .Applied Parasitology,1993,34(4):235-244.

〔17〕Mevelec MN,Mercereau-Puijalon O,Buzoni-Gatel D,et al.Mapping of B epitopes in GRA4,a dense granule antigen ofToxoplasma gondiiand protection studies using recombinant proteins administered by the oral route〔J〕.Parasite Immunol,1998,20(4):183-195.

〔18〕李越希,張錦海,陶開華,等,弓形蟲GRA6蛋白和P30蛋白的融合表達、純及抗原性分析〔J〕.生物工程學(xué)報,2003,19(6):34-39.

〔19〕范久波,吳翔,譚逵,等.弓形蟲新基因表位疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定〔J〕.中國病原生物學(xué)雜志,2007,2(2):118-121.

〔20〕譚逵,張瓊,范久波,等,弓形蟲新基因wx2表位疫苗免疫小鼠的保護研究〔J〕.生物化學(xué)與生物物理進展,2008,53(9):1051-1058.

〔21〕Cong H,Gu Q M,Yin H E,et al.Multi-epitope DNA vaccine linked to the A2/B subunit of cholera toxin protect mice againstToxoplasma gondii〔J〕.Vaccine,2008,26:3913-3921.

〔22〕史霖,劉珊,程雁斌,等.弓形蟲多表位 DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫保護作用〔J〕.細胞與分子免疫學(xué)雜志,2008,24(7):689-691.

〔23〕 Beghetto E,Buffolano W,Spadoni A,et al.Use of an immunoglobulin G avidity assay based on recombinant antigens for diagnosis of primaryToxoplasma gondiiinfection during pregnancy 〔J〕.J Clin Microbiol,2003,41(12):5414-5418.

〔24〕楊培梁,陳曉光.弓形蟲多表位基因的構(gòu)建及其在大腸桿菌系統(tǒng)中的表達鑒定〔J〕.中國人獸共患病雜志,2002,18(2):37-40.

〔25〕楊培梁,李華,周曉紅,等.弓形蟲多表位基因重組抗原在弓形蟲免疫檢測中的應(yīng)用〔J〕.熱帶醫(yī)學(xué)雜志,2007,7(9):853-855.

R531.8

A

1002-2694(2010)01-0084-04

*國家科技支撐計劃項目(2007BAD40B05)

張德林,Email:zhangdl2005@163.com

1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所,家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室,農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點開放實驗室,甘肅省動物寄生蟲病重點實驗室,蘭州730046

2009-06-11;

2009-11-07