劉 芳,朱建國(guó),華修國(guó),高 謙,嚴(yán)懿嘉

牛分枝桿菌Mb2277蛋白的表達(dá)及其反應(yīng)原性初步研究＊

劉 芳1,朱建國(guó)1,華修國(guó)1,高 謙2,嚴(yán)懿嘉1

目的 構(gòu)建牛分枝桿菌M b2277基因的原核表達(dá)載體,獲得高純度的融合表達(dá)蛋白,并對(duì)其表達(dá)產(chǎn)物的免疫原性進(jìn)行初步研究。方法根據(jù)GenBank提供的M.bovis M b2277基因序列設(shè)計(jì)引物。以牛分枝桿菌(93006)DNA為模板,通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出M b2277基因片段,以Bam HⅠ和 Eco RⅠ雙酶切PCR產(chǎn)物和p ET28a(+),后將純化的M b2277基因克隆至p ET28a(+)中,構(gòu)建出原核表達(dá)質(zhì)粒,再轉(zhuǎn)化到 E.coli BL21(DE3)表達(dá)菌株中,IPTG誘導(dǎo)后,收集菌體進(jìn)行 SDS-PAGE,進(jìn)一步利用Western Blot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的反應(yīng)原性進(jìn)行研究。結(jié)果獲得了牛結(jié)核分枝桿菌M b2277原核表達(dá)質(zhì)粒,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,SDS-PAGE分析可見(jiàn)約25ku蛋白表達(dá)條帶,Western Blot結(jié)果顯示,表達(dá)產(chǎn)物與兔抗分枝桿菌抗體具有反應(yīng)性。結(jié)論該蛋白具有較強(qiáng)的反應(yīng)原性。

牛分枝桿菌;分泌蛋白;M b2277基因

牛結(jié)核病主要是由牛分枝桿菌(M ycobacterium bovis,M TB)引起的一種人獸共患傳染病,它嚴(yán)重危害人類(lèi)的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展并且導(dǎo)致很大的經(jīng)濟(jì)損失〔1-2〕。牛結(jié)核病的防制主要是采用牛結(jié)核菌素PPD進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)診斷,然后對(duì)診斷出的陽(yáng)性牛進(jìn)行隔離或捕殺,以達(dá)到消滅該病的目的。但是,應(yīng)用該防制措施并未達(dá)到控制該病的目的,反而近年來(lái)呈上升趨勢(shì)〔3〕,主要是由于缺乏快速準(zhǔn)確的診斷方法。近10年來(lái),人們對(duì)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)濾液中的分泌蛋白進(jìn)行了廣泛的研究,發(fā)現(xiàn)一些分泌蛋白不但是具有保護(hù)性功能的重要抗原,更是能用于研制診斷方法的候選選靶分子〔5〕。Rosenk rands〔5〕等運(yùn)用雙向電泳對(duì)結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)M b2277存在于培養(yǎng)濾液中,證明該蛋白也是一種分泌蛋白。因此,本文對(duì)牛分枝桿菌M b2277基因進(jìn)行克隆,構(gòu)建其原核表達(dá)質(zhì)粒及在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),進(jìn)一步分析其免疫原性,為研究新型疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 菌株和質(zhì)粒 牛分枝桿菌 Mycobacterium bovis標(biāo)準(zhǔn)菌株(93006)由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所惠贈(zèng)。大腸桿菌BL 21、p ET28a(+)質(zhì)粒由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海寄生蟲(chóng)研究所苑純秀博士惠贈(zèng)。

1.2 陽(yáng)性血清 牛分枝桿菌接種于Sauton培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)14 d后,65℃滅活30 min,將培養(yǎng)濾液用PEG6000濃縮后,分3次免疫家兔,心臟采血收集血清。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試劑 PCR試劑、限制性?xún)?nèi)切酶 H in dⅢ、Bam HⅠ、T4 DNA 連接酶、DNA M arker DL 2000、DL 15000為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品;質(zhì)粒小量回收試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔的抗體購(gòu)自上海鼎國(guó)生物有限公司;X放射自顯影中的發(fā)光劑,顯色劑購(gòu)于 Pierce公司;其余常用化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.4主要儀器 Bio-Rad水平電泳儀(Laboratories);轉(zhuǎn)移電泳槽(上?？颠_(dá)電子儀器廠生產(chǎn))。

2 方 法

2.1 DNA的提取

2.1.1 M.bovis DNA的提取 將 M.bovis接種于Sauton培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)4周后,100℃滅活10 min。按照革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌基因組DNA小量快速提取試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA的提取。

2.1.2 質(zhì)粒DNA的提取 本實(shí)驗(yàn)中所有質(zhì)粒均按照質(zhì)粒小量回收試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取。2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) GenBank提供的 M.bovis M b2277基因序列,采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)如下2對(duì)引物,在上、下游引物的5’和3’端分別加上 Bam HⅠ和 H indⅢ酶切位點(diǎn)。P1:5’-A TGTCCGGTCACCGCAAG-3’;P2:5’-TCAGCCAACGA TCGGTTTG-3’引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成。

2.3 目的基因M b2277PCR擴(kuò)增及純化 以牛分枝桿菌DNA為模板,以P1、P2為引物,對(duì)M b2277基因進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:94℃5 m in;94℃1 min,60℃1 min,72℃1 min,共 30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃終止反應(yīng)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析,并按照DNA膠回收純化試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行回收。同時(shí)將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.4 重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 用限制性?xún)?nèi)切酶Bam HⅠ和 H in dⅢ對(duì) PCR產(chǎn)物和p ET28a(+)進(jìn)行雙酶切,反應(yīng)溫度均為37℃,2 h。酶切完畢后,將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,然后回收酶切片斷,將目的片斷M b2277和載體p ET28a(+)進(jìn)行連接,16℃連接過(guò)夜,構(gòu)建重組質(zhì)粒。將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至 E.coli BL 21感受態(tài)細(xì)胞,加800μL LB培養(yǎng)基,搖床上溫育1 h,將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Kan-LB平板培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)過(guò)夜。調(diào)取克隆接種至含有100μg/m L Kan-LB液體培養(yǎng)基中,振蕩培養(yǎng)10 h,按試劑盒說(shuō)明提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定,陽(yáng)性者送至上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2.5 M b2277基因的誘導(dǎo)表達(dá) 將測(cè)序證實(shí)的單菌落接入2m L kan-LB(Kan終濃度為50μg/mL)培養(yǎng)基中,37℃振搖培養(yǎng)過(guò)夜。離心收集細(xì)胞,將細(xì)胞重懸于2mL kan-LB中,以此接種入50m L培養(yǎng)基,37℃搖床培養(yǎng)至 OD600nm值至 0.6;將培養(yǎng)物分成2份,其中一份加入 IPTG至終濃度1 mmol/L,另一份不加IPTG作為對(duì)照,繼續(xù)培養(yǎng)。分別于誘導(dǎo)0、2、4、6、8、10 h各取1m L 菌液 ,1 2000 r/min離心10 m in,棄上清,后分別加入100μL 1×上樣緩沖液,重懸菌體后于99℃煮沸10 min,離心5 min后進(jìn)行SDS-PA GE分析。

2.6 蛋白質(zhì)印跡分析 表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)12%SDSPAGE分析后,按文獻(xiàn)〔6〕所述方法,以B IO-RAD 系統(tǒng)電轉(zhuǎn)至PVDF膜上進(jìn)行免疫染色,經(jīng)小牛血清白蛋白封閉后,依次加入牛分枝桿菌分泌上清免疫家兔獲得的陽(yáng)性血清的稀釋液(1∶100),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔的抗體的稀釋液(1∶1 000),最后X放射自顯影。

3 結(jié) 果

3.1 MB2277基因擴(kuò)增 以牛分枝桿菌基因組DNA為模板,用合成的引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析,可見(jiàn)504bp的DNA片段(圖略),與實(shí)驗(yàn)預(yù)期的M b2277 DNA片段大小相一致。

3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建和序列分析 PCR產(chǎn)物與p ET28a(+)連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒。經(jīng)B am HⅠ和H in dⅢ雙酶切后,可見(jiàn)質(zhì)粒片斷和504 bp的插入片段(圖略)。序列分析證實(shí),該DNA片斷大小為504 bp,與 GenBank中登陸的牛分枝桿菌AF2122/97的 M b2277基因序列一致,同源性為99%。

3.3 原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和酶切鑒定 重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切,轉(zhuǎn)化至BL 21,通過(guò)雙酶切得到質(zhì)粒片斷和504bp的插入片段,成功構(gòu)建出原核表達(dá)質(zhì)粒。

3.4 M b2277基因的誘導(dǎo)表達(dá) 經(jīng) IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒在 E.coli BL 21中,在分子量約為25 ku處有明顯條帶,與預(yù)測(cè)的融合蛋白分子量一致,在誘導(dǎo)6 h出現(xiàn)了最大表達(dá)量(圖略)。

3.5 蛋白質(zhì)印跡分析 從圖中可見(jiàn)25ku處有一條明顯的蛋白印跡帶,由此說(shuō)明該表達(dá)產(chǎn)物具有牛分枝桿菌抗原性(圖2)。

4 討 論

本研究以牛分枝桿菌染色體DNA為模板,PCR擴(kuò)增,經(jīng)克隆、序列分析和雙酶切鑒定,獲得了M.bovis分泌蛋白M b2277原核表達(dá)菌株,IPTG誘導(dǎo)表達(dá),實(shí)現(xiàn)了M b2277蛋白在體外安全、高效的表達(dá)。利用牛分枝桿菌陽(yáng)性血清對(duì)其進(jìn)行Western blotting檢測(cè),結(jié)果表明牛分枝桿菌M b2277蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性。

我們也曾用結(jié)核病人的血清進(jìn)行 Western blotting,在25ku處也出現(xiàn)陽(yáng)性條帶,進(jìn)一步證明了M b2277蛋白較強(qiáng)的免疫原性,提示其也具有用于人結(jié)核的檢測(cè)的可能性。關(guān)于牛分枝桿菌M b2277蛋白基因的克隆及其在大腸桿菌中的表達(dá)研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到報(bào)道。因此,本研究為進(jìn)一步研究牛分枝桿菌M b2277基因工程亞單位疫苗及核酸疫苗奠定了基礎(chǔ)。

〔1〕劉思國(guó),于輝,宮強(qiáng),等.牛結(jié)核病研究進(jìn)展〔J〕.畜牧獸醫(yī)科技信息,2003,10:10-14.

〔2〕John BK,CharlesO T Tuberculosis〔J〕.Zoonosis Update,2004,224:685-691.

〔3〕Andersen PD,Askgaard,Gottschau A,et al,Identification of immunodominan antigens during infection with Mycobacterium tuberculosis〔J〕.Scand J Immunol,1992,36:823-831.

〔4〕Ida Rosenkrands,Karin Weldingh,Susanne Jacobsen,et al.M apping and identification of Mycobacterium tuberculosis proteins by two-dimensional gelelectro phoresis,microsequencing and immuno detection〔J〕.Electrophoresis,2000,21:935-948.

〔5〕Ida Rosenkrands,Angus King,Karin Weldingh,et al.Towards the p roteome of M ycobacterium tuberculosis〔J〕.Electrophoresis,2000,21,3740-3756.

〔6〕薩姆布魯克J,拉塞爾D W.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南〔M〕.3版.北京:科學(xué)出版社,2002:886-898.

Expression of M b2277 of M.bovis and in itial research on its reactogen icity

L IU Fang,ZHU Jian-guo,HUA Xiu-guo,GAO QianAN Yi-jia

(Shanghai Jiaotong University College of A griculture and Biological,Shanghai 200240,China)

To obtain fusion protein of Mycobacterium bovis with high purity,the recombinant p rokaryotic expression vector for M b2277 gene was constructed and the immunogenicity of its products was initially investigated in the p resent study.A pair of p rimer was designed acco rding the gene sequence M b2277 from the genomic DNA of M.Bovis in GenBank.and was amp lified by PCR using DNA of M.Bovi s 93006 strain as temp late.The PCR product and p ET-28a(+)was then digested by Bam HⅠand EcoRⅠdouble enzyme.To constructed a p rokaryotic expression plasmid,the purified M b2277 was cloned to p ET28a(+).Then the recombinant plasmid was transformed into competent cell of E.coli BL 21(DE3).The bacteria were induced by IPTGand its lysates were analyzed by SDS-PAGEand Western-blotting.In this way,the prokaryotic expression plasmid for M.bovis M b 2277 protin was obtained,and a expression band with molecular of 25 ku could be found in SDS-PAGE analysis.As demonstrated by Western blotting this expression product showed excellent reactivity with rabbit immune sera against M.bovis.

M ycobacterium bovis;secretion proteinum;M b2277

R378

A

1002-2694(2010)01-0033-03

＊上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(04ZR14089)及上海市西部合作項(xiàng)目(055458023)

朱建國(guó),Email:zhu_jg@sjtu.edu.cn

1.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240;

2.復(fù)旦大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,上海 200032

2009-05-26;

2009-10-15