高正琴,張 強(qiáng),賀爭鳴,岳秉飛,葉 強(qiáng)

中國小型豬細(xì)菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)＊

高正琴,張 強(qiáng),賀爭鳴,岳秉飛,葉 強(qiáng)

目的 對小型豬攜帶的細(xì)菌種群分布情況及耐藥性進(jìn)行調(diào)查分析。方法對小型豬采樣進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)、生化鑒定和細(xì)菌16S rRNA基因PCR擴(kuò)增、測序分析,并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果從25只小型豬中共分離到45株細(xì)菌。結(jié)果顯示,小型豬攜帶的細(xì)菌種群主要有彎曲菌屬(空腸彎曲菌)、螺桿菌屬(幽門螺桿菌)、克雷伯菌屬(肺炎克雷伯氏菌);腸桿菌屬(陰溝腸桿菌);埃希菌屬(大腸埃希菌、弗格森埃希菌);假單胞菌屬(銅綠假單胞菌);窄食單胞菌屬(嗜麥芽窄食單胞菌);葡萄球菌屬(金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、模仿葡萄球菌);鏈球菌屬(肺炎鏈球菌、豬鏈球菌、前庭鏈球菌、緩癥鏈球菌、麻疹孿生球菌、綠色氣球菌);腸球菌屬(糞腸球菌);芽孢桿菌屬(枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蜂房芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌)。這些菌株對氨曲南、頭孢噻吩等藥物敏感,而對痢特靈等藥物不敏感。結(jié)論小型豬攜帶的細(xì)菌種群具有多樣性,研究結(jié)果為我國小型豬細(xì)菌學(xué)檢測以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了科學(xué)依據(jù)。

小型豬;細(xì)菌分離;鑒定;16S rRNA

小型豬(M iniature pig)屬于哺乳綱、偶蹄目、野豬科、豬屬。五指山小型豬是我國培育比較早的小型豬之一,遺傳檢測結(jié)果顯示,理論群體近交系數(shù)高達(dá)0.95以上,遺傳穩(wěn)定,未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重的遺傳分離現(xiàn)象。巴馬小型豬具有體型矮小、性成熟早、多產(chǎn)、品系內(nèi)個(gè)體間具有較好的遺傳一致性和遺傳穩(wěn)定性。貴州小型香豬是我國較早正式報(bào)道的小型豬之一,在組織解剖和白化突變體等方面做了大量的研究工作。

小型豬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在科學(xué)研究領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用價(jià)值。利用小型豬復(fù)制的人類疾病模型已用于腫瘤、心血管病、糖尿病、外科、牙科、皮膚燒傷、血液病、遺傳病、營養(yǎng)代謝病的研究之中,并在新藥安全評價(jià)中得到應(yīng)用。小型豬作為人類器官移植的供體,有望在一定程度上解決人源器官緊缺的狀況。另外,豬的組織、細(xì)胞或其他成分作為人用生物制品的生產(chǎn)基質(zhì),已開發(fā)出多種人用生物制品和功能食品等生物技術(shù)產(chǎn)品〔1-3〕。

國外用于醫(yī)學(xué)研究和相關(guān)制品生產(chǎn)用的商品化小型豬普遍達(dá)到了SPF(無特定病原體)的水平,排除了可能干擾小型豬實(shí)驗(yàn)結(jié)果的病原體,極大的提高了小型豬的微生物學(xué)質(zhì)量,保證了相關(guān)研究的水平和產(chǎn)品質(zhì)量,而我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)中至今還沒有小型豬的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),使得小型豬在生命科學(xué)研究中凸現(xiàn)應(yīng)用不足,獨(dú)特優(yōu)勢不突出,應(yīng)用特點(diǎn)不明顯,這一狀況既影響到實(shí)驗(yàn)用小型豬的質(zhì)量提升,限制了比較醫(yī)學(xué)資料的形成,同時(shí)也影響了小型豬的推廣應(yīng)用〔4〕。

本研究目的是為了了解目前我國培育的實(shí)驗(yàn)用小型豬的微生物攜帶情況,為小型豬的生物凈化、種群建立、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及動(dòng)物模型的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物來源 本研究中的小型豬來自“國家實(shí)驗(yàn)用小型豬種質(zhì)資源基地”,其中:五指山小型豬和廣西巴馬小型豬種群規(guī)模均為200頭,飼養(yǎng)與于屏障系統(tǒng)和普通環(huán)境中,各剖殺10頭;貴州小型香豬飼養(yǎng)于普通環(huán)境中,剖殺5頭。所剖殺的小型豬性別和年齡見表1。

1.2 培養(yǎng)基和試劑 血瓊脂、SP瓊脂、DHL瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、M H瓊脂、腦心浸液、M H肉湯、葡萄糖、硝酸鹽、尿素等生化反應(yīng)培養(yǎng)基,由本所培養(yǎng)基室提供。哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)、2號營養(yǎng)肉湯為英國Oxoid公司產(chǎn)品。微厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)由日本三菱瓦斯化學(xué)株式會社提供。藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司。DNA提取試劑盒、dN TPs,Ta KaRa EX Taq、DNA純化試劑盒為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng) 活體采集小型豬鼻拭子樣本,投入裝有1 m L腦心浸液的小試管內(nèi),再接種支原體半流體培養(yǎng)基,置37℃培養(yǎng)14 d。取肛拭子樣本,劃線接種哥倫比亞血瓊脂(已加相關(guān)抗生素,為選擇性培養(yǎng)基),置37℃微需氧(85%N2,10%CO2,5%O2)培養(yǎng) 5 d。

活體采集小型豬心臟全血,取2 m L全血,注入裝有5m L 2號營養(yǎng)肉湯的中試管內(nèi)(液面以液體石蠟封閉,已加相關(guān)抗生素和促生長劑,為選擇性培養(yǎng)基),置37℃微需氧培養(yǎng)5 d,如有疑似菌落生長,再轉(zhuǎn)種哥倫比亞血瓊脂。5 m L全血經(jīng)抗凝處理后,用作小型豬血液學(xué)生理生化指標(biāo)的測定。8 m L全血,離心分離血清,用作者研制的空腸彎曲菌、幽門螺桿菌IFA和EL ISA抗體檢測試劑盒進(jìn)行血清抗體檢測,并分別用國內(nèi)外3個(gè)廠家(1個(gè)國外,2個(gè)國內(nèi))提供的3個(gè)不同批次的9種病毒(豬瘟、口蹄疫、圓環(huán)、細(xì)小、偽狂犬、藍(lán)耳、乙腦、胃腸炎、水皰)和弓形體的EL ISA抗體檢測試劑盒進(jìn)行血清抗體檢測(另文發(fā)表)。

將小型豬麻醉放血完全后剖解,采集其氣管、扁桃體、淋巴結(jié)、心、肺、肝、脾、胃、腎、腸、腦組織和回盲部內(nèi)容物樣本,用作細(xì)菌、病毒和寄生蟲的分離、鑒定。取氣管、淋巴結(jié)、肺、胃、腸組織樣本,分別劃線接種血瓊脂培養(yǎng)基、SP瓊脂、DHL瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂,置37℃恒溫培養(yǎng)48 h。取氣管、肺組織樣本,接種支原體培養(yǎng)基,置37℃培養(yǎng)14 d。取胃、腸組織樣本,劃線接種哥倫比亞血瓊脂,置37℃微需氧培養(yǎng)5 d。

根據(jù)平板上的菌落生長的形態(tài)、大小、顏色、氣味、溶血性等進(jìn)行分類,對每一類典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢,初步區(qū)分革蘭氏陰性和陽性菌。再根據(jù)革蘭氏染色特性和菌體形態(tài),初步判定細(xì)菌類屬,并將其進(jìn)一步純化培養(yǎng),準(zhǔn)備生化鑒定。

1.4 生化鑒定 將分離純化得到的幾十株細(xì)菌大致分類:革蘭氏陽性球菌、革蘭氏陽性芽孢桿菌、革蘭氏陰性桿菌。將這些菌株分別接種腦心浸液,增菌培養(yǎng)24 h后,接種生化試驗(yàn)用反應(yīng)管,置于37℃恒溫培養(yǎng)24～48 h,觀察記錄結(jié)果,參考文獻(xiàn)判定細(xì)菌種類〔5-6〕。

用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀BBB128 Phoenix100(美國)進(jìn)行細(xì)菌種屬的確認(rèn)。

1.5 分子生物學(xué)鑒定 分離純化細(xì)菌后,抽提基因組DNA,利用細(xì)菌通用引物 (上游引物:5’-AGAGTTGA TCCTGGCTCAG-3’;下游引物:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’),擴(kuò) 增 16S rRNA基因片段,預(yù)期擴(kuò)增的目的片段長度為1 506 bp〔7〕。

經(jīng)優(yōu)化后得到16S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)體系如下:5μL 10×EX Taq Buffer(M g2+Plus),4μL dN TP M ixture(各 2.5 mmol/L),1μL上游引物(20μmo l/L),1μL下游引物(20 μmol/L),5.0μL模板DNA,0.25μL TaKaRa EX Taq(5 U/μL),33.75μL dd H2O。

PCR反應(yīng)參數(shù)為94℃預(yù)變性30 s;94℃30 s,55℃30 s,72℃1 m in,共30次循環(huán);最后一次循環(huán)后72℃再延伸1 min。

反應(yīng)結(jié)束后,取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物,用1%(w/v)瓊脂糖凝膠(含0.5μg/m L EB)電泳檢測 PCR產(chǎn)物。在紫外燈下觀察,用數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。將陽性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后送寶生物工程(大連)有限公司測序。

對于微需氧菌(疑似空腸彎曲菌或幽門螺桿菌的分離菌株),則用作者制備的空腸彎曲菌、幽門螺桿菌抗血清與分離菌株進(jìn)行血清凝集試驗(yàn),進(jìn)行相關(guān)生化鑒定后,再抽提細(xì)菌基因組DNA,用細(xì)菌通用引物和特異性引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增及序列測定〔8-9〕,并與 GenBank中參考菌株相關(guān)基因核苷酸序列進(jìn)行同源性比較分析(另文發(fā)表)。

1.6 藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)根據(jù)WHO推薦的 K-B瓊脂法進(jìn)行。將0.5麥?zhǔn)蠁挝坏募兓鷳乙河脺缇奘米泳鶆蛲坎加? mm厚的M H藥敏平板上,37℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察有無抑菌環(huán)或抑菌圈(直徑mm),抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細(xì)菌明顯生長為準(zhǔn)。按美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)判定為敏感、中敏或耐藥。試驗(yàn)所選擇藥物包括下列30種抗菌藥物:青霉素 G、氨芐西林、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、頭孢唑林、頭孢西丁、頭孢噻吩、氨曲南、妥布霉素、阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、克林霉素、苯唑西林、萘啶酸、萬古霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明、磷霉素、氯霉素、多粘菌素B、利福平、利福平、卡那霉素、桿菌肽、痢特靈、交沙霉素。藥敏試驗(yàn)的結(jié)果參考文獻(xiàn)進(jìn)行判定〔10〕。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果 本研究從25只小型豬中共分離鑒定出45株細(xì)菌(表2),其中:空腸彎曲菌2株、幽門螺桿菌2株;肺炎克雷伯氏菌2株;陰溝腸桿菌2株;大腸埃希菌2株、弗格森埃希菌1株;莫拉氏菌1株;嗜麥芽窄食單胞菌2株;金黃色葡萄球菌1株、溶血葡萄球菌1株、模仿葡萄球菌1株;肺炎鏈球菌1株、豬鏈球菌2株、前庭鏈球菌1株、緩癥鏈球菌2株、麻疹孿生球菌1株、綠色氣球菌4株;戊糖片球菌1株;糞腸球菌2株;枯草芽孢桿菌6株、地衣芽孢桿菌5株、蜂房芽孢桿菌1株、巨大芽孢桿菌1株;少見沃特菌1株。分離菌株的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征見表3。分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果表4。細(xì)菌分離鑒定結(jié)果表明,小型豬所攜帶的細(xì)菌,主要為彎曲菌屬、螺桿菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、埃希菌屬、窄食單胞菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬和芽孢桿菌屬的細(xì)菌。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 對主要細(xì)菌:如大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果表明,這些菌株對氨曲南、頭孢噻吩等藥物敏感,而對痢特靈等藥物不敏感。結(jié)果見表5。

2.3 分子鑒定結(jié)果 對分離菌株(空腸彎曲菌、幽門螺桿菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、肺炎鏈球菌、豬鏈球菌)16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察,在1 500 bp處均出現(xiàn)一條明亮的目的條帶(圖1)。將PCR產(chǎn)物回收純化后,送寶生物工程(大連)有限公司測序。將測序結(jié)果與 GenBank中參考菌株16S rRNA基因核苷酸序列序列進(jìn)行同源性比較分析。結(jié)果,小型豬空腸彎曲菌、幽門螺桿菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、肺炎鏈球菌、豬鏈球菌等分離菌株與 GenBank中相關(guān)參考菌株16S rRNA基因的核苷酸序列同源性為99%～100%。根據(jù)不同屬細(xì)菌16S rRNA基因同源性為70%～90%,而同一種內(nèi)不同株間基因同源性大于99%的判定標(biāo)準(zhǔn),證實(shí)分離株的16S rRNA基因序列均與各自種屬的16S rRNA基因序列相一致,確證是各自種屬的細(xì)菌。

表1 25只小型豬性別與年齡Tab.1 The sex and age of 25 m in iature pigs

表2 小型豬分離菌株的檢出數(shù)及檢出率Tab.2 Detection number and detection rate of the isolated bacterial strains of m in iature pigs

3 討 論

本研究首次對中國三個(gè)品系的小型豬進(jìn)行了活體采樣、剖解觀察、現(xiàn)場接種、常規(guī)細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗(yàn)、血清抗體檢測等全面的細(xì)菌學(xué)檢查,并進(jìn)行細(xì)菌16S rRNA基因 PCR擴(kuò)增、序列測定、分析比對等方面的分子鑒定。結(jié)果,從25只小型豬中共分離鑒定出45株細(xì)菌,其中:空腸彎曲菌2株、幽門螺桿菌2株;肺炎克雷伯氏菌2株;陰溝腸桿菌2株;大腸埃希菌2株、弗格森埃希菌1株;莫拉氏菌1株;嗜麥芽窄食單胞菌2株;金黃色葡萄球菌1株、溶血葡萄球菌1株、模仿葡萄球菌1株;肺炎鏈球菌1株、豬鏈球菌2株、前庭鏈球菌1株、緩癥鏈球菌2株、麻疹孿生球菌1株、綠色氣球菌4株;戊糖片球菌1株;糞腸球菌2株;枯草芽孢桿菌6株、地衣芽孢桿菌5株、蜂房芽孢桿菌1株、巨大芽孢桿菌1株;少見沃特菌1株。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,大腸埃希氏菌對氨曲南(30 mm)、磷霉素(28 mm)高度敏感;溶血葡萄球菌對青霉素 G(38 mm)、頭孢噻吩(40 mm)高度敏感。

在上述細(xì)菌中有一些是人畜共患病的病原菌,如:空腸彎曲菌、幽門螺桿菌、肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血葡萄球菌、肺炎鏈球菌、豬鏈球菌等,對人和動(dòng)物都有一定的危害。有一些則是潛在的條件致病菌,在動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降、飼養(yǎng)環(huán)境改變或運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激反應(yīng)情況下就可能使動(dòng)物發(fā)病甚至死亡,如:溶血葡萄球菌、嗜麥芽窄食單胞菌、前庭鏈球菌、陰溝腸桿菌等;而其他大部分菌株都是動(dòng)物體內(nèi)正常的有益菌群,如:大腸埃希氏菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌。

表3 小型豬分離菌株的培養(yǎng)特性及形態(tài)特征Tab.3 The cultural and morphologic characteristics of the isolated bacterial strains of m in iature pigs

表4 小型豬分離菌株的生化特征Tab.4 The biochem ical characteristics of the isolated bacterial strains of m iniature pigs

16S rRNA編碼基因是指細(xì)菌染色體上編碼rRNA相對應(yīng)的DNA序列,存在于所有細(xì)菌的染色體基因組中,它具有以下特點(diǎn):多拷貝(每個(gè)細(xì)菌約含5～10個(gè)拷貝,這使得對該基因的檢測具有敏感性)、多信息(16S rRNA編碼基因內(nèi)部結(jié)構(gòu)由可變區(qū)和保守區(qū)組成。保守區(qū)為所有細(xì)菌所共有,細(xì)菌間無差別,有“分子化石”之稱。可根據(jù)保守區(qū)設(shè)計(jì)各種細(xì)菌的通用引物,也可根據(jù)可變區(qū)設(shè)計(jì)特定細(xì)菌的特異引物或探針)。16S rRNA編碼基因長度適中,約1500 bp,便于序列測定分析比對。16S rRNA編碼基因的這些特點(diǎn)使之成為較理想的細(xì)菌基因分類的靶序列,逐漸成為細(xì)菌鑒別、分類的金標(biāo)準(zhǔn)〔11〕。

表5 小型豬分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Susceptibility test of the isolated bacterial strains of m iniature pigs

作者通過對我國小型豬分離菌株的16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增、測序分析,直接將細(xì)菌鑒定到種的水平,從而在分子水平上提供了一種對細(xì)菌進(jìn)行鑒定的有效方法,對傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)、生化鑒定方法進(jìn)行了有力的確證、補(bǔ)充。在對25只剖解的小型豬肺臟進(jìn)行肉眼觀察時(shí)發(fā)現(xiàn),有5只小型豬的肺臟有不同程度的病變:肺臟體積腫大、充血、肺實(shí)質(zhì)病變;切開肺臟后發(fā)現(xiàn),細(xì)支氣管內(nèi)充斥著諸多淺灰色粘液樣物質(zhì);從肺門處取樣進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)后,檢出了肺炎克雷伯氏菌、肺炎鏈球菌等致病菌。對1只臨床表現(xiàn)為腹瀉的小型豬和另1只生長發(fā)育異常遲緩的小型豬剖解后,取其胃、腸樣本,選用特殊培養(yǎng)基進(jìn)行微需氧培養(yǎng),分離鑒定出了幽門螺桿菌、空腸彎曲菌等致病菌。此外,作者在剖解時(shí)還發(fā)現(xiàn),有5只小型豬的淋巴結(jié)異常,出現(xiàn)體積腫大、充血、出血現(xiàn)象,結(jié)果從淋巴結(jié)樣本中分離到了陰溝腸桿菌、豬鏈球菌等條件致病菌。

本研究的細(xì)菌學(xué)分離培養(yǎng)和16S rRNA基因的分子鑒定結(jié)果表明,我國小型豬攜帶的細(xì)菌種群具有多樣性。這為小型豬質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了可靠科學(xué)依據(jù),為制訂與國際接軌、符合我國目前研究水平和應(yīng)用要求的實(shí)驗(yàn)用小型豬微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn),為培育高品質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)用小型豬,滿足生命科學(xué)研究的需要奠定基礎(chǔ)。同時(shí),也為進(jìn)一步完善我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化管理體系,提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對科技創(chuàng)新的支撐能力,為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行政許可、行政執(zhí)法和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及相關(guān)條件的質(zhì)量控制和評價(jià)提供技術(shù)保障和科學(xué)依據(jù)。

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Iden tification and susceptibility test of bacteria isolated from m in iature pigs in China

GAO Zheng-qin,ZHANG Qiang,HE Zheng-m ing,YUE Bing-fei,YE Qiang

(N ationa l Institute for the Control of Pharmaceutical and Biologica l Products,Beijing 100050,China)

To investigate the p revalence and the antibiotic resistance of bacteria isolated from 25 miniature pigs.45 bacterial strains were isolated,which were identified by biochemical assays,amp lification of 16S rRNA genes by PCR and sequence analysis,and were evaluated for resistance to 30 antibio tics.The identification results showed that these bacteria belonged to Campylobacter(Cam py lobacter jejuni),Helicobacterium(Helicobacter pylori),Klebsiella(K lebsiella pneumoniae),Escherichia(Escherichia coli,Escherichia fergusonii),Pseudomonas(Pseudom onas aeruginosa),Stenotrophomonas(Stenotrophom onas maltophilia),Staphy lococcus(Staphy lococcus aureus,Staphy lococcus haemoly ticus,Staphy lococcus simulans),Strep tococcus(Streptococcus pneumoniae,Streptococcus suis,Streptococcus vestibularis,Streptococcus m itis,Gemella measles,Aerococcus viridans)and Bacillus(Bacillus subtilis,Bacillus licheni form is,Bacillus a lvei,Bacterium megaterium).These bacteria were all susceptible to aztreonam and cephalothin.However,the resistence to furazolidonewas found.Microbial population carried by miniature pigs in China had characters of diversity.Results of this study provided scientifical acco rdance for the microorganism monito ring of miniature pigs in China.

miniature pig;bacteria isolation;identification;16S rRNA

S852.61

A

1002-2694(2010)01-0046-07

＊北京市科委公益應(yīng)用項(xiàng)目(D07080200720701)

1.中國藥品生物制品檢定所,北京 100050;

2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院,北京 100069

2009-07-18;

2009-11-20