陽 帆,何建凡,冼慧霞,何雅青,張海龍,姚相杰,楊 洪

登革4型病毒深圳分離株E基因序列測定及其系統(tǒng)發(fā)生分析

陽 帆,何建凡,冼慧霞,何雅青,張海龍,姚相杰,楊 洪

目的 對深圳市2005年從登革熱患者急性期血液中分離到的1株登革病毒進(jìn)行型別鑒定,從分子水平分析分離株的生物學(xué)特征,追蹤其可能的地域來源。方法用C6/36細(xì)胞培養(yǎng)增殖病毒株SZ0524,收集病毒液。用逆轉(zhuǎn)錄-半套式PCR(RT-semi-nested-PCR)方法和熒光PCR方法對其進(jìn)行型別鑒定。擴(kuò)增病毒 E基因后進(jìn)行序列測定,并與不同國家和地區(qū)的登革病毒株進(jìn)行同源性比較和進(jìn)化樹分析。結(jié)果深圳市登革病毒分離株用4型特異性引物擴(kuò)增出392bp的特異性條帶,熒光PCR進(jìn)一步證實了分離的病毒株為登革4型病毒。SZ0524與登革病毒4型國際標(biāo)準(zhǔn)株 H241株在 E基因上核苷酸同源性為99.7%,而與登革病毒1、2、3型國際標(biāo)準(zhǔn)株 HAWA II、NGC、H87同源性分別為57.0%、59.2%和56.2%?；蜻M(jìn)化樹顯示SZ0524株與D4-73N IID株和D4-61N IID株親緣關(guān)系最近,其次為 H241,在進(jìn)化樹的同一分支上,屬基因Ⅰ亞型。結(jié)論從分子水平證明從深圳市登革熱患者血清中分離到的毒株確為DEN-4型病毒。結(jié)合流行病學(xué)調(diào)查資料,證實此病例為輸入性感染病例,該毒株最有可能來源于東南亞一帶。

登革4型病毒;E基因;序列分析;系統(tǒng)發(fā)生樹

登革熱是由登革(Dengue,DEN)1、2、3和4型病毒引起的急性蚊媒傳染病,廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)的100多個國家和地區(qū),已成為世界上分布最廣、發(fā)病率最高、危害較大的一種蟲媒病毒性疾病,至今仍無安全有效的登革疫苗應(yīng)用于預(yù)防〔1〕。在我國,登革熱主要分布于廣東、海南、廣西、福建、臺灣等幾個南方及東南沿海省區(qū),對人類健康造成嚴(yán)重的威脅,成為一個日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。深圳屬于亞熱帶氣候,氣候適于媒介伊蚊的生長繁殖,且處于登革熱流行地區(qū)的包圍之中,對外交往多,人員流動性大,近年來都有到東南亞、太平洋地區(qū)、非洲等地回國感染登革熱的輸入性病例,疫情多呈散發(fā)。

目前,利用分子生物學(xué)技術(shù)和新興的生物信息學(xué)方法對登革熱的病原學(xué)、病毒基因序列分析、流行病學(xué)等方面進(jìn)行研究,探討基因序列改變及其分子進(jìn)化特征,從不同毒株地理來源等方面了解其致病機(jī)制,對于登革熱的預(yù)防、控制具有重要意義。深圳市2005年夏秋季陸續(xù)發(fā)現(xiàn)疑似登革熱患者,其主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、肌痛、關(guān)節(jié)痛及皮疹伴淋巴結(jié)腫大。根據(jù)流行病學(xué)資料和血清學(xué)檢測,初步診斷均為輸入性登革病毒感染。本實驗室從一患者急性期血清中分離到一株登革病毒株,采用劉建軍等人報道的M GB熒光 PCR方法〔2〕對其進(jìn)行了鑒定,從病原學(xué)上證實為登革感染,但一直未知其具體型別、分子結(jié)構(gòu)特點,對病毒來源亦缺乏依據(jù)。本研究通過對分離株SZ0524 E基因全序列測定,分析其結(jié)構(gòu)特點,從分子水平確定其型別,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,與國際參考株和國內(nèi)分離株進(jìn)行同源性比較,追蹤其可能的傳染來源,為正確了解登革病毒在深圳市的流行病學(xué)概況提供了重要的線索。

1 材料和方法

1.1 病毒株及細(xì)胞 登革病毒株SZ0524為用白紋伊蚊傳代細(xì)胞(C6/36細(xì)胞)自登革熱病人血清標(biāo)本中分離得到,由本實驗室分離、鑒定,-80℃保存至今。C6/36細(xì)胞由本室液氮保存,復(fù)蘇后用含10%胎牛血清的50%M EM+50%RPM I-1640培養(yǎng)液,于28℃、5%CO2條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。登革病毒DEN 1-4型標(biāo)準(zhǔn)株(1型 Haw aii株、2型 New Guinea C株、3型 H 87株和4型 H241株)由廣東省疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗所惠贈。

1.2 主要試劑 M EM、RPM I-1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自 Gibco公司。M-MLV酶(D2640A)、PrimeSTAR高保真 Taq酶(DR010A)、DNA Ladder M arker(D505A)均購自 TA KARA公司。

1.3 病毒增殖 按照文獻(xiàn)方法〔3〕,用 C6/36細(xì)胞28℃常規(guī)培養(yǎng)和傳代病毒,待75%細(xì)胞出現(xiàn)病變時收獲感染細(xì)胞和培養(yǎng)液,-80℃保存。

1.4 登革病毒型別鑒定 按照文獻(xiàn)〔4〕方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-半套式PCR分型鑒定。同時采用上海之江生物科技有限公司生產(chǎn)的登革病毒(1-4型)核酸熒光PCR分型檢測試劑盒對分離的毒株進(jìn)行型別鑒定,具體步驟按照試劑盒說明書操作。

1.5 登革病毒E基因序列的測定

1.5.1 引物設(shè)計與合成 利用 Primer軟件,參照DEN-4型國際標(biāo)準(zhǔn)株 H241株設(shè)計兩對重疊引物分段擴(kuò)增E基因片段,預(yù)期擴(kuò)增序列完全覆蓋 E基因區(qū)域。具體序列見下表1,均由TA KARA公司合成。

表1 登革病毒E基因引物序列Table 1 The Primers used for amplification of E genes of dengue virus

1.5.2 病毒 RNA提取 采用 Roche公司 High Pure Viral RNA Kit提取病毒RNA,具體操作參見試劑盒說明書。

1.5.3 反轉(zhuǎn)錄及PCR 采用常規(guī)方法用M-MLV進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。即取RNA,加入反向引物,70℃作用10 min后,立即插入冰浴中保持2 min以上,依次加入RNase Inhibitor,5×緩沖液,dN TP及M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶,加水至總體積20μL,42℃保溫60 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)完畢,70℃15 min滅活cDNA作為 PCR模板。取 cDNA,5×PCR緩沖液,dN TP,正向引物,反向引物,PrimeSTAR高保真Taq酶,補(bǔ)水至總體積50μL進(jìn)行 PCR。反應(yīng)參數(shù)為:98℃2 min,98℃10 s、56℃15s、72℃60s,30個循環(huán),72℃再延伸7min。

1.5.4 PCR產(chǎn)物的鑒定和測序 用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,凝膠成像系統(tǒng)觀察分析并記錄結(jié)果。獲得的 E基因區(qū) PCR產(chǎn)物由TA KARA公司純化后使用AB I373 DNA序列自動測序儀進(jìn)行序列測定。所有PCR產(chǎn)物經(jīng)正、反方向測序,互補(bǔ)配對驗證后,用軟件拼接成完整的 E基因序列。

1.6 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)生樹研究 利用NCBI BLASTn對 GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索,并應(yīng)用Clustslx(1.83)和DNAStar軟件進(jìn)行排序、比較分析建立系統(tǒng)進(jìn)化樹,其他已知參考序列片段來源于 NCB I的 GenBank。

2 結(jié) 果

2.1 登革病毒的型別鑒定 逆轉(zhuǎn)錄-半套式 PCR用型特異性引物擴(kuò)增后,獲得392bp的DEN-4型特異性帶(圖1),與預(yù)期的分子量相符,陰性對照未見任何條帶。未擴(kuò)增出其他型別的特異帶,證實分離到的SZ0524為DEN-4型。另外采用登革病毒(1-4型)核酸熒光PCR檢測試劑盒對SZ0524株進(jìn)行基因分型,結(jié)果登革4型病毒出現(xiàn)明顯的“S”型曲線峰圖,登革1、2、3型病毒和陰性對照均沒有出現(xiàn)峰,這也證實了所分離到的登革熱毒株SZ0524為登革4型。這是深圳市首次從輸入性登革熱患者血清中分離出登革4型病毒。

圖1 型特異性引物PCR擴(kuò)增登革病毒分型Fig.1 PCRam plification with type-specific primers M.100bp DNA ladder;1.postive control;2.amp lification of the SZ0524 with DEN-1 specific primers;3.amp lification of the SZ0524 with DEN-2 specific primers;4.amp lification of the SZ0524 with DEN-3 specific primers;5.amp lification of the SZ0524 with DEN-4 specific primers;6,7.negative control

2.2 SZ0524株 E基因序列測定結(jié)果 將DEN4-SZ0524株經(jīng)上述 E基因測序引物擴(kuò)增后,均擴(kuò)增出相應(yīng)的目的條帶。分別進(jìn)行測序后將測序結(jié)果利用軟件拼接組合成完整的E基因序列,核苷酸序列長度為1 485bp,編碼495個氨基酸,未發(fā)現(xiàn)有堿基的缺失和插入。據(jù)文獻(xiàn)報道,登革4型病毒在67位(N-I-T,67-69)和153位(N-D-T,153-155)存在兩個保守的N-聯(lián)糖基化位點〔5〕。而SZ0524株的E基因在464位有1個堿基發(fā)生變異(由C→T),導(dǎo)致推導(dǎo)出的氨基酸在155位由蘇氨酸(T)→異亮氨酸(I),由親水性氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷园被?使得喪失E153位的N-聯(lián)糖基化位點,可能會對抗原性產(chǎn)生影響。

2.3 SZ0524株與登革病毒分離株的比較 將SZ0524 E基因核苷酸序列輸入 GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blastn檢索,結(jié)果發(fā)現(xiàn)序列相似度最高的均為DEN-4型病毒,進(jìn)一步證實了該毒株為DEN-4型。該分離株 SZ0524與登革病毒4型國際標(biāo)準(zhǔn)株H241株核苷酸同源性為99.7%,氨基酸同源性為99.2%。而與登革病毒1、2、3型國際標(biāo)準(zhǔn)株 HAWA II、NGC、H87株核苷酸同源性分別為57.0%、59.2%和56.2%,氨基酸同源性分別為62.6%、63.4%和62.4%。與D4-73N IID株(分離自1973年輸入至日本的病人標(biāo)本)和D4-61N IID株(分離自1961年輸入至日本的病人標(biāo)本)核苷酸同源性最高,達(dá)99.9%,氨基酸同源性為99.8%。與中國廣州分離的DEN-4病毒B5株核苷酸同源性為97.7%,氨基酸同源性為98.8%。

2.4 SZ0524株系統(tǒng)發(fā)生樹分析 為了明確深圳市SZ0524株與世界其它流行區(qū)分離株之間的親緣關(guān)系,探討流行來源,我們對其進(jìn)行了進(jìn)化分析。Lewis JA等〔6〕認(rèn)為全長的E蛋白基因是研究登革病毒的分子流行病學(xué)的最適區(qū)段。根據(jù)文獻(xiàn)報道〔7-8〕,登革4型病毒分為森林株和地方流行株,后者可劃分為基因Ⅰ型和Ⅱ型,其中基因Ⅱ型又分為ⅡA和ⅡB亞型?；颌裥椭饕獮闁|南亞和中國株,基因ⅡA亞型主要為東南亞和中國株,基因ⅡB亞型主要為拉丁美洲、太平洋群島和東南亞株。因此,我們將SZ0524株 E基因序列與國際標(biāo)準(zhǔn)株和其他國內(nèi)外分離株以及登革1、2、3型國際標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行同源性比較。分析表明核苷酸序列同源性在56.2%～99.9%之間,推導(dǎo)的氨基酸同源性在62.4%～99.8%之間。從系統(tǒng)發(fā)生樹(圖2)中可見,SZ0524與D4-73N IID株和D4-61N IID株系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系最近,其次為登革4型病毒國際標(biāo)準(zhǔn)株 H241,而與登革1型、2型和3型距離最遠(yuǎn)。且與 Thailand 1978、Philippines 1964和B5株等位于相近的分支,按照文獻(xiàn)報道標(biāo)準(zhǔn)對DEN-4基因亞型的劃分,H241、Thailand 1978、Philippines 1964和B5株都屬于基因Ⅰ型,因此我們將DEN4-SZ0524劃分為基因Ⅰ型。

圖2 登革4型病毒分離株SZ0524 E基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of nucleotide sequences of E gene of virus type 4 SZ0524 strain

3 討 論

通過對不同地區(qū)流行株的分離、鑒定,進(jìn)而比較不同地區(qū)、不同時間登革流行株的遺傳差異,從基因水平上追蹤分析傳染源,從而發(fā)現(xiàn)某一流行事件是過去流行株的復(fù)發(fā)還是從外界傳入的新毒株,是目前登革病毒分子流行病學(xué)調(diào)查研究的主要手段之一。同時該技術(shù)有助于對國內(nèi)登革熱流行規(guī)律的認(rèn)識,為我國登革熱的流行病學(xué)監(jiān)測及制定有效的預(yù)防措施提供理論依據(jù)〔9〕。由于常有輸入性病例以及登革病毒的傳播媒介在我市普遍存在,因此登革熱在我市局部暴發(fā)流行的潛力相當(dāng)大。如不加強(qiáng)登革熱傳染源和媒介的控制,將很可能引發(fā)流行或暴發(fā)流行。

本研究首先用逆轉(zhuǎn)錄-半套式PCR和熒光PCR方法對深圳市分離株SZ0524進(jìn)行了型別確定,對其 E基因進(jìn)行了序列測定,從分子水平上進(jìn)一步證實確為登革4型病毒,并建立系統(tǒng)發(fā)生樹,以了解這一毒株的流行來源和生物學(xué)特性。結(jié)果顯示SZ0524 株與 H241、Thailand 1978、Philippines 1964和Sri Lanka 1978等同屬于基因Ⅰ型。該分離株與兩株輸入至日本的D4-73N IID株和D4-61N IID株(兩株E基因核苷酸序列一致)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系最近,核苷酸同源性均為99.9%,其次為登革4型國際標(biāo)準(zhǔn)株 H 241,核苷酸同源性為99.7%。由于此兩株輸入至日本的毒株具體來源未知,利用NCB IBLASTn對 GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性檢索發(fā)現(xiàn)與其同源性最高的為 H241株,據(jù)報道 H241株分離自1956年菲律賓發(fā)熱病人,是菲律賓當(dāng)時的流行株,此外,根據(jù)現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查,感染該分離株SZ0524的病人在2005年8-9月期間曾于新加坡學(xué)習(xí)逗留一段時間后返回深圳,據(jù)此推測出該次登革熱的感染源自境外相關(guān)地區(qū),該毒株最有可能來源于東南亞一帶,屬于輸入性傳染,這與流行病學(xué)調(diào)查資料一致。

DEN的E蛋白全長495個氨基酸,位于病毒毒粒表面,構(gòu)成毒粒的突起,是主要的胞膜蛋白,決定著病毒的組織親嗜性,并介導(dǎo)病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合。同時它還是影響病毒毒力,引起保護(hù)性免疫應(yīng)答及免疫病理損傷的重要成分。該蛋白的變異可能導(dǎo)致毒力變化,并引起疾病癥狀的變化。根據(jù) E基因序列分析及帶二硫鍵的不同抗原決定簇的結(jié)構(gòu)特性,提出了一種 E蛋白結(jié)構(gòu)模型:該模型主要由3個不重疊的抗原區(qū)A、B和C組成。因此,此研究選擇對SZ0524株進(jìn)行 E基因序列測定,從序列分析發(fā)現(xiàn)與病毒毒力相關(guān)的位點。據(jù)文獻(xiàn)報道〔10〕,E蛋白區(qū)在E155位由蘇氨酸(T)→異亮氨酸(I),由親水性氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷园被?抗原性發(fā)生較大變化,可能對病毒的毒力產(chǎn)生影響。DEN-4病毒的E155位氨基酸殘基位于結(jié)構(gòu)域 A區(qū)。Kawano等〔11〕利用登革4型高神經(jīng)毒力和低神經(jīng)毒力病毒構(gòu)建型內(nèi)嵌合病毒,并進(jìn)行點突變后分析,發(fā)現(xiàn)E155為氨基酸殘基由 T轉(zhuǎn)變?yōu)镮后,登革4型病毒E蛋白潛在的兩個保守的N聯(lián)糖基化位點之一(A sn-153位)發(fā)生改變,使A區(qū)的抗原位點發(fā)生改變,從而使病毒毒力轉(zhuǎn)強(qiáng)。我們的測序結(jié)果顯示SZ0524株在E蛋白區(qū)155位為異亮氨酸(I),根據(jù)文獻(xiàn)報道可能是一強(qiáng)毒力位點,因此我們推測SZ0524很可能為強(qiáng)毒株,對于E蛋白的變異與其毒力、致病性的關(guān)系的研究,有待今后進(jìn)一步開展。這次對深圳市分離到的4型登革病毒株的研究為型特異性E抗原基因的克隆、表達(dá)奠定了基礎(chǔ),從而深入了解病毒致病的分子機(jī)制,為我市登革熱的傳播來源、疫情流行特點、預(yù)防控制提供了科學(xué)依據(jù)。

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Sequence determ ination and phylogenetic tree analysis of the E gene of dengue virus type 4 isolated from a patien t in Shenzhen

YANG Fan,HE Jian-fan,XIAN Hui-xia,HE Ya-qing,ZHANG Hai-long,YAO Xiang-jie,YANG Hong

(Shenzhen Center for D isease Prevention and Control,Shenzhen 518020,China)

To identify the genotype and analyze the molecular characteristics of dengue virus strain SZ0524 isolated from serum samples of patients with early stage of dengue fever in Shenzhen in 2005 so as to exp lo re its possible origin.The C6/36 cell line was cultivated with virus strain SZ0524 and its suspension was harvested.The type of isolated virus strain was determined by RT-semi-nested PCR and fluorescent PCR.E gene of isolated virus strain was amplified by RT-PCR and sequenced.Homology and phylo genetic tree of E gene of this dengue virus with the strains isolated from other areas were constructed.This SZ0524 strain was further identified by fluorescent PCR,and confirmed to be the type 4 virus after obtaining the 392bp band with type 4 specific primers.The homology of nucleotide sequence of E gene of SZ0524 strain with the standard type 4 dengue virus H241 strain were 99.7%,but the homology with the standard dengue virus 1,2,3 in the same fragment were 57.0%,59.2%and 56.2%respectively.Analysis of the phylo genetic tree indicated that SZ0524 was more close to D4-73N IID and D4-61N IID strain,next to H241 strain,and they lied in the same branch of phylogenetic tree.The isolated dengue virus type 4 belonged to genotypeⅠand the SZ0524 strain was p roved to be dengue virus type 4 in themolecular level.Combined with epidemiology information,it is suggested that this case can be classified as an imported case and the SZ0524 strain may be transferred from the southeast asian region.

dengue virus type 4;E gene;sequence analysis;phylogenetic tree

R373.3

A

1002-2694(2010)01-0017-04

深圳市疾病預(yù)防控制中心微生物檢驗科,深圳 518020;Email:sailing_728@163.com

2009-06-07;

2009-10-26