孫理云

用生物信息學(xué)方法預(yù)測2型豬鏈球菌98HAH33細(xì)胞壁結(jié)合蛋白＊

孫理云

目的 為預(yù)測已公布基因組序列的2型豬鏈球菌(SS2)98HAH33株的細(xì)胞壁結(jié)合蛋白,以研究它們在SS2致病過程中的作用。方法首先從 GenBank獲取由SS2 8HAH33基因組推測蛋白質(zhì)氨基酸序列,然后根據(jù)分選酶底物的結(jié)構(gòu)特征,采用“三部分模式”法鑒別分選酶底物;采用手動方法尋找在具有I型信號肽的蛋白質(zhì)中具有LysM域、W xL域、膽堿結(jié)合域、GW域或S層同源域的蛋白質(zhì);利用InterProScan和BlastP服務(wù)器,對鑒定的蛋白質(zhì)進行功能分析。結(jié)果共預(yù)測出9種分選酶底物,2種具有LysM域的蛋白。YP_001201232、YP_001201531和 YP_001201656等3種已證實位于SS2菌體表面;其中 YP_001201232為已知毒力因子OSF。另外4種蛋白質(zhì)的功能分析表明,YP_001201484為糖苷酶,YP_001201544為枯草桿菌素樣絲氨酸酶,YP_001199825和 YP_001199755可能結(jié)合 H因子,可能為新的毒力因子。YP_001200959、和 YP_001201233等2種功能未知。結(jié)論提示SS2的多數(shù)分選酶底物可能為SS2的毒力因子,與致病過程相關(guān)。

細(xì)胞壁結(jié)合蛋白;豬鏈球菌2型;生物信息學(xué);毒力因子

2型豬鏈球菌(Streptococcus suis type2,SS2)是革蘭氏陽性、溶血性兼性厭氧的球菌,主要可引起豬和人的腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥及猝死,是一種重要的人獸共患病細(xì)菌。我國分別在1998年江蘇省和2005年四川省在豬群和人群中暴發(fā)流行豬鏈球菌病并引起死亡,引起了社會的廣泛關(guān)注。引起這兩次暴發(fā)疫情的病原體均為 SS2強毒株〔1-2〕。但其致病機制及毒力因子尚不甚清楚。

革蘭氏陽性菌的一些表面分泌蛋白通過共價和非共價連結(jié)與細(xì)胞壁結(jié)合,共價結(jié)合的蛋白為分選酶的底物,分選酶裂解底物的LPXTG基序與之于肽聚糖共價結(jié)合。非共價結(jié)合的蛋白均有特殊的結(jié)構(gòu)域或基序與細(xì)胞壁的成分通過非共價結(jié)合而錨定于細(xì)胞壁,如LysM域和W xL域介導(dǎo)與肽聚糖的非共價結(jié)合、膽堿結(jié)合域與脂壁酸的膽堿結(jié)合、GW基序與細(xì)胞壁脂壁酸結(jié)合、S層同源域與細(xì)胞壁結(jié)合〔3〕。

分選酶是 G+細(xì)菌的一種胞膜結(jié)合的轉(zhuǎn)肽酶,催化的底物是具有如下特點的蛋白質(zhì):N端有信號肽用于蛋白質(zhì)通過I型分泌途徑轉(zhuǎn)運出細(xì)胞質(zhì)膜;C端的分選信號約有30～40氨基酸,具有LPXTG基序,在該基序之后有一疏水性的跨膜區(qū),C端的最后8個氨基酸至少有一個堿性氨基酸(R或 K)。分選酶在C端LPXTG基序的 T和 G間裂解表面蛋白,通過C端和細(xì)胞壁肽聚糖形成的酰胺鍵的形成而將這類底物錨定到細(xì)胞壁上〔4〕?；?G+細(xì)菌分選酶底物蛋白的特征,人們已建立起預(yù)測其的方法〔5〕。

業(yè)已證實多種G+致病菌的分選酶變異株毒力降低與錨定于細(xì)胞壁的蛋白質(zhì)相關(guān)。SS2有5-6種分選酶〔6-7〕,近已證實SS2的 SrtA與 SS2的毒力有關(guān)〔8-9〕。迄今已鑒別的 SS2分選酶底物蛋白不多,其中溶菌酶釋放蛋白(muramidase-released protein,M RP)是 SS2的一種毒力標(biāo)志〔10〕、豬鏈球菌渾濁因子(opacity factor of S.suis,OFS)與毒力有關(guān)〔11〕,表面抗原 1(surface antigen one,Sao)具有免疫保護作用〔12〕。SS2有其它什么分選酶底物,它們在細(xì)菌毒力方面起何種作用,未見報道。此外,SS2細(xì)胞壁是否有非共價結(jié)合的蛋白也未見報道。為此,本文采用生物信息學(xué)法對已公布的國內(nèi)SS2致病株98HAH33基因組進行分析,推測出該株菌具有9種可能的分選酶底物蛋白和2種具有LysM域的蛋白,對它們可能的作用進行了預(yù)測分析,為進一步的研究提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 SS2致病株98HAH33基因組推測的蛋白質(zhì)及氨基酸組成序列由 GenBank獲得。該菌基因組登陸號為NC_009443,編碼2185種蛋白質(zhì)。1.2 分選酶底物的鑒別 采用Jos Boekhorst的“三部分模式”法進行鑒別〔5〕。首先手工找出最后40個aa中具有LPXTG基序的蛋白質(zhì),然后利用Phobius(http://phobius.binf.ku.dk/)〔13〕鑒別出具有信號肽及信號肽的裂解位置、LPXTG基序之后具有疏水性跨膜區(qū)的蛋白質(zhì);其后手工檢測出 C端最后8個aa有至少一個極性或帶電aa(R或 K)的蛋白質(zhì)即為分選酶底物。

1.3 細(xì)胞壁非共價結(jié)合蛋白的鑒別 利用Phobius(http://phobius.binf.ku.dk/)預(yù)測出具有信號肽的蛋白質(zhì),手動分析找出具有LysM域、W xL域、膽堿結(jié)合域、GW域和S層同源域的蛋白質(zhì)。

1.4 功能分析 利用InterProScan(http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/)程序檢測每一預(yù)測蛋白的功能域,利用BlastP(http://beta.unip rot.org/?tab=blast)尋找出同源蛋白質(zhì),結(jié)合98HA H33基因組注釋進行功能分析。

2 結(jié) 果

2.1 分選酶底物

2.1.1 鑒定結(jié)果 在98HA H33基因組中發(fā)現(xiàn)YP_001199741、YP_001199755、YP_001199771、YP_001199825、YP_001199827、YP_001200023、YP_001200025、YP_001200313、YP_001200370、YP_001200536、YP_001200571、YP_001200785、YP_001200886、YP_001200944、YP_001200959、YP_001201081、YP_001201232、YP_001201233、YP_001201484、YP_001201531、YP_001201544、YP_001201625和 YP_001201656等23種蛋白在最后40個aa中具有LPXTG基序且C端最后8個aa至少1個為極性或帶電aa(R或 K),經(jīng) Phobius分析發(fā)現(xiàn)9種蛋白質(zhì)N端具有信號肽(表1)。

2.1.2 信號肽分析 在98HA H 33基因組所鑒定的9種分選酶底物中,信號肽長度在25-55個aa之間,平均35.1;N結(jié)構(gòu)域6-31個aa之間,平均15.5;9個 H結(jié)構(gòu)域有7個為12aa殘基長,另外1個11aa,1個9aa;C區(qū)4-12aa,平均8±3.08。

2.1.3 分選信號肽分析 在98HAH33基因組所鑒定的9種分選酶底物中,分選信號肽長度在31-38個aa之間,平均34.3±2.4;跨膜域長度 18-22個aa,18aa長的2個,19aa長的4個,20 aa長的2個,22aa長的1個,平均19.3±1.2;帶正電荷的尾巴長度在5-9個aa范圍之間,至少2個正電荷的氨基酸。分選酶識別的基序為〔L I〕P〔N KQASV Y〕TG。2.1.4 功能分析 YP_001199755具有 G5結(jié)構(gòu)域PF07501(416-493aa)和細(xì)胞表面抗原結(jié)構(gòu)域PD153432(346-409)。與肺炎鏈球菌的 Hic有28%(139/483)的一致性〔14〕,與四川株 YP_001197564具有99%(560/561)的一致性 YP_001199825原注釋為翻譯起始因子2GTPase,但在其上僅發(fā)現(xiàn)兩個高遷移率族蛋白結(jié)構(gòu)域 PD005593(515-528aa)和(595-613aa)及位于二者之間的細(xì)胞表面抗原結(jié)構(gòu)域 PD153432(529-594aa),也發(fā)現(xiàn)保守域PRK10263(DNA translocase FtsK)(566-665aa),FtsK參與細(xì)菌細(xì)胞的分裂。該蛋白與肺炎鏈球菌的 Hic有 34%(129/379)的一致性〔14〕,與無乳鏈球菌的Cβ蛋白有44%(77/173)一致性〔15〕。與四川株的 YP_001197640具有100%(698/698)的一致性。

表1 預(yù)測的分選酶底物分泌信號肽和C-端分選信號肽Table 1 Secretion and sorting signal peptides of predicted sortase substrates of SS2 isolate 98HAH33

YP_001200959原注釋為淀粉酶結(jié)合蛋白B,與四川株的 YP_001198753有98%(580/590)的一致性。具有肽酶域PF03577(25-447)。

YP_001201232具有 von Willebrand factor,type A超家族 cl00057(133-266aa);與登陸號AAX56334的豬鏈球菌的血清渾濁因子(OSF)有99%(931/938)的一致性〔11,16〕。與停乳鏈球菌的纖連蛋白結(jié)合蛋白FnBA具有38%(287/749)的一致性,該蛋白具有濁化血清作用〔17〕。與M 2型化膿鏈球菌的毒力因子血清渾濁因子有33%(277/836)的一致性,該蛋白具有纖連蛋白結(jié)合特性〔18〕。

YP_001201233未見蛋白結(jié)構(gòu)域或家族。為功能未知的蛋白質(zhì)。與四川株的 YP_001199030具有100%(698/698)的一致性。

YP_001201484具有糖基水解酶家族85 PF03644(198-510aa),盤狀素家族 PF00754(790-920aa)和2個可在多種細(xì)菌表面蛋白中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌Ig樣結(jié)構(gòu)域(群3)家族 PF075232(1034-1104aa和1123-1192aa),具有內(nèi)-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶D保守域COG4727(152-670aa),與肺炎鏈球菌的內(nèi)-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶D有 55%(759/1355)的一致性〔19〕。

YP_001201531具有內(nèi)切核酸酶/外切核酸酶/磷酸酶家族 PF03372(649-952),2個 YhcR_OBF_like保守域cd04489(201-271和414-470aa)和推測的胞外核酸酶保守域COG2374(154-960);與 SS2分離株 SX332的 SsnA有98%(1023/1043)一致性〔20〕。

YP_001201544具有枯草桿菌素樣絲氨酸蛋白酶家族 PF00028(228-665aa)和未知功能域PF06280 (Domain of Unknow n Function DUF1034)(737-859aa)。與肺炎鏈球菌的毒力因子枯草桿菌蛋白酶 PrtA具有29%(318/1079)一致性〔21〕,與地芽孢桿菌MO-1的膠原裂解蛋白酶具有29%(293/1003)一致性〔22〕。

YP_001201656具有鈣調(diào)磷酸酶樣磷酸酯酶蛋白家族 PF00149(115-353aa)、5’-核苷酶 C-端域蛋白家族 PF02872(447-644aa)、6個 PR01607結(jié)構(gòu)域(5’-核苷酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)、PS00786結(jié)構(gòu)域(5’-核苷酶)、PTHR11575(5’-核苷酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶)和 PTHR11575:SF6(2,3-環(huán)核苷2-磷酸二酯酶)。與 SS NCTC10234株登陸號為BAB83969的推定的環(huán)核苷磷酸二酯酶 SntA有99%(811/813)的一致性〔23〕。

2.2 細(xì)胞壁非共價結(jié)合蛋白 僅發(fā)現(xiàn)2種具有LysM域的蛋白,未發(fā)現(xiàn)具有其他結(jié)構(gòu)域或基序的蛋白。它們分別為 YP_001199784和 YP_001201729。其中 YP_001199784由343氨基酸組成,信號肽長49個氨基酸,N區(qū)1-27氨基酸,H區(qū)28-38氨基酸,C區(qū)39-49氨基酸,LysM域PF01476在73-116氨基酸之間;與無乳鏈球菌的表面免疫原蛋白Sip有一致性。

YP_001201729有192個氨基酸,信號肽長38個氨基酸,N區(qū)1-19氨基酸,H區(qū)20-31氨基酸,C區(qū)32-38氨基酸,LysM域在41-84之間。

3 討 論

革蘭氏陽性菌具有多種細(xì)胞外蛋白,其中一些對于細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境存活起著重要作用。對于病原菌,表面蛋白在黏附侵襲宿主組織、逃避宿主免疫方面起著重要作用。鑒別這些蛋白弄清其在細(xì)菌致病過程中的作用,研制有效診治這些致病菌所致疾病的方法具有重要意義。

細(xì)菌的一些細(xì)胞蛋白表達量少,有些是環(huán)境條件調(diào)節(jié)表達的,通過傳統(tǒng)的試驗難以獲得鑒定,而通過生物信息學(xué)的方法可以彌補其不足。本試驗在預(yù)測我國SS2分離株98HA H33和05ZYH33與細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)合的脂蛋白基礎(chǔ)上〔24-25〕,又對結(jié)合于細(xì)胞壁的蛋白進行了預(yù)測。

本研究預(yù)測出98HA H 33有9種分選酶底物,業(yè)已試驗證實其中的 OSF(YP_001201232)〔11〕、SsnA(YP_001201531)〔20〕〕和 SntA(YP_001201656)〔23〕3種蛋白質(zhì)錨定于細(xì)菌的細(xì)胞壁,說明預(yù)測方法可靠。在這3種蛋白中,已證實OSF與SS2的毒力有關(guān)〔11〕。

另外4種預(yù)測的蛋白質(zhì) YP_001201484、YP_001201544、YP_001199825和 YP_001199755在細(xì)菌致病過程中的作用,值得關(guān)注。與 YP_001201484同源的肺炎鏈球菌內(nèi)-β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶D可作用于IgG的門冬酰胺連接的寡糖核心結(jié)構(gòu)〔26〕。因此推斷 YP_001201484作為位于細(xì)菌細(xì)胞外的糖苷酶作用于宿主組織或免疫分子而起侵襲或逃避免疫作用。

Vanier等〔8〕證實SS2的 SrtA基因變異導(dǎo)致細(xì)菌粘附I型膠原的能力明顯減小,參與粘附 I型膠原的表面蛋白很可能是 YP_001201544,因為其與結(jié)合膠原的芽孢桿菌 MO-1膠原裂解蛋白酶同源〔22〕。肺炎鏈球菌的PrtA是肺炎鏈球菌的毒力因子〔21〕,與之同源的 YP_001199348,很可能是 SS2 的毒力因子。

補體系統(tǒng)的 H因子具有協(xié)助 I因子裂解C3b為iC3b,阻止C3b-Bb復(fù)合體(旁路途經(jīng)C3轉(zhuǎn)化酶)的形成。肺炎鏈球菌的 Hic與 H因子結(jié)合抑制了補體系統(tǒng)旁路激活途徑,使得細(xì)菌逃避體液免疫〔14〕。YP_001199825和 YP_001199755與 Hic同源,它們也許使細(xì)菌逃避宿主的免疫。

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Putative cell wall-binding proteins of Strep tococcus suis serotype 2 isolate 98HAH33 identified by bioinformatic genome analysis

SUN Li-yun
(College of L ivestock Science&Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang 471003,China)

To identify the cell wall-binding proteinsof Strep tococcus suis serotype 2(SS2),acco rding to their structure feature,the substrates of so rtase and I type secreted proteins with LysM domain,W xL domain,choline-binding domain,GW domain or S layer homologous domain in the recently published genome of SS2 strain 98HAH33 were firstly identified and then the putative functions were attributed to individual proteins by reference to the identification of conserved domains of Inter Pro and BlastP servers.Homologous proteins were identified by unfiltered BlastP homology searches(including conserved domain detection).Among the 23 putative proteins with a C-terminal LPXTG recognition signal for covalent attachment to pep tidoglycan by sortase,9 with I signal pep tide were identified as so rtase substrates.Among 9 substrates,YP_001201232,YP_001201531 and YP_001201656 had been experimentally verified to anchor to bacterial cell wall,and YP_001201232 know n as the opacity factor of S.suis(OFS)wasp roved to be the virulence facto rs.According to function analysis,YP_001201484,YP_001201544,YP_001199825,YP_001197640,YP_001197840 and YP_001199755 appeared to be involved in SS2 pathogenesis.and YP_001200959,YP_001201233 and two proteins with LysM domain(YP_001199784 and YP_001201729)were the hypothetical proteins.These data suggest the majority of putative sortase substrates may imp licate in the virulence of SS2 and could serve as a basis for targeted experimental studies into the function of these proteins.

cell wall-binding protein;Streptococcus suis type 2;bioin formatics;virulence factors

R378

A

1002-2694(2010)01-0072-04

＊河南科技大學(xué)人才科研基金(05-10);河南科技大?？茖W(xué)研究基金(2006ZY042)

河南科技大學(xué)動物科技學(xué)院,洛陽 471003;

Email:sunliyun8891@sina.com.cn

2009-07-13;

2009-10-19