劉棟華,梁 銘,羅 虹,譚升順

馬爾尼菲青霉菌耐氟康唑的蛋白質(zhì)組初步分析

劉棟華1,梁 銘1,羅 虹1,譚升順2

目的 探索馬爾尼菲青霉菌耐氟康唑的相關(guān)蛋白質(zhì)組。方法將11株菌絲相和酵母相對(duì)氟康唑均敏感的馬爾尼菲青霉菌菌株在體外含8μg/mL氟康唑的沙氏液基進(jìn)行耐藥誘導(dǎo)培養(yǎng)。E-test法檢測(cè)各菌株誘導(dǎo)培養(yǎng)前后氟康唑的M IC值,分別篩選菌絲相和酵母相M IC值增加最顯著的菌株,通過(guò)CM 10蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)菌體藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)前后蛋白質(zhì)表達(dá)的差異。結(jié)果11株菌株的菌絲相和2株菌株的酵母相能耐受8μg/mL氟康唑生長(zhǎng),而且誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后菌絲相M IC值顯著升高,M IC幾何均值由1.22μg/m L上升到55.56μg/mL;菌絲相在耐受氟康唑中16個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)為高表達(dá)且特異性表達(dá)4581.1 Da和6109.7Da蛋白質(zhì),酵母相則在8μg/mL氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)下22個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)為高表達(dá)且特異性表達(dá)3575.2 Da,8507.0Da和8563.3 Da蛋白質(zhì)。結(jié)論馬爾尼菲青霉菌菌絲相比酵母相更能耐受氟康唑,該菌對(duì)氟康唑的抵抗可能和某些特異性蛋白質(zhì)相關(guān)。

馬爾尼菲青霉菌;抗真菌藥;耐藥性;蛋白質(zhì)組

馬爾尼菲青霉菌在1956年從野生竹鼠體內(nèi)分離出來(lái),是目前已知青霉菌類中唯一具有雙相性的真菌,25℃表現(xiàn)為菌絲相而37℃表現(xiàn)為酵母相。馬爾尼菲青霉菌感染主要在中國(guó)的南方和東南亞地區(qū)呈地方性流行,特別是從上世紀(jì)80年代后期,隨著艾滋病的流行,馬爾尼菲青霉菌感染病例急劇增多,成為H IV陽(yáng)性患者中最為常見(jiàn)的雙相性真菌感染,目前被認(rèn)為是艾滋病標(biāo)志性診斷疾病之一〔1-3〕。馬爾尼菲青霉菌感染的治療主要依賴抗真菌藥物,在臨床常根據(jù)病情選擇使用氟康唑、兩性霉素B及伊曲康唑聯(lián)合用藥或單獨(dú)用藥,患者感染急性期控制以后還需要長(zhǎng)期口服氟康唑和伊曲康唑維持治療〔4〕。長(zhǎng)期口服抗真菌藥物的過(guò)程中易導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生,目前缺乏有關(guān)馬爾尼菲青霉菌的耐藥性機(jī)制研究報(bào)道。有研究報(bào)道在體外藥敏馬爾尼菲青霉菌對(duì)氟康唑的敏感性較伊曲康唑、酮康唑等抗真菌藥物低〔5〕,這種雙相性真菌如何對(duì)氟康唑產(chǎn)生抵抗性,其機(jī)制并未清楚。本研究針對(duì)這一問(wèn)題,采用蛋白質(zhì)芯片技術(shù),從比較蛋白質(zhì)組學(xué)的角度對(duì)馬爾尼菲青霉菌抵抗氟康唑的蛋白質(zhì)分子機(jī)制作初步探討。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 11株菌絲相和酵母相對(duì)氟康唑均敏感的馬爾尼菲青霉菌(PM)菌株(E-test法證實(shí)),對(duì)應(yīng)的編號(hào)為 PM 1、PM 2、PM 3、PM 4、PM 5、PM 7、PM 16、PM 19、PM 20、PM 23、PM 25。

1.2 主要試劑和儀器 細(xì)胞裂解液Ⅰ(9 mol/LU rea,4%CHAPS,40 mmol/L Tris,1%w/v DTT,0.8%p H3～10兩性電解質(zhì),裂解液中每25m L加入蛋白酶抑制劑(Roche Germany)一片),細(xì)胞裂解液Ⅰ(7 mol/LU rea,2 mol/L硫脲,2%CHAPS,40 mmol/L Tris,1%w/v D TT,0.8%p H3～10兩性電解質(zhì),裂解液中每25m L加入蛋白酶抑制劑一片)。氟康唑購(gòu)自法國(guó) PFIZER公司。CM 10蛋白質(zhì)芯片,PBSIIC型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)和Proteinchip Software 3.2.0分析軟件購(gòu)自美國(guó)Ciphergen Biosystem s公司。

1.3 體外耐藥誘導(dǎo) 挑取在SDA(沙堡瓊脂培養(yǎng)基)上培養(yǎng)的單個(gè)菌落的菌絲相馬爾尼菲青霉菌,用2m LSDB(沙氏液基)制成菌懸液,分別取1m L菌液接種于不含氟康唑和含8μg/mL氟康唑的30mL SDB中,放置25℃培養(yǎng)。挑取在SDA上培養(yǎng)的單個(gè)菌落的酵母相馬爾尼菲青霉菌,用2m L SDB制成菌懸液,分別取1m L菌液接種于不含氟康唑和含8μg/m L氟康唑的30m L SDB中,放置37℃培養(yǎng)。分別吸取含氟康唑和不含氟康唑SDB中培養(yǎng)7d的菌懸液,用2m L無(wú)菌生理鹽水在麥?zhǔn)媳葷醿x上調(diào)整濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?。分別用無(wú)菌棉拭蘸取制備的菌懸液均勻涂布在SDA培養(yǎng)基平皿上,待培養(yǎng)基表面干后,用無(wú)菌眼科鑷子鑷取氟康唑 E-test藥敏試紙條,置于平皿中央。菌絲相置25℃培養(yǎng),酵母相置37℃培養(yǎng)。48h后,抑菌環(huán)與試紙條刻度交界處既為受試菌株的M IC值。

1.4 菌體裂解蛋白制備 根據(jù)體外耐藥誘導(dǎo)的結(jié)果選取 PM 16和 PM 7菌株。挑取 PM 16菌株在25℃的SDA斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5d的菌絲相菌落,在2mL滅菌注射用水中用無(wú)菌棉拭子研磨成菌懸液,分別取1m L轉(zhuǎn)種于100 m L不含氟康唑和含8μg/m L氟康唑的100 m L SDB中,置25℃下培養(yǎng)。挑取PM 7菌株在37℃的SDA斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)5d的酵母相菌落,在2m L滅菌注射用水中用無(wú)菌棉拭子研磨成菌懸液,分別取1m L轉(zhuǎn)種于100 mL不含氟康唑和含8μg/m L氟康唑的100 m L SDB中,置37℃下培養(yǎng)。上述菌株培養(yǎng)7d以后,菌液用兩層濾紙以布氏漏斗,真空泵抽濾,經(jīng)雙蒸水充分洗滌,抽干水分。將收獲的菌體分別放入陶瓷研缽中,反復(fù)加液氮速凍后研磨成粉末。加入細(xì)胞裂解液I,快速混勻,冰上振蕩30min,12 000r/min 4℃離心90min,分離出上清,沉淀再用細(xì)胞裂解液 II振蕩混勻后12 000 r/min 4℃離心30min,取上清,2次分離上清混合,取少量用考馬斯亮藍(lán)染色法測(cè)定蛋白質(zhì)含量,其余分裝置-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 蛋白芯片上樣步驟 CM 10芯片裝入芯片處理器,每孔加入200μL芯片處理緩沖液(50mmol/L醋酸鈉,p H 4.0),置于振蕩器600 r/m in室溫振蕩5min,甩掉緩沖液。重復(fù)上述操作一次。在每孔中加入100μL處理好的樣品(加有 SPA(50%ACN+0.5%TFA)飽和溶液和 U 9(9mol/L尿素,2%CHAPS,1%D TT)緩沖液,蛋白質(zhì)上樣終濃度均為0.05μg/μL),以不含蛋白質(zhì)樣的U 9緩沖液做空白對(duì)照,600 r/min室溫振蕩60min,甩出樣品,每孔加入200μL芯片處理緩沖液,600 r/min振蕩5min,甩去孔中液體。再次加入200μL芯片處理緩沖液,重復(fù)1次。每孔加入 HEPES(1mmol/L,p H4.0)200μL,立刻甩出。盡快拆開(kāi)芯片處理器,取出芯片風(fēng)干后,立即在每孔加上 SPA飽和溶液0.5μL,待全干后,重復(fù)加SPA飽和溶液0.5μL。待全干后即可上機(jī)測(cè)定。

1.6 蛋白質(zhì)峰檢測(cè)和數(shù)據(jù)采集 采用 PBSIIC型蛋白質(zhì)芯片閱讀機(jī)讀取芯片數(shù)據(jù)。儀器用Ciphergen公司的加有A ll-in-one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP-20芯片作為外參照校正,系統(tǒng)的質(zhì)量偏差為0.1%。芯片檢測(cè)時(shí)芯片閱讀機(jī)設(shè)置如下:激光強(qiáng)度185,檢測(cè)敏感度為8,優(yōu)化分子量范圍3 000～10 000 Da,最高分子量50 000 Da,信號(hào)噪聲比(S/N)大于5為有效波峰。采用Ciphergen proteinchip 3.2.0和Biomark W izard軟件自動(dòng)采集分析數(shù)據(jù)。兩個(gè)蛋白質(zhì)譜比較時(shí),特異性蛋白質(zhì)界定為其蛋白質(zhì)峰在對(duì)應(yīng)的另一個(gè)蛋白質(zhì)譜上無(wú)與之相匹配的蛋白質(zhì)蜂,質(zhì)荷比(M/Z)范圍相差5%以上。兩個(gè)相同的蛋白質(zhì)峰比較時(shí),表達(dá)有差異的標(biāo)志蛋白定義為蛋白質(zhì)峰相對(duì)強(qiáng)度相差1倍以上。所有樣品均在不同時(shí)間

進(jìn)行重復(fù)測(cè)定兩次,以保證結(jié)果的可靠性。

2 結(jié) 果

2.1 菌株經(jīng)氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)后M IC值的變化 在體外25℃SDB中培養(yǎng),11株菌株的菌絲相均能耐受8μg/mL氟康唑生長(zhǎng)。在 25℃不含氟康唑的SDB中培養(yǎng)7d的馬爾尼菲青霉菌的 M IC值在0.064～8μg/mL 范圍 ,幾何平均值為 1.22μg/mL。在25℃含氟康唑的SDB中培養(yǎng)7d的馬爾尼菲青霉菌的 M IC值在 16～128μg/m L,幾何平均值為55.56μg/m L,比不加氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)的 M IC值明顯升高(表1),兩者統(tǒng)計(jì)學(xué)比較有顯著性差異(t=10.656,P=0.000)。11株菌株只有PM 7和PM 16的酵母相在37℃能耐受8μg/mL氟康唑生長(zhǎng),氟康唑誘導(dǎo)前后的 M IC值,PM 7分別為 2μg/mL和32μg/m L,PM 16分別為2μg/m L 和 16μg/m L。

2.2 菌絲相在氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)后的蛋白質(zhì)組差異PM 16菌株菌絲相在無(wú)氟康唑和含8μg/m L氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌絲體裂解總蛋白質(zhì)經(jīng)CM 10芯片檢測(cè),共檢測(cè)到74個(gè)蛋白質(zhì)峰。在氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌絲體中,其中16個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)為高表達(dá),4581.1 Da,6109.7Da蛋白質(zhì)特異性表達(dá)。(表2,圖1,圖2)

表1 25℃氟康唑(FLC)誘導(dǎo)培養(yǎng)前后馬爾尼菲青霉菌的M IC值 (μg/mL)Table 1 The M ICagainst P.m a rne f f ei beforeand after cultured with FLC at 25℃

表2 PM 16菌株菌絲相經(jīng)氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)后高表達(dá)的蛋白質(zhì)(Da)Table 2 Up-expressed proteins of mycelial form of isolate PM 16 after cultured with FLC

圖1 PM 16菌株菌絲相經(jīng)氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)后特異性表達(dá)的蛋白質(zhì)Fig.1 The specific expressed proteinsof mycelial form of isolate PM 16 cultured with FLC X-axis was molecular weight for each spectrum(M/Z values),and Y-axis was relative intensity,the arrow s from left to right indicate 4581.1Da and 6109.7 Da proteins respectively.A:before cultured with FLC;B:after cultured with FLC;C:blank control

圖2 PM 16菌株菌絲相經(jīng)氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)前后在7500～15000的蛋白質(zhì)譜Fig.2 The proteome between 7500 Da～15000Da of mycelial form of isolate PM 16 before and after cultured with FLC The arrow indicates 8511.1Da protein up-expressed.A:before cultured with FLC;B:after cultured with FLC;C:blank control

2.3 酵母相在氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)后的蛋白質(zhì)組差異

PM 7菌株在無(wú)氟康唑和含8μg/m L氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞體裂解總蛋白質(zhì)經(jīng)CM 10芯片檢測(cè),共檢測(cè)到74個(gè)蛋白質(zhì)峰。在氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)的細(xì)胞體中,3575.2 Da,8507.0Da,8563.3 Da蛋白質(zhì)特異性表達(dá),其中22個(gè)蛋白質(zhì)表現(xiàn)為高表達(dá)(表3,圖3,圖 4)。

表3 PM 7菌株酵母相經(jīng)氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)后高表達(dá)的蛋白質(zhì)(Da)Table 3 Up-expressed proteins of yeast form of isolate PM 7 after cultured with FLC

3 討 論

Supparatpinyo〔6〕與 Sar〔5〕的研究均顯示馬爾尼菲青霉菌對(duì)氟康唑的敏感性較其他抗真菌藥物低。馬爾尼菲青霉菌為雙相性真菌,哪個(gè)生長(zhǎng)相更能耐受氟康唑呢?臨床上氟康唑以常用劑量(成人400mg/d)給藥后,血藥峰濃度約為 6.5μg/m L,參考此血藥濃度本研究曾采用16μg/m L的氟康唑濃度進(jìn)行體外耐藥誘導(dǎo),菌株不能耐受生長(zhǎng),改選取8μg/m L的氟康唑濃度進(jìn)行體外耐藥誘導(dǎo),11株馬爾尼菲青霉菌在25℃均能耐受8μg/m L氟康唑生長(zhǎng),僅有2株菌能在 37℃耐受 8μg/m L氟康唑生長(zhǎng)。此外,菌絲相經(jīng)過(guò)8μg/m L氟康唑7d的誘導(dǎo)培養(yǎng),其M IC幾何平均值達(dá) 55.56μg/m L,已經(jīng)接近耐藥的臨界M IC值,有3株菌株的氟康唑M IC值均超過(guò)耐藥臨界M IC值(64μg/m L),這些說(shuō)明菌絲相比酵母相更能耐受氟康唑,亦提示菌絲相在8μg/m L氟康唑的誘導(dǎo)下容易在短期內(nèi)出現(xiàn)獲得性高耐藥性。從體外誘導(dǎo)耐藥情況看,仍有M IC值小于8μg/m L的敏感酵母相菌株能在含8μg/m L氟康唑的SDB中生長(zhǎng),且經(jīng)短期誘導(dǎo)培養(yǎng)后其M IC值亦迅速上升,提示在治療馬爾尼菲青霉菌感染時(shí),短期內(nèi)使用氟康唑可以見(jiàn)效,但有可能很快出現(xiàn)耐藥性導(dǎo)致最終治療失敗。Supparatpinyo臨床上觀察11例馬爾尼菲青霉菌感染患者使用氟康唑治療,7例患者治療失敗〔6〕,這些亦提示馬爾尼菲青霉菌在體內(nèi)對(duì)氟康唑的高耐藥性。本研究結(jié)果顯示體外馬爾尼菲青霉菌菌絲相對(duì)氟康唑的易產(chǎn)生誘導(dǎo)耐藥性,提示從菌絲相著手可能更容易發(fā)現(xiàn)雙相性真菌馬爾尼菲青霉菌耐氟康唑的調(diào)控機(jī)制。

馬爾尼菲青霉菌PM 16菌株菌絲相和PM 7菌株酵母相經(jīng)8μg/m L氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后,其氟康唑的M IC值增加最顯著,所以選取這兩株菌進(jìn)行誘導(dǎo)耐藥的蛋白質(zhì)組比較分析。氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)以后的菌絲相和酵母相都有蛋白質(zhì)特異性表達(dá),兩者不同,菌絲相表達(dá)4581.1Da和 6109.7Da蛋白質(zhì),酵母相表達(dá)3575.2Da、8507.0Da和8563.3 Da蛋白質(zhì),在高表達(dá)的蛋白質(zhì)譜中除2364.9Da、2921.1Da和3246.8Da相同外,其余高表達(dá)的蛋白質(zhì)不同。這些提示菌絲相和酵母相在對(duì)氟康唑的耐受機(jī)制方面有所不同,故菌絲相和酵母相在體外對(duì)氟康唑的耐受能力亦不同。氟康唑?yàn)殡p三唑類抗真菌藥,通過(guò)抑制真菌的細(xì)胞色素 P-450酶,阻滯羊毛甾醇向麥角固醇轉(zhuǎn)化,從而導(dǎo)致真菌細(xì)胞膜的損傷。白念珠菌耐氟康唑的機(jī)制可以通過(guò)幾種機(jī)制實(shí)現(xiàn),在這些機(jī)制中包括藥物作用靶酶高表達(dá)或變異、抗真菌藥物在真菌細(xì)胞內(nèi)聚集的減少及生物膜形成等,其中的重要機(jī)制是白念珠菌細(xì)胞膜上存在著多種外排泵,由于白念珠菌對(duì)藥物的外排,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物累積濃度的下降而使藥物治療失敗并產(chǎn)生了多重耐藥〔7-8〕。馬爾尼菲青霉菌對(duì)氟康唑耐受機(jī)制是否與白念珠菌相似,目前尚未見(jiàn)有關(guān)研究的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示即使對(duì)氟康唑敏感的菌株,其菌絲相在8μg/mL氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)后,氟康唑的M IC值迅速上升,之前的研究實(shí)驗(yàn)已報(bào)道在8μg/mL氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)下菌絲體可分泌紅色色素和67.5kDa蛋白質(zhì)〔9〕,蛋白質(zhì)芯片檢測(cè)的結(jié)果亦示氟康唑誘導(dǎo)后菌絲體有特異性蛋白質(zhì)表達(dá),這些特異性蛋白質(zhì)和紅色色素分泌是否相關(guān)值得進(jìn)一步研究。有研究采用雙向電泳技術(shù)分析馬爾尼菲青霉菌酵母相和菌絲相的蛋白質(zhì)表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)約有500個(gè)蛋白質(zhì)在酵母相和菌絲相表達(dá)有差異〔10〕,本研究采用SELD I技術(shù)分析示菌絲相和酵母相馬爾尼菲青霉菌經(jīng)氟康唑誘導(dǎo)培養(yǎng)后均有特異性蛋白質(zhì)表達(dá)和多蛋白質(zhì)表達(dá)的上調(diào),這些結(jié)果提示該菌對(duì)氟康唑的抵抗可能和某些特異性蛋白質(zhì)相關(guān)。

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A prelim inary proteome analysis on the fluconazole-resistan t strains of Penicillium marne f f ei

L IU Dong-hua,L IANGM ing,LUO Hong,TAN Sheng-shun
(Department of Dermatology,First A ffiliated Hospital of Guangxi M edical University,N anning 530021,China)

The co rrelated p ro teome of Penicillium m arneffei resistant to fluconazole was investigated in the p resent study,in which 11 strainsof P.m arneffei of both the mycelial and yeast form s sensitive to fluconazole were cultivated in Sabouraud’s liquid medium containing 8 g fluconazole and the M ICs of fluoconazile to P.marneffei before and after inducing cultures were tested by E-testmethod.The strainsof the mycelial and yeast form s showing the most significant increase in M IC value were selected and the protein clip CM 10 was used to detect the proteome differences before and after inducing cultures.It was found that 11 strains of themycelial form s and 2 strains of the yeast form s could tolerate the action of fluconazole and could grow at a drug concentration of 8μg/m L.Furthermore,the MICs of fluoconazole to the mycelial form s were significantly increased after 7 days of inducing culture and the geometric means of M ICs were increased from 1.22μg/mL to 55.56μg/mL.After the mycelial forms had been induced to be resistant,16 proteins were highly expressed with specific expression of the 4581.1 Da and 6109.7 Da proteins;w hereas 22 resistant yeast form were highly expressed with specific expression of the 3575.2 Da,8507.0 Da and 8563.3 Da proteins.These results suggest that the mycelial form of P.narnef fei seems to bemo re tolerant to the action of fluconazole than the yeast form.The resistance of these o rganism s to fluconazolemay be associated to some specific proteins.

Penicillium marnef fei;antifungal drug;drug resistance;proteome

R256.6

A

1002-2694(2010)01-0036-05

＊廣西青年科學(xué)基金(0542047)資助項(xiàng)目

1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科,南寧 530021

2.西安交通大學(xué)第二醫(yī)院皮膚科,Email:ldhys@sohu.com

2009-06-18;

2009-11-12