高明華,張志琰,李 躍,鄧慶華,諾 敏

布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室診斷研究進(jìn)展*

高明華,張志琰,李 躍,鄧慶華,諾 敏

布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的一種重要人獸共患病。根據(jù)致病性和宿主特異性,將布魯氏菌分為6個(gè)種19個(gè)生物型,即羊種布魯氏菌(B.meltensis)、牛種布魯氏菌(B.abortus)、豬種布魯氏菌(B.suis)、綿羊附睪種布魯氏菌(B.ovis)、犬種布魯氏菌(B.canis)和沙林鼠種布魯氏菌(B.neotomae)。另外,從海洋動(dòng)物中分離到在致病性和分子特征上有別于前6種的布魯氏菌,定為海洋種布魯氏菌(B.maris)。據(jù)中國(guó)CDC報(bào)告,2005-2008年全國(guó)布魯氏菌病新發(fā)病人分別為 18 416、19 013、21 901、30 002 例 ,人布魯氏菌病發(fā)生嚴(yán)重,形勢(shì)十分嚴(yán)峻。流行病學(xué)調(diào)查表明,感染來(lái)源主要是患布魯氏菌病的羊,其次是牛及其它動(dòng)物。因此加強(qiáng)對(duì)動(dòng)物布魯氏菌病的檢疫監(jiān)測(cè)力度十分重要。本文就布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展作一綜述。

1 免疫學(xué)診斷技術(shù)

1.1 血清凝集性試驗(yàn) 布魯氏菌病傳統(tǒng)檢測(cè)方法有血清凝集試驗(yàn)、全乳環(huán)狀試驗(yàn)(MRT)和抗人免疫球蛋白試驗(yàn)(Coomb's)等。經(jīng)典血清凝集試驗(yàn)包括標(biāo)準(zhǔn)試管凝集試驗(yàn)(SAT)和平板凝集試驗(yàn)(PAT)等在發(fā)達(dá)國(guó)家已基本上停止使用,取代方法是緩沖布魯氏菌抗原試驗(yàn),如虎紅平板凝集試驗(yàn)(RBT)等?；⒓t平板凝集抗原是用抗原性良好的布魯氏菌株經(jīng)培養(yǎng)、滅活、離心后用虎紅染色液染色,懸浮于乳酸緩沖液中制成。RBT特異、敏感、價(jià)廉、操作簡(jiǎn)便,在國(guó)際貿(mào)易中,緩沖布魯氏菌抗原試驗(yàn)是牛、羊、豬種布魯氏菌病的指定試驗(yàn)。在我國(guó),RBT也用于人布魯氏菌病的監(jiān)測(cè)的初篩試驗(yàn)。乳牛MRT依然是乳牛布魯氏菌病監(jiān)測(cè)的主要方法。由于凝集性試驗(yàn)是基于檢測(cè)針對(duì)布魯氏菌多糖O-鏈的抗體,因此會(huì)與有類似多糖O-鏈的細(xì)菌如耶爾森氏菌O∶9等出現(xiàn)交叉反應(yīng)。

1.2 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(CFT) CFT至今仍是布魯氏菌病診斷的重要方法,是牛、羊及綿羊附睪種布魯氏菌病國(guó)際貿(mào)易指定試驗(yàn),并作為確診用。Adone等〔1〕以無(wú)抗補(bǔ)體活性的羊種布魯氏菌B115 R型菌株為抗原建立檢測(cè)抗體的CFT(B115-CFT),并通過(guò)對(duì)RB51免疫的牛和水牛、綿羊附睪種布魯氏菌感染的羊和犬種布魯氏菌感染的犬血清中R型抗體進(jìn)行檢測(cè)表明,B115-CFT與RB51-CFT和HSE(布魯氏菌熱鹽抽提物)-CFT相比,具有很高的敏感性和特異性。由于豬的補(bǔ)體會(huì)干擾豚鼠補(bǔ)體的作用,導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的敏感性降低38%～40%,因而CFT不適合豬種布魯氏菌病的檢測(cè)。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) ELISA是一種與CF T效果相當(dāng)?shù)姆椒?操作更方便,既可以作為確定檢測(cè),又可以作為篩選和鑒別用。但只有用于牛布魯氏菌病的ELISA是國(guó)際貿(mào)易指定的,這種ELISA方法不僅用于血清學(xué)診斷,還可用于乳汁檢查〔2〕。用于其他種布魯氏菌病檢測(cè)的ELISA方法也是研究的熱點(diǎn)。Fel＇dsherova等〔3〕應(yīng)用鼠抗流產(chǎn)布魯氏菌脂多糖(LPS)的單克隆抗體建立了用于牛種布魯氏菌、羊種布魯氏菌和豬種布魯氏菌鑒定的ELISA,該法具有高度的特異性和敏感性,同時(shí)不與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O∶3、O∶9及鼠傷寒沙門氏菌和土拉熱弗朗西斯氏菌反應(yīng)。檢測(cè)抗原的最低濃度可達(dá)0.05-0.1 ng/mL。Nielsen等〔4〕應(yīng)用抗牛種布魯氏菌S1119.3株S-LPS的O糖鏈(OPS)共同抗原表位且不與蛋白A/G結(jié)合的特異性單克隆抗體建立了第二代競(jìng)爭(zhēng)ELISA(CELISA),該方法通過(guò)單克隆抗體與牛被檢血清中的抗體與S-LPS的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,用酶標(biāo)蛋白A/G顯色來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。方法特異、敏感,并能區(qū)分牛種布魯氏菌S19疫苗株免疫。Cakan等〔5〕應(yīng)用商品化布魯氏菌病IgG ELISA和IgM ELISA試劑盒對(duì)人布魯氏菌病進(jìn)行檢測(cè)表明,當(dāng)IgG ELISA和IgM ELISA同時(shí)應(yīng)用時(shí),對(duì)于疾病的診斷具有很高的敏感性。ELISA的效果關(guān)鍵在于抗原的選用。標(biāo)準(zhǔn)化牛種布魯氏菌病ELISA檢測(cè)方法使用了S-LPS抗原。

1.4 免疫組化法(Immunochemistry) Ilhan等〔6〕應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)了羊種布魯氏菌抗原在流產(chǎn)胎兒組織中的存在與分布情況。在110份流產(chǎn)胎兒樣本中檢出抗原的有33份(占30%)。33份陽(yáng)性樣本中檢測(cè)到抗原的,肺25份(占 22.7%),肝 21份(占19%),脾13份(占 11.8%),腎 6份(占5.4%)?？乖饕挥诜尉奘杉?xì)胞和中性粒細(xì)胞及肝枯否氏細(xì)胞的細(xì)胞膜上。結(jié)果證明,免疫組化法可用于羊種布魯氏菌引起的綿羊流產(chǎn)福爾馬林固定樣本的檢測(cè)。

1.5 膠體金免疫層析檢測(cè)技術(shù)(GICA) Kim等〔7〕用犬種布魯氏菌的抽提物作為檢測(cè)抗原建立了檢測(cè)犬血清布魯氏菌病抗體的GICA。分別用血液培養(yǎng)、2-巰基乙醇快速篩選凝集試驗(yàn)(2-ME RSAT)和GICA對(duì)發(fā)生布魯氏菌病的10個(gè)不同圈舍的犬群進(jìn)行檢測(cè),陽(yáng)性率分別為24.8%,39.5%和39.1%,2-ME RSAT和GICA之間的κ值為0.89。結(jié)果表明GICA與常規(guī)的凝集試驗(yàn)和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)具有同樣的敏感性和特異性。朱明東等〔8〕建立了診斷牛布魯氏菌病的GICA,通過(guò)對(duì)布魯氏菌病病牛和健康牛不同血清用量的測(cè)試,確定GICA診斷牛布魯氏菌病最佳血清用量為10μ L,檢測(cè)敏感性和特異性分別達(dá)到91.3%和 97.3%,Youden指數(shù)為0.886;GICA、斑點(diǎn)免疫金滲濾法(DIGFA)及SAT檢測(cè)結(jié)果比較三者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)果表明,GICA診斷牛布魯氏菌病,不僅具有試劑敏感、特異,且血清用量少,操作簡(jiǎn)便快速,適合于布魯氏菌病的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。朱明東等〔9〕還采用 GICA、DIGFA和 SAT對(duì)不同流行區(qū)布魯氏菌病人群抗體平行檢測(cè)。結(jié)果重流行區(qū)、監(jiān)測(cè)地區(qū)和非疫區(qū)人群抗體陽(yáng)性率,3種方法之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);GICA和SAT平行檢測(cè)布魯氏菌病重疫區(qū)人群抗體陽(yáng)性符合率為94.2%。GICA和SAT平行檢測(cè)布魯氏菌病非疫區(qū)人群抗體陰性符合率為99.6%。GICA檢測(cè)不同疫區(qū)之間人群抗體陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。說(shuō)明GICA不僅能及時(shí)快速發(fā)現(xiàn)患者,而且可監(jiān)測(cè)疫情,反映流行程度,在布魯氏菌病不同流行區(qū)具有較好的推廣應(yīng)用前景。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)——PCR及其衍生技術(shù)

PCR是布魯氏菌病分子生物學(xué)檢測(cè)和病原分型的重要手段,同時(shí)也是當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。早在1994年,Bricker等〔10〕根據(jù)布魯氏菌染色體中的遺傳成分IS711種特異性定位引起的多態(tài)現(xiàn)象就建立PCR檢測(cè)方法,并根據(jù)在距IS711不同距離的引物雜交擴(kuò)增產(chǎn)物大小來(lái)進(jìn)行種型鑒定,能將布魯氏菌牛種(1 、2、4 型)、羊種(1 、2、3 型)、豬種(1 型)、綿羊附睪種區(qū)分鑒別,并將該方法稱為AMOS(abortus,melitensis,ovis,suis)PCR。后來(lái)他們改進(jìn)了AMOS PCR,使之可以鑒別 S19和 RB51〔11〕。2003年Bricker等〔12〕在原有的基礎(chǔ)上又改進(jìn)了AMOS PCR,建立了 Bass(brucella abortus species-specific)PCR,能從布魯氏菌疫苗株、其他種布魯氏菌和非布魯氏菌中區(qū)別牛種布魯氏菌流行株(1、2、4型),是牛種布魯氏菌篩選的一種可信賴方法。Ocampo等〔13〕通過(guò)AMOS-ERY PCR 和以IS711為探針的Southern blot雜交發(fā)現(xiàn),牛3型除有牛3a外,還有牛3b生物型,進(jìn)而用IS711 AMOS作為引物擴(kuò)增出長(zhǎng)1.7kb產(chǎn)物,可以鑒別出牛3b型、牛5、牛6和牛9型。Whatmore等〔14〕利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度多態(tài)性可以將布魯氏菌牛種、羊種、沙林鼠種、犬種、豬種、綿羊附睪種以及海洋種布魯氏菌區(qū)別開(kāi)來(lái)。Fayazi等〔15〕用一個(gè)長(zhǎng)度為 25bp的引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增后豬種菌得到420bp產(chǎn)物,牛種菌得到420bp和650bp 2個(gè)條帶,從而將豬種和牛種布魯氏菌鑒別開(kāi)。Cloeckaert等〔16〕應(yīng)用 PCR擴(kuò)增 bp26基因得到1 029 bp和1 900 bp,其中1 029 bp為布魯氏菌6個(gè)種共有的產(chǎn)物,1 900 bp為海洋種布魯氏菌所特有。2001年,Cloeckaert等〔17〕又發(fā)現(xiàn)利用omp2基因的多態(tài)性也可以將海洋種與其他布魯氏菌區(qū)分開(kāi)。Redkar等〔18〕應(yīng)用 Real-Time PCR鑒別了布魯氏菌的牛、羊、豬 3個(gè)種。Probert等〔19〕也用RT-PCR技術(shù)鑒別牛種、羊種和其他種布魯氏菌。Hinic等〔20〕建立的即可常規(guī)操作又可 Real-Time PCR的PCR新方法,特異性強(qiáng),可鑒別6個(gè)種的布魯氏菌。Vladyslava等〔21〕應(yīng)用 PCR可以鑒別布魯氏菌的6個(gè)種,并能將豬4型單獨(dú)鑒別出來(lái)。López等〔22〕建立了一種多重PCR實(shí)驗(yàn)(階梯法),7個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)對(duì)來(lái)自不同動(dòng)物和不同地區(qū)的625個(gè)布魯氏菌株的檢測(cè)表明,一步法可以鑒別古典布魯氏菌種,包括海洋種及疫苗株S19、RB51和Rev.1。

Garcia等〔23〕用 DdeⅠ消化omp31b基因擴(kuò)增產(chǎn)物做PCR-RFLP,通過(guò)對(duì)37株代表所有種和型的參考株和野毒株分析,可在種水平上鑒別牛種、羊種和綿羊附睪種布魯氏菌。Le等〔24〕應(yīng)用多位點(diǎn)可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)分析(MLVA)方法,使用MLVA-15可以對(duì)布魯氏菌屬21個(gè)菌株進(jìn)行分型,并認(rèn)為MLVA-15可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)分型方法進(jìn)行種、型鑒定。Whatmore等〔25〕依據(jù)21個(gè)可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)片段(VNTR)基因座(包括8個(gè)已報(bào)告的和13個(gè)以前未報(bào)告的)建立的分子亞類鑒定方法——VNT R方法,通過(guò)對(duì)來(lái)自世界各地的121株布魯氏菌進(jìn)行檢測(cè)證明,VNTR是一種好的分型方法,并可用于流行病學(xué)追蹤和菌株親緣關(guān)系確定。王遠(yuǎn)志等〔26〕利用高變8聚核苷酸DNA指紋技術(shù)(HOOF-Prints)對(duì)綿羊種布魯氏菌019株VNTR的8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析,可鑒定該菌株,并有望彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法之不足。

Ohtsuki等〔27〕根據(jù)流產(chǎn)布魯氏菌 BCSP31株的基因序列設(shè)計(jì)兩組用于6個(gè)種布魯氏菌鑒別的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)的特異性引物,通過(guò)對(duì)6個(gè)種22株布魯氏菌和18個(gè)種28株非布魯氏菌的檢測(cè)表明,對(duì)布魯氏菌的檢測(cè)具有特異性(35min,63℃)和敏感性(10fg基因組DNA)。另外該方法還可用于污染牛奶和感染鼠器官中菌體DNA的檢測(cè)。Montagnaro等〔28〕應(yīng)用牛種布魯氏菌 O-LPS與FITC結(jié)合作示蹤劑建立了熒光偏振試驗(yàn)(FPA),通過(guò)對(duì)890份水牛血清(CFT檢測(cè),526份為陽(yáng)性,364份為陰性)進(jìn)行RBT和FPA的平行檢測(cè),與CFT相比,敏感性分別為84.5%和92.6%,特異性分別為93.1%和 91.2%,檢測(cè)結(jié)果表明,FPA與CFT檢測(cè)效果相當(dāng)可以替代RBT,并且具有可靠、高通量、易操作,適于野外血清抗體調(diào)查。

3 結(jié) 語(yǔ)

目前傳統(tǒng)的檢測(cè)方法,如 SAT、PAT、RBT、MRT、Coomb's、CFT等仍然是國(guó)際貿(mào)易和許多發(fā)展中國(guó)家進(jìn)行布魯氏菌病檢疫、監(jiān)測(cè)的重要方法。間接 ELISA、CELISA、IgG ELISA和 IgM ELISA等方法敏感、特異,可用于血清抗體效價(jià)的檢測(cè),野毒株的分型、自然感染與疫苗免疫的鑒別,并可用于大樣本檢測(cè)。免疫組化在組織中檢查病原及分布有其優(yōu)點(diǎn)。GICA雖然不如CFT和ELISA敏感、特異,但操作方便,結(jié)果易于判斷,適合臨床調(diào)查和疫病普查。以PCR為代表的分子生物學(xué)技術(shù)不僅用于布魯氏菌種的鑒定,還因其能反映基因間存在的差異,因此可在基因水平上進(jìn)行分型和疫苗株鑒定。未來(lái)的方向是研制簡(jiǎn)單、特異、敏感,適合于野外和實(shí)驗(yàn)室大樣本操作的血清抗體監(jiān)測(cè)、病原檢測(cè)及核酸檢測(cè)方法。并以此為基礎(chǔ),在布魯氏菌病較為嚴(yán)重的國(guó)家建立綜合防控體系,加強(qiáng)動(dòng)物布魯氏菌病檢疫監(jiān)督和凈化,從源頭上控制人的布魯氏菌病。

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R516.7

A

1002-2694(2010)01-0081-03

*內(nèi)蒙古自治區(qū)高等學(xué)校研究項(xiàng)目(NJzy08165)

呼倫貝爾學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院,呼倫貝爾 021008

2008-12-12;

2009-03-25