許煒茹，林洪生，陳信義，張英

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京 100053;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

人乳腺癌干細(xì)胞異種移植動(dòng)物模型的制備和應(yīng)用

許煒茹1，2，林洪生1，陳信義2，張英1

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院 廣安門醫(yī)院腫瘤科，北京 100053;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

越來越多的證據(jù)顯示乳腺癌干細(xì)胞是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。因此，模擬出與人乳腺癌發(fā)病機(jī)制相似的動(dòng)物模型將對(duì)乳腺癌的治療起著至關(guān)重要的作用。本文旨在介紹乳腺癌干細(xì)胞異種移植動(dòng)物模型的制備方法、應(yīng)用以及近年來的研究進(jìn)展。

乳腺癌;干細(xì)胞;動(dòng)物

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈迅速上升趨勢(shì)，在女性各類腫瘤中居首位［1］。乳腺癌的預(yù)防、診斷和治療已經(jīng)成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。近些年，隨著干細(xì)胞理論研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)表明腫瘤中存在一小群腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell)，它們具有自我更新及形成腫瘤的各種不同譜系細(xì)胞的能力，它們是導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生以及腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。因此，如何能針對(duì)腫瘤干細(xì)胞而研制出有效的藥物才能從根本上戰(zhàn)勝癌癥。目前建立了乳腺癌干細(xì)胞異種移植的動(dòng)物模型，但是這種模型還處于初級(jí)階段，有些腫瘤干細(xì)胞的成瘤率還不盡人意，并且近些年的研究也僅局限于乳腺原位接種成瘤。因此，如何能模擬出與人乳腺癌發(fā)病機(jī)制相似的動(dòng)物模型是亟待解決的問題，以便提供有價(jià)值的動(dòng)物模型來尋求更好的治療策略。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

人乳腺癌細(xì)胞異種移植要求都是免疫缺陷的動(dòng)物模型，故人體腫瘤異種移植時(shí)無排斥反應(yīng)，移植后的人體腫瘤保持其原有的組織形態(tài)，免疫學(xué)特點(diǎn)以及特有的染色體組型和對(duì)抗腫瘤藥的原有敏感性。常選用的動(dòng)物主要有重癥聯(lián)合免疫缺陷(severe combined immunodeficient，SCID)小鼠、非肥胖型糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(nonobese diabetic/severe combined immunodeficient，NOD/SCID)小鼠、裸鼠。

Bosma等［2］首次在 C.B-17Icr小鼠中發(fā)現(xiàn)單個(gè)隱性突變基因(scid基因)，純合 scid基因?qū)е?T、B淋巴細(xì)胞不能分化為特異性功能淋巴細(xì)胞，此突變型小鼠即SCID小鼠。該品系小鼠T、B淋巴細(xì)胞功能缺陷，NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能正常。此外，文獻(xiàn)報(bào)道2%～23%的SCID小鼠出現(xiàn)淋巴細(xì)胞免疫功能恢復(fù)(滲漏現(xiàn)象)［3］，故該品系的小鼠仍可對(duì)移植物產(chǎn)生一定的免疫排斥反應(yīng)［4］，因此影響了 SCID小鼠的更廣泛應(yīng)用。

Jackson實(shí)驗(yàn)室將非肥胖糖尿病小鼠NOD/Lt與SCID小鼠雜交后獲得 NOD/SCID小鼠［5］。該品系小鼠保留了 SCID小鼠 T、B淋巴細(xì)胞缺陷的特點(diǎn)，同時(shí)還具有 NK細(xì)胞活性低、抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell，APC)功能缺陷的特征。此外，NOD/SCID小鼠滲漏現(xiàn)象少。鑒于 NOD/SCID小鼠具有多種先天和獲得性免疫缺陷，不易發(fā)生免疫逃逸，其異種移植成功率較SCID小鼠明顯提高。并且裸鼠體內(nèi)雌激素(E2)、孕激素水平均較NOD/SCID小鼠低［6］，對(duì)于乳腺癌這種激素依賴性的腫瘤來說，高激素水平的NOD/SCID小鼠更適合其腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此NOD/SCID小鼠在人乳腺癌干細(xì)胞成瘤模型中最為常用。但是，NOD/SCID小鼠胸腺淋巴瘤的發(fā)生率較高，在SPF條件下平均壽命僅有8.5個(gè)月［7］，生存時(shí)間較 SCID鼠短，這限制了移植瘤的長(zhǎng)期研究。

裸鼠即純合子nu/nu基因突變小鼠，全身形似無毛，呈裸體狀，無胸腺，T淋巴細(xì)胞功能缺陷，對(duì)體外移植物的免疫排斥反應(yīng)較低［8］。但其免疫缺陷程度沒有SCID和NOD/SCID小鼠重，故在腫瘤干細(xì)胞異種移植的成瘤動(dòng)物模型中沒有前兩者常用。但是異種移植接種的部位都是在乳腺原位，而裸鼠無毛易于接種;人乳腺癌干細(xì)胞異種移植接種的細(xì)胞數(shù)量級(jí)很低，成瘤時(shí)間較長(zhǎng)，裸鼠無毛的特點(diǎn)也易于動(dòng)態(tài)觀察腫瘤的生長(zhǎng)狀態(tài);并且裸鼠較SCID和NOD/SCID小鼠價(jià)格便宜。

總的來說，這三種小鼠用于異種移植成瘤模型各有利弊，還需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的具體要求選擇合適的小鼠。

2 原位乳腺癌干細(xì)胞異種移植常用的制備方法

2.1 異種移植前小鼠的準(zhǔn)備

2.1.1 人源化小鼠的乳腺:在移植乳腺癌干細(xì)胞之前使移植的小鼠乳腺人源化能利于人乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［9］。小鼠乳腺在青春前期被清除，并且注射一種被放射過的和未被放射過的人成纖維細(xì)胞混合物。放射過的人成纖維細(xì)胞(4Gy)能分泌各種生長(zhǎng)因子、膠原，因此能支持正常細(xì)胞和癌上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)［10-11］。此種動(dòng)物模型的建立曾被 Kuperwasser等［12］用于正常乳腺上皮細(xì)胞的移植。永生的成纖維細(xì)胞是將原代的人乳腺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒而表達(dá)端粒末端轉(zhuǎn)移酶。乳腺癌干細(xì)胞在人源化的乳腺建立2～4周后再移植至小鼠的乳腺內(nèi)。

2.1.2 降低小鼠的免疫力:極低數(shù)量級(jí)的人乳腺癌干細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi)仍然能存活，而并沒有因?yàn)樾∈笞陨淼拿庖吡Χ磺宄?。Al-Hajj等［13］利用化療藥物依托泊苷腹腔注射入移植前的小鼠體內(nèi)，使NOD/SCID小鼠的免疫力進(jìn)一步下降從而有利于干細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.1.3 提高小鼠體內(nèi)的E2水平:E2受體陽性的人乳腺癌細(xì)胞異種移植后需要給小鼠補(bǔ)充一定量的E2，常用60 d緩釋的 0.72 mg的 17β-E2片，或每隔10 d，每只小鼠皮下注射0.4 mg/kg E［14］2，使小鼠血清E2保持在一定的水平。但是，E2促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的同時(shí)，也帶來了副作用。其中腎損傷和膀胱結(jié)石是導(dǎo)致小鼠死亡的主要原因。因此，E2如何能促使乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)還能盡可能減少對(duì)小鼠的損傷是急需解決的難題。Kang等［15］報(bào)道90 d緩釋的0.18 mg低劑量的17β-E2緩釋片不僅能促進(jìn)乳腺腫瘤的生長(zhǎng)，并且埋這種緩釋片小鼠的死亡率顯著下降。故在今后的乳腺癌干細(xì)胞異種移植成瘤實(shí)驗(yàn)中可以嘗試應(yīng)用。此外，除了E2受體陰性的人乳腺癌細(xì)胞異種移植后的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移也依賴于 E2。研究發(fā)現(xiàn)藥理學(xué)濃度的17β-E2可以抑制裸鼠的 NK細(xì)胞活性，給移植E2受體陰性腫瘤的裸鼠一定量的E2可以促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移［8］。因此，無論是 E2受體陰性或是陽性的人乳腺癌干細(xì)胞異種移植時(shí)均可給予E2以提高成瘤率。

2.2 細(xì)胞的制備—基質(zhì)膠

乳腺癌干細(xì)胞異種移植時(shí)通常將干細(xì)胞懸液混合一定的基質(zhì)膠以提高成瘤率，混合的比例通常為1∶1?；|(zhì)膠是由層粘連蛋白、IV型膠原纖維、硫酸乙酰肝素和巢蛋白組成的混合物，在4℃為液體，而在37℃則聚合形成一種凝膠［16-17］。基質(zhì)膠混合物增加異種移植瘤的成活率可能是因?yàn)樗苄纬梢粋€(gè)有效的屏障，使腫瘤細(xì)胞免于局部免疫效應(yīng)細(xì)胞的攻擊。此外，基質(zhì)膠也提供一個(gè)自然的結(jié)構(gòu)或立體空間，使瘤細(xì)胞接近一些粘附分子或促有絲分裂分子，如層粘連蛋白、纖維連接蛋白和 IV型膠原纖維［8］。

3 異種移植的動(dòng)物模型

3.1 原位成瘤動(dòng)物模型

目前，乳腺癌干細(xì)胞異種移植的動(dòng)物模型分為原代移植和細(xì)胞系移植。2003年 AL-Hajj等［13］首次分離出了實(shí)體腫瘤干細(xì)胞，他們從乳腺癌患者的惡性胸腔積液分離出一類表型為 CD44+CD24－/lowESA+的癌細(xì)胞，僅約200個(gè)細(xì)胞即可在免疫缺陷小鼠中形成腫瘤，成瘤率為100%。乳腺癌細(xì)胞系也廣泛應(yīng)用于異種移植的動(dòng)物模型中，如常用的乳腺細(xì)胞系MCF-7，MDA-MB-231。但是，有些細(xì)胞系中尚未被發(fā)現(xiàn)乳腺癌干細(xì)胞。

乳腺癌干細(xì)胞異種移植常接種于小鼠的乳脂墊(mammary fat pad)［9，13-14，18］。如 Al-Hajj 等［13］成 功將CD44+CD24－/lowESA+乳腺癌干細(xì)胞接種于NOD/SCID小鼠的乳脂墊內(nèi)并形成腫瘤。Price等［19］曾對(duì)比皮下接種和乳脂墊接種的差異。該研究利用細(xì)胞株 MDA-MB-231和 MDA-MB-435分別進(jìn)行皮下注射接種和乳脂墊接種。結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳脂墊接種后的成瘤率為100%，而皮下途徑為40%，并且乳脂墊接種后轉(zhuǎn)移率也提高。因此，這種原位移植不僅可以提高乳腺癌細(xì)胞的成瘤率而且可以增加轉(zhuǎn)移的發(fā)生率。

3.2 乳腺癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型

Croker等［20］通過鼠尾靜脈分別注射人乳腺癌細(xì)胞系的干細(xì)胞 ALDHhiCD44+CD24－，發(fā)現(xiàn)注射MDA-MB-231、MDA-MB-468細(xì)胞系的NOD/SCID小鼠分別在5～7周和12周后會(huì)出現(xiàn)肺和其他器官的轉(zhuǎn)移灶。目前，乳腺癌干細(xì)胞的標(biāo)志物還在繼續(xù)摸索之中，所以研究的熱點(diǎn)主要集中在原位異種移植，而乳腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立還非常少。Croker等建立的乳腺癌轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型，為乳腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型的建立奠定了良好的基礎(chǔ)，今后的研究應(yīng)從乳腺癌細(xì)胞系的干細(xì)胞逐漸向原代乳腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移，從而真正建立乳腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型。

4 結(jié)語

同大多數(shù)實(shí)體瘤一樣，乳腺癌患者死亡的主要原因是轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞最難復(fù)制的特性［21］。而腫瘤干細(xì)胞目前被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源，因此如何能利用腫瘤干細(xì)胞的這種特點(diǎn)模擬出腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是當(dāng)前亟待解決的難題。本文介紹了近年來乳腺癌干細(xì)胞異種移植動(dòng)物模型的建立，但是目前研究水平有限，有些低數(shù)量級(jí)的乳腺癌干細(xì)胞的成瘤率還較低，不足以模擬出人體內(nèi)的乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。這種低成瘤率也限制了對(duì)乳腺癌干細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的藥物學(xué)研究。并且目前的研究還僅限于乳腺原位的異種移植，極少涉及乳腺癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型的建立。因此，今后的研究可以進(jìn)一步探索乳腺癌轉(zhuǎn)移模型的建立。

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Establishment and Application of Animal Models of Xenotransplantation of Human Breast Cancer Stem Cells

XU Wei-ru1，2，LIN Hong-sheng1，CHEN Xin-yi2，ZHANG ying1
(1.Oncology Department，Guang’anmen Hospital，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100053，China;2.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Accumulating evidence shows that breast cancer stem cells are the origin of carcinogenesis，tumor progression，relapse and metastasis.Therefore animal models simulating similar pathogenesis of human breast cancer will play an important role in the research on treatment of breast cancer.This review aims to introduce the method，application and progress of in research on animal models of human breast cancer stem cells.

Breast cancer;Stem cell;Animal

R737.9，332

A

1005-4847(2010)05-0429-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2010.05.16

2010-03-08

國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):30772867)。

許煒茹(1983－)，女，北京中醫(yī)藥大學(xué)，2008級(jí)博士研究生。

林洪生(1949－)，女，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。Tel:010-88001192，E-mail:drlinhongsheng@163.com