王 哲，魏 利，馬 放，趙 光，張 斯

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150090，wangzhe7013@126.com)

苯胺廢水來源范圍廣，污染危害大，化學(xué)工業(yè)、染料制造業(yè)、醫(yī)藥用品業(yè)的生產(chǎn)和應(yīng)用過程中均排放苯胺廢水［1］.苯胺的大量生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用，對環(huán)境造成了污染，也給人體帶來了危害［2］.目前，常用的處理苯胺廢水的方法主要有溶劑萃取法、吸附法、濕式氧化法、光催化氧化法、超臨界氧化、反滲透法以及生物法等［3］.生物法處理苯胺廢水具有能耗低、二次污染小、處理效果好等優(yōu)點(diǎn)［4-6］.為了提高生化法對廢水中苯胺的處理效果，分離和篩選高效的降解菌株是十分必要的.要想使分離和篩選出的菌株能夠在系統(tǒng)中穩(wěn)定存在，并發(fā)揮較好作用，生物強(qiáng)化技術(shù)得到了國內(nèi)外研究者的關(guān)注［7-9］.山丹等［10］采用生物強(qiáng)化的方法將實(shí)驗(yàn)室篩選的高效低溫苯胺降解菌JH-9投加到SBR反應(yīng)系統(tǒng)中，在低溫條件下(12℃)實(shí)現(xiàn)了苯胺廢水有效降解，針對含有苯胺174 mg/L的石化廢水，強(qiáng)化系統(tǒng)對苯胺的去除率達(dá)到97.8%.

本研究主要進(jìn)行了室溫條件下苯胺廢水SBR工藝研究，采用高效苯胺降解菌進(jìn)行生物強(qiáng)化，考察了苯胺的去除效率，并應(yīng)用分子生物學(xué)方法對反應(yīng)器中的種群演替規(guī)律進(jìn)行了研究，為苯胺廢水生物強(qiáng)化技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用提供重要理論基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)裝置與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來源

實(shí)驗(yàn)所用菌株是實(shí)驗(yàn)室保存的高效苯胺降解菌［11］.

1.1.2 污泥來源

實(shí)驗(yàn)所用污泥取自哈爾濱太平污水處理廠曝氣池.

1.1.3 廢水水質(zhì)

反應(yīng)器采用人工配水:葡萄糖 0.5 g/L; NH4Cl 0.025 g/L;KH2PO4、K2HPO40.005 g/L; CaCl20.042 g/L;MgSO4·7H2O 0.06 g/L;NaHCO30.13 g/L;微量元素溶液(1 mL/L);一定比例濃度的苯胺儲(chǔ)備液(10 g/L);調(diào)pH為7.0.

1.2 水質(zhì)分析方法

主要參考國家環(huán)境保護(hù)總局水與廢水監(jiān)測分析方法［12］.COD:CL-12型化學(xué)需氧量速測儀;苯胺:納氏試劑分光光度法;硝態(tài)氮:麝香草酚分光光度法;亞硝態(tài)氮:N-(1-萘基)-乙二胺光度法;pH:pH計(jì).

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置

本試驗(yàn)SBR反應(yīng)器為圓柱形有機(jī)玻璃容器，總體積2L.裝置結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 試驗(yàn)裝置示意圖

1.4 反應(yīng)器運(yùn)行方式

反應(yīng)周期12 h，其中反應(yīng)10 h，靜止2 h，25℃，每周期排水量為總水量的4/5，反應(yīng)器中加入有效體積1/5的活性污泥.實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行了16個(gè)周期.分別檢測每周期進(jìn)水和出水中苯胺、氨氮、亞硝態(tài)氮、硝態(tài)氮、COD的質(zhì)量濃度，計(jì)算去除率.

1.5 生物強(qiáng)化方法

采用的生物強(qiáng)化方法為直接投加對目標(biāo)污染物具有特效降解能力的微生物.生物強(qiáng)化所用菌株為從吉林化工廠污水廠曝氣池的活性污泥樣品中分離得到的一株能夠利用苯胺作為唯一碳源、氮源和能源生長的細(xì)菌JH-9，鑒定為Acinetobacter-calcoaceticus［11］.將實(shí)驗(yàn)室保存的高效苯胺降解菌JH-9進(jìn)行活化，制成菌懸液，再進(jìn)行離心，然后將離心后的菌懸液固定于活性污泥上，進(jìn)行生物強(qiáng)化，從而進(jìn)行SBR小試.

1.6 PCR－DGGE操作方法

污水細(xì)菌基因組總DNA的提取:將前處理后的樣品加入PBS buffer充分旋渦，收集沉淀，重復(fù)此過程兩次，降低DNA提取的影響背景.預(yù)處理后的樣品，通過華舜細(xì)菌DNA小量提取試劑盒進(jìn)行提取，提取后低溫(-20℃)保存.PCR-DGGE的引 物 為 F338GC:(5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3’)，R518:(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’).PCR反應(yīng)條件:采用降落式PCR擴(kuò)增策略，95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃最終延伸15 min，PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

變性梯度凝膠電泳(DGGE)采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離.使用梯度混合裝置，制備6% ～12%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從30% ～60%和40%～60%(100%的變性劑為7 mol/L的尿素和40%的去離子甲酰胺的混合物).純化后的PCR樣品6 μL和上樣緩沖液6 μL混合后加入上樣孔.儀器溫度設(shè)定為60℃，110 V的電壓下，電泳時(shí)間9 h.電泳結(jié)束后，將凝膠進(jìn)行銀染.染色后的凝膠用Image Scanner II透射掃描儀掃描后保存.

2 結(jié)果與討論

2.1 生物強(qiáng)化系統(tǒng)對苯胺的去除能力

對生物強(qiáng)化系統(tǒng)苯胺的去除能力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖2所示.由圖2可以看出，由于運(yùn)行初期的吸附作用，第1周期出水中苯胺質(zhì)量濃度較低;第2周期被活性污泥吸附的苯胺被釋放，出水中苯胺質(zhì)量濃度較第1周期明顯要高.前5個(gè)周期苯胺去除率基本維持在30%左右，主要原因?yàn)楸桨方到饩鳛閱我痪N，適應(yīng)活性污泥穩(wěn)定系統(tǒng)新環(huán)境的能力較差.從第5周期開始，混合系統(tǒng)運(yùn)行開始趨于穩(wěn)定，對苯胺去除率顯著上升，在第7周期達(dá)到100%的去除率.這說明苯胺降解菌逐漸適應(yīng)了活性污泥系統(tǒng)的生態(tài)環(huán)境，能夠高效地發(fā)揮功能，并完成了系統(tǒng)的啟動(dòng).隨后，除第9周期苯胺去除率有略微波動(dòng)外，生物強(qiáng)化系統(tǒng)對苯胺的去除率保持在100%，第16周期出水中苯胺質(zhì)量濃度為零.高效苯胺降解菌很好地固定于活性污泥上，實(shí)現(xiàn)了較強(qiáng)的生物強(qiáng)化效能.混合系統(tǒng)內(nèi)實(shí)現(xiàn)了生態(tài)位分離，系統(tǒng)內(nèi)微生物群落在不斷適應(yīng)和調(diào)整過程中趨于穩(wěn)定.

圖2 SBR反應(yīng)器中苯胺質(zhì)量濃度的變化

2.2 生物強(qiáng)化系統(tǒng)中氨氮、亞硝氮、硝氮的變化情況

對生物強(qiáng)化系統(tǒng)進(jìn)水和出水中氨氮、亞硝氮、硝氮質(zhì)量濃度的變化分別進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示.

圖3 SBR反應(yīng)器中氨氮、亞硝氮、硝氮質(zhì)量濃度變化

另外，由圖3也可看出，出水中亞硝氮、硝氮的質(zhì)量濃度幾乎保持不變，維持在很低的水平，一直到反應(yīng)周期的結(jié)束.因?yàn)閬喯趸?xì)菌與硝化細(xì)菌的營養(yǎng)類型均為化能自養(yǎng)型，不與其他菌種產(chǎn)生營養(yǎng)的競爭，故可以推測反應(yīng)器中的亞硝化、硝化細(xì)菌沒有發(fā)揮作用.這是因?yàn)榉磻?yīng)器的水力停留時(shí)間較短，不會(huì)馴化出世代時(shí)間長的硝化菌群，而且苯胺降解菌已經(jīng)被證實(shí)沒有硝化功能，故亞硝氮、硝氮的質(zhì)量濃度不會(huì)明顯增加.

2.3 生物強(qiáng)化系統(tǒng)對COD的去除能力

對生物強(qiáng)化系統(tǒng)COD的去除能力進(jìn)行測定，結(jié)果如圖4所示.前兩個(gè)周期SBR反應(yīng)器對COD的去除效果不顯著，出水COD仍達(dá)到1000 mg/L左右，這是因?yàn)榉磻?yīng)器啟動(dòng)初期，活性污泥系統(tǒng)對高質(zhì)量濃度廢水需要一個(gè)適應(yīng)過程，與上面討論的前兩個(gè)周期苯胺的去除效果相符合，前兩個(gè)周期也可理解為對活性污泥的馴化過程.從第3周期開始，反應(yīng)器中的菌群開始逐漸對COD進(jìn)行降解，除第5周期COD去除率出現(xiàn)了輕微波動(dòng)外，去除率整體呈線性增長.到第7周期，反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)了對苯胺與COD的穩(wěn)定降解，出水中COD質(zhì)量濃度維持在200 mg/L左右，去除率達(dá)到80%.隨后，出水中COD質(zhì)量濃度穩(wěn)步下降，一直維持到第16周期，出水中COD質(zhì)量濃度保持在100 mg/L左右，生物強(qiáng)化系統(tǒng)對COD的去除率為92.23%.

由此可見，活性污泥能夠經(jīng)過短時(shí)間的馴化，實(shí)現(xiàn)對COD的快速降解.因?yàn)榛钚晕勰嗳∽猿鞘形鬯幚韽S的曝氣池，本身對COD就有較強(qiáng)的去除能力，將苯胺降解菌固定在活性污泥上后，活性污泥能夠?qū)崿F(xiàn)對COD的快速降解，這充分說明了這種生物強(qiáng)化的方法是可行的.可以推測，對于較高質(zhì)量濃度的含苯胺工業(yè)廢水，采用此生物強(qiáng)化方法能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)對苯胺及COD的同時(shí)降解，這也為今后此方法在工程中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

圖4 SBR反應(yīng)器中COD質(zhì)量濃度的變化

2.4 活性污泥菌群內(nèi)部形態(tài)的變化

取代表性階段的活性污泥樣品于掃描電子顯微鏡下觀察其內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5(放大倍數(shù)為5000倍)所示.

圖5 活性污泥內(nèi)部形態(tài)變化情況的掃描電子顯微鏡照片

由圖5可以看出，苯胺降解菌能夠很好的固定于活性污泥中形成經(jīng)生物強(qiáng)化的活性污泥.W2為第2周期的掃描電鏡照片，由于苯胺降解菌還未完全適應(yīng)活性污泥這個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，故形狀為短桿菌的苯胺降解菌只有較少數(shù)量固定在活性污泥的結(jié)構(gòu)中.W6為第6周期的掃描電鏡照片，此時(shí)，苯胺的去除率已達(dá)到80%以上，由照片也可以看出，固定于活性污泥上的苯胺降解菌明顯增多.W15為第15周期的掃描電鏡照片，此時(shí)苯胺的去除率穩(wěn)定在100%，可以看出，雖然苯胺降解菌菌量沒有前幾周期多，但苯胺降解菌遍布于活性污泥上，達(dá)到了一種穩(wěn)定的狀態(tài)，并且活性污泥中的菌群種類比較豐富，除了桿菌、球菌，最后幾個(gè)周期還發(fā)現(xiàn)了弧菌，這可能為種泥所帶入.

2.5 活性污泥內(nèi)部種群動(dòng)態(tài)演替研究

對生物強(qiáng)化處理過程活性污泥內(nèi)部種群進(jìn)行PCR-DGGE種群動(dòng)態(tài)演替及生物強(qiáng)化優(yōu)勢種群變化規(guī)律研究，從而確定生物強(qiáng)化處理系統(tǒng)中所含有的微生物的種類和數(shù)量關(guān)系，直接獲得微生物多樣性的信息.

在為期近一周的時(shí)間內(nèi)，分別選取代表性的樣本進(jìn)行種群的動(dòng)態(tài)演替分析，W2、W4、W6、W8、W15分別為處理過程中活性污泥的第二周期、第四周期、第六周期、第八周期以及第十五周期的代表性樣品.活性污泥內(nèi)部的微生物生物群落多樣性變化如圖6所示.

圖6 活性污泥內(nèi)部種群不同階段PCR-DGGE圖譜和條帶識(shí)別圖譜

由圖6可以看出，微生物群落多樣性豐富，優(yōu)勢種群較為明顯.為進(jìn)一步分析污泥載體微生物群落變化的規(guī)律，采用Quantity One軟件包對不同生物強(qiáng)化運(yùn)行時(shí)段的微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性分析，利用該軟件包的泳道/條帶識(shí)別功能，識(shí)別DGGE圖譜，根據(jù)戴斯系數(shù)(Dice coefficient)計(jì)算出各泳道間相似性的矩陣圖，分析樣品間的相似性.圖6是以W6為標(biāo)準(zhǔn)做出的條帶泳道識(shí)別圖，根據(jù)戴斯系數(shù)計(jì)算出各泳道簡間的相似性結(jié)果見表1.

表1 不同條帶相似性的矩陣圖 %

由表1可以看出，條帶4(W8)和條帶5(W15)相似性最高，相似度為75.1%，分析認(rèn)為系統(tǒng)進(jìn)入后期穩(wěn)定運(yùn)行，系統(tǒng)內(nèi)微生物優(yōu)勢菌株得到強(qiáng)化.

3 結(jié)論

1)應(yīng)用于SBR的生物強(qiáng)化小試研究能夠?qū)崿F(xiàn)對苯胺的有效去除，72 h后苯胺的去除率達(dá)到80%以上，120 h后苯胺的去除率為100%，苯胺出水質(zhì)量濃度幾乎為零.同時(shí)，生物強(qiáng)化系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)對COD的有效去除，系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行后出水中COD質(zhì)量濃度保持在100 mg/L左右，去除率為92.23%.生物強(qiáng)化技術(shù)實(shí)現(xiàn)了系統(tǒng)的快速啟動(dòng)，并能連續(xù)穩(wěn)定運(yùn)行.

2)隨著苯胺的降解，氮元素以氨根離子的形式釋放出來，出水中氨氮質(zhì)量濃度不斷升高，但從第10周期(120 h)開始，反應(yīng)器中所具備的苯胺降解菌降解苯胺所產(chǎn)生的氮源被活性污泥的生長所利用，出水氨氮維持在較低的水平.同時(shí)，出水中亞硝氮、硝氮質(zhì)量濃度一直維持在較低的水平，生物強(qiáng)化系統(tǒng)由于水力停留時(shí)間較短，沒有馴化出世代時(shí)間長的硝化菌群.

3)苯胺降解菌能夠很好的固定于活性污泥上形成經(jīng)生物強(qiáng)化的活性污泥，系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定時(shí)苯胺降解菌遍布于活性污泥之上.微生物群落多樣性豐富，優(yōu)勢種群較為明顯.經(jīng)過一段時(shí)期的運(yùn)行，群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯的差異性，系統(tǒng)內(nèi)微生物優(yōu)勢菌株得到強(qiáng)化.

［1］呂永梅.我國苯胺生產(chǎn)現(xiàn)狀與市場分析［J］.中國石油和化工經(jīng)濟(jì)分析，2006，(10):26-30.

［2］ITOH N，NAOKI M.TOYOKO K.Oxidation of aniline to nitrobenzene by nonheme bromoperoxidase.Biochem［J］.Mol Biol Intl，1993，29:785-791.

［3］GóMEZ J L，LEóN G，HIDALGO A M，et al.Application of reverse osmosis to remove aniline from wastewater［J］.Desalination，2009，245:687-693.

［4］CHEN Sheng，SUN Dezhi，CHUNG Jong-shik.Anaerobic treatment of highly concentrated aniline wastewater using packed-bed biofilm reactor［J］.Process Biochemisty，2007，42:1666-1670.

［5］CHEN Sheng，SUN Dezhi，CHUNG Jong-shik.Simultaneousmethanogenesisand denitrification ofaniline wastewater by using anaerobic-aerobic biofilm system with recirculation［J］.Journal of Hazardous Materials，2009，169:575-580.

［6］LEI Caihong，JIN Zanfang，PAN Zhiyan.Study on treatment of aniline wastewater by pressurized activated sludge process［J］.Journal of Zhejiang University of Technology，2008，36(4):423-6.

［7］HUBAN C.Metal bioaugmentation put microbes to work［J］.Chemical Engineering，1997，104(3):74-84.

［8］馬放，郭靜波，趙立軍，等.生物強(qiáng)化工程菌的構(gòu)建及其在石化廢水處理中的應(yīng)用［J］.環(huán)境科學(xué)報(bào)，2008，28(5):885-891.

［9］YU Fangbo，ALI S W，GUAN Libo，et al.Bioaugmentation of a sequencing batch reactor with pseudomonas putida ONBA-17，and its impact on reactor bacterial communities［J］.Journal Of Hazardous Materials，2010，176 (1-3):20-26.

［10］山丹，馬放，王金生，等.生物強(qiáng)化技術(shù)提高SBR系統(tǒng)對低溫苯胺廢水處理能力的研究［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2009，3(4):577-580.

［11］山丹，馬放，王晨.高效低溫苯胺降解菌的分離鑒定及特性研究［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2007，28(3):241-245.

［12］國家環(huán)保局水和廢水檢測分析方法編委會(huì).水和廢水檢測分析方法［M］.第三版.北京.中國環(huán)境科學(xué)出版社.1989.