彭 濤 賈延劼△ 滕軍放 董為偉 謝 鵬 張博愛

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052 2)重慶醫(yī)科大學神經(jīng)病學研究所 重慶 410008

Orexin是一種下丘腦神經(jīng)肽,參與肥胖、攝食、睡眠覺醒周期、激素分泌等多種生理活動[1]。研究發(fā)現(xiàn),缺血性腦損傷可以導致皮層OX-1受體(OX1R)分布的改變[2]。預先電刺激小腦頂核(fastigial nucleus stimulation,FNS)對腦缺血具有明顯的神經(jīng)保護作用,其機制可能涉及多個環(huán)節(jié)[3-4]。但是FNS對于下丘腦神經(jīng)肽系統(tǒng)的作用報道不多,在此基礎上,本文通過研究FNS對缺血性腦損傷OX1R的影響,初步探討FNS對下丘腦神經(jīng)肽系統(tǒng)的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 山羊抗多克隆OX1R抗體均購自Santa C ruz公司;大鼠O rexin-A EIA試劑盒購自Peninsula Laboratories公司;SABC免疫組織化學試劑盒(山羊)購自武漢博士德公司;鵝膏氨酸購自Sigma公司;其余生化試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物 健康雄性清潔級W istar大鼠,體質(zhì)量200～250 g,由本校動物實驗部授權(quán)使用。實驗過程中對動物的飼養(yǎng)及取材均遵守實驗動物管理條例的規(guī)定。

1.3 實驗分組 隨機分為假手術組(PO)、FNS假手術組(PO-FNS)、缺血組(PI)、缺血后FNS治療組(PI-FNS),預先行小腦頂核毀損,再缺血行FNS治療組(FNL-PI-FNS)。PO組進行FNS模型和MCAO手術操作,但不進行電刺激和插入絲線;缺血組及其相應FNS組均各分1 h、3 h、6 h、12 h及24 h五個亞組。

1.4 小腦頂核電刺激模型 參照Reis等方法[5]制備小腦頂核電刺激模型。排除及納入標準:大鼠接受FNS干預后,雖有一過性呼吸、血壓等生命體征的變化,但其小腦連續(xù)切片HE染色發(fā)現(xiàn)刺激部位不在小腦頂核者排除本研究。

1.5 毀損小腦頂核(lesioning cerebellar fastigial nucleus,FNL) 參照G lickstein SB等方法[6],制備毀損小腦頂核模型。排除及納入標準:毀損小腦頂核(FNL)的大鼠,不同時相點斷頭取腦后,作小腦連續(xù)切片,尼氏染色發(fā)現(xiàn)小腦頂核內(nèi)神經(jīng)細胞數(shù)量減少、尼氏體大量消失,表明小腦頂核毀損成功者納入本研究,其大腦可用于檢測,否則排除本研究。

1.6 局灶性腦缺血模型 采用持續(xù)性MCAO模型[2]。

1.7 免疫組織化學染色 各組動物達到規(guī)定時間點時,采用10%水合氯醛麻醉,用20 m L注射器接穿刺針小心插入左心室,同時剪開右心耳,注入滅菌溫生理鹽水,直至流出的液體變清后,再灌注4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS(pH 7.2)約60 m L,再斷頭取腦后置4%多聚甲醛0.1 mol/L PBS固定8 h,再轉(zhuǎn)入30%蔗糖0.1 mol/L PBS(pH 7.2)中4℃平衡。組織塊下沉后,連續(xù)冠狀冰凍切片,片厚20μm。連續(xù)取2張切片(分別用于OX1R免疫組化染色、HE染色)后,間隔100μm,重復同樣切片取片。應用SABC染色試劑盒進行免疫組化染色,計算平均OD值。

1.8 O rexin-A測定 下丘腦及血標本處理參考李峻嶺等的方法[7]。采用酶聯(lián)免疫法測定,吸收波長450 nm,標準曲線0～25 ng/m L,樣品批內(nèi)及批間變異系數(shù)均＜7%。

2 結(jié)果

2.1 OX1R的免疫組織化學變化 PO組OX1R在許多腦區(qū)包括前額葉和大腦皮質(zhì)、海馬、室旁丘腦核、下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、背縫核、藍斑等廣泛表達,所以本研究選取缺血側(cè)(右側(cè))大腦皮層區(qū)觀察OX1R表達。PO-FNS組的免疫反應性(平均OD值)相似(P＞0.05)。

大腦皮層OX1R從缺血6 h開始顯著增高,與PO組、PO-FNS組相比有顯著性差異(P＜0.05),以后隨著缺血時間延長,平均OD值不斷增高,缺血12 h達到高峰;缺血24 h,雖然顯微鏡視野內(nèi)細胞基本崩潰,無法測定平均OD值,但間質(zhì)內(nèi)密布免疫反應陽性顆粒。PI-FNS組基本變化趨勢類似于PI組,但與其相應PI組相比,其變化程度明顯減低,差別具有統(tǒng)計學意義(缺血6 h、12 h組,P＜0.05)。缺血24 h,雖然顯微鏡視野內(nèi)細胞基本崩潰,但與其相應PI組相比,其完整細胞數(shù)量較多。FNL-PI-FNS組結(jié)果與PI組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但是與相應PI-FNS組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見圖1。

表1 局灶性腦缺血后OX1R的免疫組織化學OD值的變化

2.2 Orexin-A測定 雖然各組血漿Orexin-A水平無顯著性差異(P＞0.05),但是下丘腦組織卻有差異。PI組O rexin-A水平隨著缺血時間延長,呈不斷降低趨勢。缺血12 h,與PO組、PO-FNS組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),缺血24 h,雖較缺血12 h有所升高,但是兩者之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。PI-FNS組在缺血12 h、24 h,與PO組、PO-FNS組相比,有顯著性差異(P＜0.05)。FNL-PI-FNS組結(jié)果與PI組差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),缺血12 h、24 h,與PO組、PO-FNS組、PI-FNS組相比,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見圖2。

表2 局灶性腦缺血后血漿O rexin-A水平和下丘腦O rexin-A含量的變化

3 討論

Orexin是下丘腦中的神經(jīng)肽,最早在大鼠下丘腦外側(cè)區(qū)(LH A)發(fā)現(xiàn),現(xiàn)在已知O rexin存在A、B兩個不同C-末端乙酰化的單體[1]。Orexin系統(tǒng)有兩個G蛋白偶聯(lián)受體:OX1R和OX2R。OX1R與神經(jīng)肽Y2r結(jié)構(gòu)相似,對Orexin-A比O rexin-B有更高的親和力。OX2R則可與O rexin-A及O rexin-B結(jié)合。因此一般認為OX1R是Orexin-A的選擇性受體[1]。本研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)性MCAO模型大鼠在缺血早期(＜3 h),O rexin系統(tǒng)改變不明顯;隨著缺血時間的延長,在缺血中期(3～12 h),皮層的OX1R蛋白表達增高,與此同時,下丘腦組織O rexin-A含量減少;缺血后期(＞12 h),下丘腦組織O rexin-A逐步增多,這一結(jié)果與Irving等報道類似[2]。其機制尚不清楚,可能與O rexin系統(tǒng)在應激反應中作用有關。已有報道,O rexin參與調(diào)節(jié)兒茶酚胺、糖皮質(zhì)激素、血糖水平等與缺血應激相關事件及交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮性[8-9]。缺血早期,O rexin-A尚未對應激條件產(chǎn)生效應;缺血中期,由于免疫和應激反應刺激O rexin-A釋放,O rexin-A可以促進神經(jīng)肽Y、皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)、ACTH升高,進而導致糖皮質(zhì)激素、腎上腺素的增加。但是,體內(nèi)交感、副交感神經(jīng)系統(tǒng)過度活化,大量的CRH、糖皮質(zhì)激素和神經(jīng)肽Y對Orexin-A產(chǎn)生更強烈的反饋抑制作用,加上自由基對Orexin-A的破壞作用,最終使O rexin-A表達下調(diào),皮層的OX1R反應性增高;缺血后期,免疫和應激反應逐漸減弱,CRF、糖皮質(zhì)激素自由基和神經(jīng)肽Y水平下降,O rexin-A表達開始上調(diào),恢復新的平衡[10-11]。對于慢性腦缺血也有類似的情況[12]。

預先電刺激小腦頂核(Fastigial Nucleus Stimulation,FNS)對腦缺血具有明顯的神經(jīng)保護作用,其機制可能涉及抑制病灶周圍電活動、減少缺血區(qū)腦組織白細胞浸潤及血管炎癥反應、降低神經(jīng)細胞興奮性損害、下調(diào)nNOS表達,抑制鈣蛋白酶的活性及阻斷細胞凋亡事件等多個環(huán)節(jié)[3]。本研究表明,預先FNS可以顯著的減輕缺血對O rexin-A系統(tǒng)的影響,抑制皮質(zhì)OX1R反應性增高。而且,毀損小腦頂核后,這種調(diào)節(jié)作用消失。由于Orexin參與攝食、能量代謝、覺醒等許多最基本的活動,O rexin水平的降低,將直接影響機體基本生理活動的進行。例如,O rexin-A水平的降低后,導致膽堿能、單胺能、5-羥色胺能神經(jīng)元興奮性下降,膽堿能神經(jīng)元活動相對增加,抑制了皮質(zhì)活動,覺醒程度下降,造成睡眠-覺醒周期的紊亂,可能導致卒中后睡眠障礙的發(fā)生[13]。因此,預先FNS通過調(diào)節(jié)缺血性腦損傷后OX1R表達的變化,維持神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的穩(wěn)定,對于缺血性腦損傷的治療和康復將具有深遠的意義。

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