賈建萍，魯健章，周彥鋼，程 敏，葉小弟，鄭高利*

不同來源膠原肽的抗氧化活性及吸濕保濕性能

賈建萍，魯健章，周彥鋼，程 敏，葉小弟，鄭高利*

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，浙江 杭州 310013)

目的：對(duì)不同來源(豬皮、牛皮、驢皮、鱈魚皮、牛骨)膠原肽的抗氧化活性和吸濕保濕性能進(jìn)行比較研究。方法：采用清除 DPPH自由基和 ABTS+·及還原力測(cè)定進(jìn)行膠原肽抗氧化活性的評(píng)價(jià)，同時(shí)對(duì)膠原肽的吸濕性和保濕性進(jìn)行比較分析。結(jié)果：驢皮膠原肽具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，IC50值為0.63mg/mL。鱈魚皮膠原肽具有較強(qiáng)的清除ABTS+·的能力，IC50值為0.12mg/mL。驢皮膠原肽具有較強(qiáng)的還原力，在質(zhì)量濃度10mg/mL時(shí)，OD700nm值為0.61。驢皮膠原肽具有較好的吸濕保濕性，在相對(duì)濕度43%的環(huán)境下，24h，吸濕率10.17%、72h，保濕率98.90%。結(jié)論：驢皮膠原肽具有很好的抗氧化性和吸濕保濕性。

膠原肽；抗氧化活性；吸濕性；保濕性

膠原肽是由動(dòng)物膠原蛋白經(jīng)酶解得到的一類分子質(zhì)量較小的酶解產(chǎn)物，主要由蛋白質(zhì)、肽和氨基酸組成。膠原肽具有許多生理功能：抗氧化、降血壓、促進(jìn)礦物元素吸收、提高免疫力、抗菌等，具有抗氧化作用的膠原肽主要來源于動(dòng)物表皮、骨等結(jié)締組織，已廣泛應(yīng)用于藥品、食品及化妝品工業(yè)中[1-5]。目前市場(chǎng)上宣傳抗氧化作用的膠原肽產(chǎn)品名目繁多，但是尚未見有關(guān)對(duì)不同來源膠原肽進(jìn)行抗氧化活性比較研究的報(bào)道。

DPPH 自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，在517nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與抗氧化劑反應(yīng)時(shí)，其中的孤對(duì)電子與抗氧化劑中的電子配對(duì)使其乙醇溶液由紫色褪色成黃色，褪色程度反映抗氧化活性，已廣泛用于抗氧化活性的評(píng)價(jià)。ABTS+·水溶液呈藍(lán)綠色，在734nm波長(zhǎng)處有最大吸收，與抗氧化劑反應(yīng)會(huì)使反應(yīng)體系褪色，同樣，褪色程度反應(yīng)抗氧化活性大小。還原力測(cè)定原理是樣品將赤血鹽(K3Fe(CN)6)還原成黃血鹽(K4Fe(CN)6)，黃血鹽再與Fe3+作用，生成普魯士藍(lán)(在700nm波長(zhǎng)處有最大吸收)，樣品的還原力以O(shè)D700nm表示，光密度越高，還原力越強(qiáng)。

本研究測(cè)定不同來源膠原肽清除2,2-二苯基-1-苦基

肼(DPPH)自由基和2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并塞唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS+·)的能力以及還原力，比較研究其抗氧化活性，同時(shí)研究其吸濕性和保濕性等物理性質(zhì)，擬為其抗氧化活性的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬皮膠原肽、牛骨膠原肽 江西可生生化有限公司；牛皮膠原肽 三葉生物化工有限公司；鱈魚皮(水分含量73.4%) 浙江海力生生物科技有限公司；驢皮膠(阿膠) 華東醫(yī)藥有限公司。

2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并塞唑啉-6-磺酸)(ABTS) 美國(guó)Sigma公司；胰酶(4000U /g)、木瓜蛋白酶(3500000U/g) 南寧龐博生物工程有限公司；無水乙醇、三氯乙酸、鐵氰化鉀均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100分光光度計(jì) 美國(guó)尤尼柯公司；L-8800高速氨基酸分析儀 日本日立公司；YC-015噴霧干燥器上海雅程儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鱈魚皮膠原肽的制備

稱取魚皮，以魚皮與水質(zhì)量比為1:6的比例加水，于55℃恒溫水浴中，調(diào)整反應(yīng)體系pH值為6.0，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%的胰酶(以魚皮濕質(zhì)量計(jì))，反應(yīng)6h，升溫至90℃滅酶20min，取出反應(yīng)液并進(jìn)行減壓抽濾，將濾液噴霧干燥得到膠原肽成品。

1.3.2 驢皮膠原肽的制備

稱取驢皮膠 (阿膠)，以阿膠與水質(zhì)量比為1:8的比例加水，于55℃恒溫水浴中，調(diào)整pH值為7，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的木瓜蛋白酶(以阿膠計(jì))，反應(yīng)10h，升溫至90℃滅酶20min，取出反應(yīng)液并進(jìn)行減壓抽濾，將濾液噴霧干燥得到膠原肽成品。

1.3.3 膠原肽基本成分的測(cè)定

水分含量按照GB/T5009.3—2003《食品中水分的測(cè)定》進(jìn)行，灰分含量按照GB/T5009.4—2003《食品中灰分的測(cè)定》進(jìn)行，氨基酸含量按照GB/T5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行。

1.3.4 肽含量的測(cè)定(三氯乙酸法)

稱取2g(精確至0.001g)樣品，加入10mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%三氯乙酸水溶液，混勻，4000r/min離心10min，棄去沉淀，采用GB/T5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》測(cè)定上清液中酸溶蛋白(肽和游離氨基酸總和)含量，游離氨基酸含量采用GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》進(jìn)行，肽含量為酸溶蛋白含量減去游離氨基酸含量。

1.3.5 DPPH自由基清除活性的測(cè)定

按照DPPH比色法進(jìn)行[6]。

1.3.6 ABTS+·清除活性的測(cè)定

按照ABTS+·清除活性法進(jìn)行[7]。

1.3.7 還原力的測(cè)定

按照鐵氰化鉀法進(jìn)行[6]。

1.3.8 吸濕性和保濕性的測(cè)定

按照參考文獻(xiàn)[8]測(cè)定方法進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Origin6.0 軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以x±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原肽的主要成分由表1可見，除了鱈魚皮膠原肽其他4種膠原肽的水分含量比較高(大于6%)，由此可見膠原肽具有很好的吸濕性。牛骨膠原肽的灰分含量相對(duì)較高，這與骨原料中含有較多的礦物元素有關(guān)，另外，5種膠原肽的肽含量均在70%以上，說明膠原肽以含有相對(duì)分子質(zhì)量較小的肽為主。

表1 膠原肽的主要成分Table 1 Major composition of collagen peptides from different sources

2.2 膠原肽清除DPPH自由基能力分析

圖1 膠原肽對(duì)DPPH自由基的清除率(n=3)Fig.1 Scavenging rates of collagen peptides from different sources on DPPH free radicals (n=3)

由圖1可知，5種膠原肽對(duì)DPPH自由基的清除率呈質(zhì)量濃度依賴關(guān)系，驢皮膠原肽具有較好的DPPH自由基清除能力，而牛骨膠原肽則相對(duì)較弱。5種膠原肽的IC50值大小順序?yàn)轶H皮膠原肽(0.63mg/mL)＜鱈魚皮膠原肽(4.85mg/mL)＜牛皮膠原肽(9.75mg/mL)＜豬皮膠原

肽(11.91mg/mL)＜牛骨膠原肽(20.13mg/mL)。IC50值與清除自由基能力呈反比關(guān)系，驢皮膠原肽的IC50值僅為牛骨膠原肽IC50值的3.1%。

2.3 清除ABTS＋·能力分析

圖2 膠原肽對(duì)ABTS+·的清除率(n=3)Fig.2 Scavenging rates of collagen peptides from different sources on ABTS+free radicals (n=3)

由圖2可知，隨著膠原肽質(zhì)量濃度增加，其對(duì)ABTS+·清除率也呈增加趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，鱈魚皮膠原肽清除ABTS+·能力最強(qiáng)，驢皮膠原肽和牛皮膠原肽能力相當(dāng)，而牛骨膠原肽顯示最弱的ABTS+·清除能力。5種膠原肽的IC50值大小順序?yàn)轺L魚皮膠原肽(0.12mg/mL)＜牛皮膠原肽(0.28mg/mL)≈驢皮膠原肽(0.29 mg/mL)＜豬皮膠原肽(0.61mg/mL)＜牛骨膠原肽(0.94 mg/mL)。

圖3 膠原肽的還原力隨質(zhì)量濃度變化曲線(n=3)Fig.3 Reducing powers of collagen peptides from different sources (n=3)

由圖3可知，5種膠原肽的還原力均呈質(zhì)量濃度依賴型，在膠原肽質(zhì)量濃度10mg/mL時(shí)還原力(OD700nm)的順序?yàn)椋后H皮膠原肽(0.61)＞鱈魚皮膠原肽(0.18)＞牛皮膠原肽(0.13)=豬皮膠原肽(0.13)＞牛骨膠原肽(0.11)，驢皮膠原肽顯示了較強(qiáng)的還原力，而骨膠原肽則表現(xiàn)了較弱的還原力，在質(zhì)量濃度10mg/mL時(shí)，驢皮膠原肽的還原力是牛骨膠原肽的5.54倍。

2.4 氨基酸組成分析

由表2可知，5種膠原肽中鱈魚皮膠原肽的氨基酸總量最高，為93.29g/100g，另外4種陸上動(dòng)物膠原肽的氨基酸含量較低，這可能與動(dòng)物所處的生活環(huán)境及物種類別有關(guān)。甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸、脯氨酸和精氨酸含量相對(duì)較高，據(jù)報(bào)道肽的抗氧化活性與其氨基酸組成有著緊密聯(lián)系，除了脯氨酸鱈魚皮膠原肽的其他組成氨基酸含量大于其他4種陸上生物的膠原肽，而鱈魚皮膠原肽的抗氧化活性要弱于驢皮膠原肽，可能是水生生物和陸上生物膠原肽由于結(jié)構(gòu)的差異，氨基酸組成和抗氧化活性的關(guān)系并不存在同比性。4種陸生動(dòng)物膠原肽的組成氨基酸中，驢皮膠原肽中甲硫氨酸、酪氨酸及組氨酸的含量高于其他3種陸生膠原肽，而且這3種氨基酸的變化規(guī)律與前面所述抗氧化活性的變化趨勢(shì)是一致的，同時(shí)也符合文獻(xiàn)[9-11]報(bào)道寡肽中酪氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、組氨酸及丙氨酸含量與寡肽抗氧化活性有著對(duì)應(yīng)關(guān)系。2.5膠原肽的吸濕性

表2 膠原肽的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of collagen peptides from different sources

5種膠原肽在相對(duì)濕度(RH)43%和81%環(huán)境中的吸濕性如圖4所示。5種膠原肽在RH81%中的吸濕性與RH43%相比差異不明顯，在RH43%環(huán)境下膠原肽具有良好的吸濕性，可見膠原肽用于化妝品中在干燥環(huán)境下可起到良好的滋潤(rùn)作用。在上述兩種濕度環(huán)境下，5種膠原肽均具有較快的吸濕速率，12h達(dá)到平衡。在RH81%和RH43%環(huán)境中，驢皮膠原肽的吸濕率最高，牛皮膠原肽的吸濕率最低，五者吸濕率的順序?yàn)椋后H皮膠原肽＞鱈魚皮膠原肽＞牛骨膠原肽＞豬皮膠原肽＞牛皮膠原肽。

圖4 膠原肽的吸濕性Fig.4 Moisture-absorbing capacities of collagen peptides from different sources

2.6 膠原肽的保濕性

圖5 膠原肽在相對(duì)濕度43%環(huán)境中的保濕性Fig.5 Moisture-retention capacities of collagen peptides from different sources under 43% relative humidity

由圖5可知，5種膠原肽在初始6h內(nèi)保濕率大于100%，具有一定的吸濕能力，6h后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)保濕率開始下降，24h趨于平衡，保濕實(shí)驗(yàn)中添加了樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水后，吸濕率反而快速上升，此現(xiàn)象可能是添加的水份在粉末之間以及粉末和水蒸氣之間形成了液體橋等原因。驢皮膠原肽和鱈魚皮膠原肽具有很好的保濕性，48h內(nèi)保濕率大于100%，牛骨膠原肽次之，牛皮膠原肽和豬皮膠原肽的保濕率相近，而且兩者隨時(shí)間變化基本一致。

3 討 論

膠原肽的抗氧化活性除了與組成氨基酸相關(guān)外，與其分子質(zhì)量及其分布也有著密切的關(guān)系，Guo等[9]論證了皇漿蛋白水解物中分子質(zhì)量小于1000D部分的抗氧化活性要強(qiáng)于其他兩部分(1000～3000D和大于3000D)。作者前期報(bào)道[12]了5種膠原肽的分子質(zhì)量分布情況，鱈魚皮膠原肽、豬皮膠原肽、牛皮膠原肽和驢皮膠原肽分子質(zhì)量主要分布于180～1500D，主要為寡肽，而骨膠原肽主要分布于500～25000D，主要為大分子蛋白質(zhì)和多肽。

膠原肽是動(dòng)物膠原蛋白的水解產(chǎn)物，主要由大分子蛋白質(zhì)、肽、氨基酸及其他一些化合物組成，膠原肽抗氧化作用是一個(gè)復(fù)雜的反應(yīng)過程，與不同自由基的反應(yīng)存在不同的反應(yīng)機(jī)理，還原力的大小綜合反映樣品抗氧化能力的強(qiáng)弱，與清除特定自由基的能力不存在必然聯(lián)系。驢皮膠原肽、豬皮膠原肽、牛皮膠原肽、鱈魚皮膠原肽及牛骨膠原肽5種膠原肽中，驢皮膠原肽具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基的能力，IC50值為0.63mg/mL。鱈魚皮膠原肽具有較強(qiáng)的清除ABTS＋·的能力，IC50值為0.12mg/mL。驢皮膠原肽具有較強(qiáng)的還原力，在10mg/mL下，OD700nm值為0.61。由此可見驢皮膠原肽是一種很好的抗氧化劑，本實(shí)驗(yàn)及前期實(shí)驗(yàn)[12]顯示，驢皮膠原肽中的氨基酸含量、肽含量及分子質(zhì)量分布與其他膠原肽并不存在顯著差異，有關(guān)驢皮膠原肽具有的顯著抗氧化性能機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

膠原肽在RH81%中的吸濕性與RH43%相比差異不明顯，在RH43%環(huán)境下膠原肽具有良好的吸濕性。驢皮膠原肽具有很好的吸濕保濕性，在RH43%環(huán)境下，24h，吸濕率10.17%、72h，保濕率98.90%?？勺鳛楸駝?yīng)用于化妝品中。

[1]MIGUEL M, CONTRERAS M M, RECIO I, et al. ACE-inhibitory and antihypertensive properties of a boving casein hydrolysate[J]. Food Chem, 2009, 112: 211-214.

[2]GIMENEZ B, ALEMAN A, MONTERO P, et al. Antioxidant and functional propertied of gelatin hydrolysates obtained from skin of sole and squid[J]. Food Chem, 2009, 114: 976-983.

[3]CUNEO F, COSTA-PAIVA L, PINTO-NETO A M, et al. Effect of dietary supplementation with collagen hydrolysates on bone metabolism of postmenopausal woman with low mineral density[J]. Maturitas, 2010, 65: 253-257.

[4]GRAHAM C, IRVINE A E, MCCLEAN S, et al. Peptide tyrosine arginine, a potent immunomodulatory peptide isolated and structurally characterized from the skin secretions of the dusky gopher frog, Rana sevosa[J]. Peptides, 2005, 26(5): 737-743.

[5]REES J A, MONIATTE M, BULET P. Novel antibacterial peptides isolated from a European bumblebee, Bombus pascuorum (Hymenoptera, Apoidea)[J]. Insect Biochem Molec Biol, 1997, 27: 413-422.

[6]JIA Jingping, ZHOU Yangang, LU Jjianzhang, et al. Enzymatic hydrolysis of Alaska pollack (Theragra chalcogramma) skin and antioxidant activity of the resulting hydrolysate[J]. J Sci Food Agri, 2010, 90: 635-640.

[7]林戀竹, 趙謀明. 反應(yīng)時(shí)間對(duì)DPPH自由基法和ABTS+·法評(píng)價(jià)抗氧化性結(jié)果的影響[J].食品科學(xué), 2010, 31(5): 63-67.

[8]季文靜, 胡福良, 李英華, 等.蜂王漿酶解工藝及其產(chǎn)物吸濕保濕性能的研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2009, 9(1):35-40.

[9]GUO Hang, KOUZUMA Y, YONEKURA M. Structures and properties of antioxidative peptides derived from royal jelly protein[J]. Food Chem, 2009, 113: 238-245.

[10]KAWASHIMA K, ITOH H, MIYOSHI M, et al. Antioxidant properties of branched-chain amino acid derivatives[J]. Chemical Pharmacol Bull, 1979, 27: 1912-1916.

[11]SUETSUNA K. Antioxidant peptides from the protease digest of prawn (Penaeus japonicus) muscle[J]. Mar Biotechnol, 2000, 1(2): 5-10.

[12]賈建萍, 周彥鋼, 魯健章, 等. 凝膠滲透色譜法測(cè)定膠原肽分子質(zhì)量及其分布[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010, 20(5): 968-969.

Antioxidant Activity, Moisture-absorbing and Moisture-retention Properties of Collagen Peptides from Different Sources

JIA Jian-ping，LU Jian-zhang，ZHOU Yan-gang，CHENG Min，YE Xiao-di，ZHENG Gao-li* (Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China)

Objective: To explore the antioxidant activity, moisture-absorbing and moisture-retention properties of collagen peptides from different sources. Methods: The antioxidant activities of collagen peptides from different sources were evaluated by determining their scavenging activities on 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2’-azino-bis-2-ethybenz-thiazoline-6-sulfonic acid (ABTS+) free radicals and their reducing power. Results: The collagen peptide from donkey revealed the strongest scavenging activity on DPPH free radicals with IC50 of 0.63 mg/mL. The collagen peptide from Alaska pollack skin exhibited stronger scavenging activity on ABTS+free radicals with an IC50 of 0.12 mg/mL. Meanwhile, the collagen peptide from donkey also exhibited the strongest reducing power, which was 0.61 at the concentration of 10 mg/mL. The moisture-absorbing and moisture-retention rates of collagen peptide from donkey were 10.17% and 98.90% under the relative humidity of 43%. Conclusion: The collagen peptide from donkey can be used as a good additive in functional food and cosmetics.

collagen peptide；antioxidant activity；moisture-absorbing property；moisture-retention property

TQ936.16

A

1002-6630(2010)21-0169-04

2010-06-30

浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)(2007F10031)

賈建萍(1975—)，女，助理研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：jia_jp@163.com

*通信作者：鄭高利(1963—)，男，研究員，博士，研究方向?yàn)樗幚?、食品營(yíng)養(yǎng)。E-mail：gaoli-z@163.com