趙燕燕，劉麗艷，杜光玲，韓媛媛，白 潔，耿成光，高 茜

(1.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000)

高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定奶制品中動(dòng)物水解蛋白

趙燕燕1,2，劉麗艷2，杜光玲1，韓媛媛1，白 潔1，耿成光2，高 茜2

(1.河北大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000)

目的：建立高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法(HPLC-ELSD)測定奶制品中動(dòng)物水解蛋白含量的方法。方法：奶制品用酸水解法進(jìn)行處理。采用色譜柱：Shim-pack C18(4.6mm×250mm，5μm)，流動(dòng)相 3.8mmol/L七氟丁酸溶液-甲醇(8:2，V/V)，流速 1.0mL/min，ELSD漂移管溫度 50℃，載氣壓力 350kPa，進(jìn)樣量10μL，測定奶制品中羥脯氨酸(Hyp)。結(jié)果：在優(yōu)化條件下，羥脯氨酸的線性范圍為10～1000μg/mL，r=0.99993(n=5)，最低檢出限為5μg/mL。動(dòng)物水解蛋白的平均回收率為99.83%，RSD為2.77%。結(jié)論：本法不需對樣品進(jìn)行衍生，操作簡單，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于羥脯氨酸的分離檢測。

高效液相色譜；蒸發(fā)光散射檢測器；奶制品；動(dòng)物水解蛋白；羥脯氨酸

奶制品中乳蛋白是一種全價(jià)蛋白，由18種以上氨基酸組成，是乳營養(yǎng)中最重要成分之一，其含量已成為目前控制奶制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的主要指標(biāo)。有些非法廠家將動(dòng)物水解蛋白質(zhì)摻入奶制品中以提高蛋白質(zhì)的標(biāo)示量，降低了奶制品的營養(yǎng)價(jià)值，影響了質(zhì)量、衛(wèi)生以及口味[1]。市場上常用的動(dòng)物水解蛋白為魚皮膠原蛋白、羊皮水解蛋白粉、牛皮水解蛋白粉、骨水解蛋白粉，經(jīng)酸水解后釋放出羥脯氨酸(Hyp)。羥脯氨酸是動(dòng)物水解蛋白所特有的氨基酸，為非人體必需氨基酸，含量相對穩(wěn)定，在正常動(dòng)物水解蛋白中含量約13.4%，為檢測動(dòng)物水解蛋白含量的主要指標(biāo)。目前羥脯氨酸的測定方法主要有比色法[2]、氨基酸分析儀法[3-4]、高效液相色譜-熒光檢測器法[5-6]、氣相色譜法[7-8]、毛細(xì)管電泳法[9-10]、LC-MS/MS[11]、超聲乳成分分析儀法[12]、質(zhì)譜法[13]。比色法特異性、靈敏度、準(zhǔn)確度較差，測定結(jié)果易受多種因素影響；氨基酸分析儀價(jià)格昂貴，難以推廣；色譜法測定，樣品需要衍生，操作繁瑣。采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(HPLC-ELSD)法測定羥脯氨酸的方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC-ELSD法測定羥脯氨酸，計(jì)算奶制品中動(dòng)物水解蛋白含量。樣品不經(jīng)衍生，操作簡便、快捷，避免了衍生物的多樣性，以及樣品中氨基酸衍生不完全等問題，對羥脯氨酸直接進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

奶制品 市售。

羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：H54409)、七氟丁酸(色譜純，批號(hào)：24364323) Sigma公司；魚皮膠原蛋白(批號(hào)：090812)、骨水解蛋白粉(批號(hào)：090725) 梁山科泰生物制品有限公司；三氯乙酸(色譜純，批號(hào)：20090225) 科密歐試劑公司；甲醇、乙腈(色譜純)；其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-10ATVP高效液相色譜儀、ELSD-LTⅡ蒸發(fā)光散射檢測器、CLASS-VP工作站、ODS分析柱 日本島津公司；DELTA-320型酸度計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司；CU-600型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司；超純化水機(jī) 重慶頤洋企業(yè)發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件和ELSD參數(shù)

色譜柱Shim-pack C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：3.8mmol/L七氟丁酸溶液-甲醇(8:2，V/V)；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量10μL；ELSD漂移管溫度50℃；氮?dú)庾鲚d氣；載氣壓力350kPa。

1.3.2 儲(chǔ)備液配制

精密稱取羥脯氨酸對照品0.0250g置于25mL容量瓶中，加入適量二次去離子水，振搖使溶解，定容至刻度，制成質(zhì)量濃度1000μg/mL的對照品儲(chǔ)備液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 樣品處理

取液態(tài)奶2.5mL于水解管中，加入等體積的濃鹽酸，充氮后封管，置于110℃烘箱中保持6h，冷卻后經(jīng)布氏漏斗過濾到50mL錐形瓶中，置于水浴鍋中蒸干，加二次去離子水，再蒸干，重復(fù)5次，殘?jiān)枚稳ルx子水定容到50mL容量瓶中，0.45μm濾膜過濾，上機(jī)分析。

1.3.4 動(dòng)物水解蛋白含量的測定

動(dòng)物水解蛋白經(jīng)酸法水解處理釋放出羥脯氨酸，通過以下公式計(jì)算其轉(zhuǎn)化率[14]：

式中：m1為羥脯氨酸含量；m2為動(dòng)物水解蛋白含量。

羥脯氨酸轉(zhuǎn)化率與動(dòng)物水解蛋白在奶制品中的含量之間的換算系數(shù)f[14]：

由f計(jì)算奶制品中動(dòng)物水解蛋白含量：m2= f×m1。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

考察不同流動(dòng)相(10.0mmol/L三氯乙酸溶液-乙腈、10.0mmol/L三氯乙酸溶液-甲醇、醋酸鹽緩沖溶液-10.0mmol/L三氯乙酸溶液-乙腈，4.0mmol/L七氟丁酸溶液-甲醇)對樣品中各組分分離度以及靈敏度的影響，結(jié)果表明：采用4.0mmol/L七氟丁酸溶液-甲醇為流動(dòng)相分離效果較好，Hpy峰與其他峰之間達(dá)到基線分離。

分別按七氟丁酸和甲醇混合溶液(8:1、8:2、8:3，V/V)以及七氟丁酸溶液的濃度(3.0、3.4、3.8、4.2mmol/L)進(jìn)行考察，結(jié)果表明：隨著甲醇比例的加大，分離度與靈敏度均增加，但當(dāng)4.0mmol/L七氟丁酸溶液與甲醇的比例大于8:2時(shí)，柱壓加大，會(huì)影響柱子的使用壽命，所以4.0mmol/L七氟丁酸與甲醇的比例為8:2時(shí)，較為適宜；流動(dòng)相中七氟丁酸的濃度對峰型有較大影響，以3.8mmol/L時(shí)效果最佳。此時(shí)，各色譜峰對稱性好，峰型尖銳。因此，綜合選擇流動(dòng)相3.8mmol/L七氟丁酸溶液-甲醇為8:2較為適宜。

2.2 檢測器參數(shù)的選擇

蒸發(fā)光散射檢測器的漂移管溫度和氣體流量是影響檢測結(jié)果的重要參數(shù)[15-16]。分別考察漂移管溫度(40、50、60℃)和氮?dú)鈮毫?350、380、400kPa)對檢測結(jié)果的影響。結(jié)果表明：漂移管溫度低于50℃時(shí)，流動(dòng)相得不到充分的揮發(fā)，基線水平較高，而溫度高于50℃時(shí)，會(huì)帶來較大的噪音；隨著載氣流量的增大，響應(yīng)值隨之減小。在漂移管溫度50℃、載氣壓力350kPa時(shí)，基線平穩(wěn)、噪聲較小、有適宜的響應(yīng)值。因此，最終選擇此參數(shù)進(jìn)行測定。

2.3 方法專屬性實(shí)驗(yàn)

分別取4份同一批次、同一品牌的液態(tài)奶各25mL，一份空白奶作為對照，另外3份分別加入0.0078g羥脯氨酸、0.7720g骨水解蛋白粉和0.7720g魚皮膠原蛋白，分別按1.3.3節(jié)方法進(jìn)行處理，上機(jī)分析，其色譜圖見圖1。

圖1 牛奶中羥脯氨酸檢測色譜圖Fig.1 HPLC profiles showing the separation of hydroxyproline in blank milk samples unfortified and fortified with hydroxyproline standard, fish skin collagen or hydrolyzed fish bone protein

2.4 線性關(guān)系和檢出限

精密量取羥脯氨酸對照品適量，配制成一系列質(zhì)量濃度不同的溶液(1000、500、250、100、50、25、10、5μg/mL)，按照1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，以質(zhì)量的對數(shù)值(X)為橫坐標(biāo)，以峰高的對數(shù)值(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，羥脯氨酸線性方程為：Y=1.23681X+ 4.39134(r=0.99993)，線性范圍為10～1000μg/mL。按3倍信噪比計(jì)算最低檢出限(LOD)為5μg/mL。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取羥脯氨酸對照品儲(chǔ)備液適量，將其稀釋到濃度為250μg/mL，按照1.3.1節(jié)條件進(jìn)行測定，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明：羥脯氨酸色譜峰的保留時(shí)間波動(dòng)小于0.02min，峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.91%。

2.6 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取6份同一批次、同一品牌的液態(tài)奶25mL，分別加入一定量的羥脯氨酸對照品，按照1.3.1節(jié)條件進(jìn)行測定，羥脯氨酸峰高的RSD為2.60%。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密量取一定量羥脯氨酸對照品，用某品牌液態(tài)奶溶解并定容到25mL，按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行處理，在0、6、12、24h，2、3、10、20d，1個(gè)月時(shí)進(jìn)樣，羥脯氨酸峰高的RSD為0.73%，說明樣品溶液在一個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

分別取3份同一批次、同一品牌的液態(tài)奶各25mL，分別加入不同量的羥脯氨酸對照品，按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行處理，上機(jī)分析。羥脯氨酸的加樣回收率見表1，平均回收率達(dá)99.83%，RSD為2.77%。

表1 羥脯氨酸的加樣回收率(n=9)Table1 Average spike recovery and RSD for hydroxyproline (n=9)

2.9 換算系數(shù)的計(jì)算

分別在50mL液態(tài)奶中添加骨水解蛋白粉和魚皮膠原蛋白，按照1.3.3節(jié)方法進(jìn)行處理，按照1.3.4節(jié)方法計(jì)算動(dòng)物水解蛋白中羥脯氨酸的平均轉(zhuǎn)換率和換算系數(shù)(f)，結(jié)果見表2、3。

表2 骨水解蛋白中羥脯氨酸的轉(zhuǎn)化率和換算系數(shù)Table2 Average conversion rate and factor for hydroxyproline in hydrolyze bone protein

表3 魚皮膠原蛋白中羥脯氨酸轉(zhuǎn)化率和換算系數(shù)Table3 Average conversion rate and factor for hydroxyproline in fish skin collagen

2.10 樣品測定

按照1.3.3節(jié)方法對幾種市售不同品牌的牛奶進(jìn)行處理，上機(jī)分析，測得結(jié)果見表4。結(jié)果表明：樣品C、D、F中均含有羥脯氨酸，其中含有的動(dòng)物水解蛋白的量由其種類決定。含有動(dòng)物水解蛋白的某品牌牛奶的HPLC-ELSD色譜圖見圖2。

表4 市售液態(tài)奶的測定結(jié)果Table4 Results of determination of different brands of liquid milk by the method

圖2 含有動(dòng)物水解蛋白某品牌牛奶的HPLC-ELSD色譜圖Fig.2 HPLC profile of some brand of liquid milk containing hydroxyproline

3 結(jié) 論

利用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器，能夠準(zhǔn)確的測定奶制品中羥脯氨酸的含量，計(jì)算出動(dòng)物水解蛋白的摻加量。本方法不需對樣品進(jìn)行衍生，可以對羥脯氨酸直接進(jìn)行分析，避免了衍生物的多樣性，也不涉及樣品中氨基酸衍生不徹底等問題，操作簡單，靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確，能快速、準(zhǔn)確的判斷奶制品中是否添加了動(dòng)物水解蛋白。

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Determination of Hydrolyzed Animal Protein in Dairy Products by High-performance Liquid Chromatography with Evaporative Light Scattering Detection

ZHAO Yan-yan1,2，LIU Li-yan2，DU Guang-ling1，HAN Yuan-yuan1，BAI Jie1，GENG Cheng-guang2，GAO Qian2
(1. Medical Experimental Center, Hebei University, Baoding 071000, China；2. College of Chemistry and Environmental Science, Hebei University, Baoding 071000, China)

Objective: To develop a high-performance chromatographic method with an evaporative light scattering detector (ELSD) for the quantified determination of hydrolyzed animal protein in dairy products. Methods: Acidic hydrolysis was employed for sample pretreatment. The chromatographic column used for analyte separation was Shim-pack C18(4.6 mm × 250 mm, 5μm) with 3.8 mmol/L heptafluorobutyric acid/methanol (8:2, V/V) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The ELSD drift temperature was set at 50 ℃, and the carrier gas pressure at 350 kPa. The sample load of 10μL was adopted. The content of hydroxyproline determined under these conditions was used to characterize the level of hydrolyzed animal protein in samples. Results: The developed method displayed good linearity over the concentration range of 10 to1000μg/mL, with a determination coefficient of 0.99993 (n = 5) and its detection limit was 5μ g/mL. The average spike recovery for hydroxyproline was 99.83%, with 2.77% RSD. Conclusion: This method without sample derivatization has the benefits of simplicity of operation as well as high sensitivity and accuracy, and is applicable for the determination of hydroxyproline.

HPLC；evaporative light scattering detector；dairy products；hydrolyzed animal protein；hydroxyproline

O657.72

A

1002-6630(2010)20-0282-04

2010-01-09

河北省科技攻關(guān)項(xiàng)目(05276101D-88)；河北省教育廳科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(y2009315)；河北省衛(wèi)生廳醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(05015；20090570)；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃課題(2008072)

趙燕燕(1960—)，女，教授，博士，主要從事現(xiàn)代分離技術(shù)在藥學(xué)、臨床、環(huán)境的應(yīng)用研究。E-mail：zhaoyany606@tom.com