劉曉丹，鄭明珠，劉景圣*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

響應(yīng)面法優(yōu)化堿法提取林蛙卵團(tuán)中粗多糖的工藝研究

劉曉丹，鄭明珠，劉景圣*

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

以林蛙卵團(tuán)膠狀物為原料，采用堿法對(duì)粗多糖進(jìn)行提取，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)NaOH溶液濃度、料液比、提取溫度及提取時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，堿法提取林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖的最佳工藝條件為NaOH溶液濃度1.2mol/L、料液比1:8(g/mL)、浸提溫度56℃、浸提時(shí)間73min。在此條件下林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量可達(dá)24.01mg/g。

林蛙；卵團(tuán)膠狀物；多糖；響應(yīng)面

中國(guó)林蛙(Rana temporaria chensinensis David)，又稱(chēng)哈什蟆，屬兩棲綱無(wú)尾目蛙科蛙屬，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，主產(chǎn)于黑龍江、遼寧、吉林3省，尤以吉林省居多，是一種珍貴的兩棲類(lèi)藥用經(jīng)濟(jì)動(dòng)物[1-2]。蛙類(lèi)的卵子在通過(guò)輸卵管后，被輸卵管內(nèi)分泌的物質(zhì)逐層包裹，排出體外后，包裹卵子的物質(zhì)呈膠狀，無(wú)色透明，俗稱(chēng)卵團(tuán)。這層卵透明帶是一種包圍在卵母細(xì)胞上的一種糖蛋白基質(zhì)，由于其有著很強(qiáng)的異種抗原性，因此它可以引起抗生育效應(yīng)[3-4]。

卵子的包裹物質(zhì)，即卵團(tuán)膠狀物質(zhì)，成分復(fù)雜，不能完全確定其中的成分，但是從目前的研究可知：輸卵管直部分泌的物質(zhì)有利于精子透過(guò)而與卵子結(jié)合，卷曲部分泌的物質(zhì)多為含糖基的蛋白質(zhì)及多糖類(lèi)物質(zhì)，為受精卵的發(fā)育提供必要的營(yíng)養(yǎng)[5-10]。

多糖及其糖復(fù)合物不僅在生物體內(nèi)具有重要的生物功能和較好的生物活性，而且在生命科學(xué)及醫(yī)藥領(lǐng)域上還具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。目前研究可知多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力，降低血糖、血脂，抗腫瘤，延緩衰老等作用[11-15]。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物進(jìn)行初步研究，對(duì)影響林蛙卵團(tuán)膠狀物中粗多糖提取的幾個(gè)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，確定其最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

林蛙卵團(tuán)：通化市柳河縣。

苯酚、無(wú)水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、冰醋酸、氫氧化鈉(均為國(guó)產(chǎn)分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

AUY220 EXP分析天平 北京賽多利斯有限公司；XMTD數(shù)顯水浴鍋 余姚市東方電工儀器廠(chǎng)；HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；LG10-2.4A高速離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；TU-1810紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 林蛙卵團(tuán)膠狀物多糖的提取

精確稱(chēng)取卵團(tuán)膠狀物5g，按一定料液比加入NaOH溶液，水浴提取后，調(diào)節(jié)pH值到7左右，加入95%乙醇4℃過(guò)夜保存，離心，30℃烘干，即為林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

對(duì)粗多糖提取影響較大的NaOH濃度、料液比、提取溫度及提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別討論其對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響。

1.3.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Beknhen中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以粗多糖含量Y為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平表Table1 Factors and levels of response surface experiments

1.3.4 林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量。粗多糖含量計(jì)算式：

粗多糖含量/%=林蛙卵團(tuán)膠狀物提取液中粗多糖質(zhì)量/新鮮卵團(tuán)膠狀物質(zhì)量×100

2 結(jié)果與分析

2.1 苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量[16]標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

測(cè)得多糖含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為：Y=0.0083X－0.0111，R2=0.9996。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 NaOH溶液濃度對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團(tuán)膠狀物5g，按料液比1:8(g/mL)分別加入濃度為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1mol/L的NaOH溶液，55℃提取30min。調(diào)節(jié)pH值到7左右，加入NaOH溶液4倍體積(此處為160mL)的95%乙醇于4℃過(guò)夜，離心，干燥，測(cè)定粗多糖含量。結(jié)果如圖1所示。

圖1 NaOH濃度對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響Fig.1 Effect of NaOH concentration on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

2.2.2 料液比對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團(tuán)膠狀物5g，按NaOH濃度0.9mol/L，分別以料液比1:4、1:6、1:8、1:10、1:12、1:14、1:16 (g/mL)在55℃提取30min。調(diào)節(jié)pH值到7左右，加入NaOH溶液4倍體積的95%乙醇于4℃過(guò)夜，離心，干燥，測(cè)定粗多糖含量。結(jié)果如圖2所示。

圖2 料液比對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響Fig.2 Effect of material-liquid ratio on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

從圖2可以看出，粗多糖含量在料液比1:4～1:8 (g/mL)的范圍內(nèi)有顯著增加，而當(dāng)料液比在1:8后就顯著下降，1:14～1:16(g/mL)極速下降。提取液的體積越大，溶劑與卵團(tuán)膠狀物的接觸就越充分，在相同的時(shí)間內(nèi)所得的粗多糖也就越多，當(dāng)料液比達(dá)到1:10(g/mL)后溶出的粗多糖物質(zhì)趨于飽和呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。由于堿溶液的添

加量不斷增加直至達(dá)到過(guò)飽和狀態(tài)，因此粗多糖的含量并不是隨提取液體積增大而無(wú)限增加，相反，當(dāng)達(dá)到一定極限值后反而會(huì)呈下降趨勢(shì)。

2.2.3 浸提溫度對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團(tuán)膠狀物5g，按NaOH濃度為0.9mol/L，料液比為1:8(g/mL)，溫度分別為15、25、35、45、55、65、75℃提取30min。調(diào)節(jié)pH值到7左右，加入氫氧化鈉溶液4倍體積的95%乙醇于4℃過(guò)夜，離心，干燥，測(cè)定粗多糖含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 浸提溫度對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

由圖3可以看出，溫度在15～35℃范圍內(nèi)，粗多糖含量顯著提高，溫度在35～55℃范圍內(nèi)，粗多糖含量稍有降低，到65℃開(kāi)始顯著下降。溫度的升高加快了卵團(tuán)膠狀物的降解速度，在一定程度上有利于粗多糖的提取，但是溫度的升高也會(huì)引起蛋白質(zhì)和多糖發(fā)生副反應(yīng)，因此，當(dāng)溫度在65℃以后，提取液顏色明顯變黃，并且散發(fā)很腥的難聞氣味，因此需要對(duì)溫度行嚴(yán)格控制。

2.立足于崗位，來(lái)合理安排。學(xué)校的工作面對(duì)的對(duì)象是學(xué)生這一有生命、有思維的群體，這也就表明了教師工作的特殊性。真正的人才，應(yīng)該是在屬于自己的崗位上能夠做出一定的業(yè)績(jī)或突出貢獻(xiàn)的人。對(duì)于學(xué)習(xí)來(lái)說(shuō)，崗位工作有教學(xué)崗位、管理崗位、后勤服務(wù)崗位等。所以，在學(xué)校人力資源管理工作中，必須要立足于教師的特點(diǎn)，結(jié)合學(xué)校的崗位需求，來(lái)對(duì)工作進(jìn)行細(xì)致分工，充分尊重教師的工作能力和自身素質(zhì)，給其一定的自我發(fā)展空間，這樣才能夠調(diào)動(dòng)教師工作的積極性，優(yōu)化工作效果，促進(jìn)學(xué)校整體工作的有序推進(jìn)。

2.2.4 浸提時(shí)間對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響

取林蛙卵團(tuán)膠狀物5g，按NaOH濃度為0.9mol/L，添加比為1:8(g/mL)，時(shí)間分別為15、30、45、60、75、90、105min，在55℃提取。調(diào)節(jié)pH值到7左右，加入氫氧化鈉溶液4倍體積的95%乙醇于4℃過(guò)夜，離心，干燥，測(cè)定粗多糖含量，結(jié)果如圖4所示。

圖4 浸提時(shí)間對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction rate of crude polysaccharides from Rana egg jelly

由圖4可以看出，浸提時(shí)間在15～45min范圍內(nèi)，粗多糖含量顯著提高，時(shí)間在45～75min范圍內(nèi)，粗多糖含量趨于最高，到75min開(kāi)始顯著下降。隨著浸提時(shí)間的提高，使卵團(tuán)膠狀物有了更充分溶出的可能，從而在一定程度上提高了粗多糖的含量，但并不是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，粗多糖含量也呈正比的相應(yīng)增高，而是達(dá)到一定極限值反而會(huì)下降。當(dāng)時(shí)間達(dá)到75min后，提取液顏色明顯變黃，偏橘色并伴隨強(qiáng)烈的異味。

2.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到林蛙卵團(tuán)膠狀物多糖含量Y對(duì)X1、X2、X3、X4的回歸方程為：

表2 Box-Beknhen試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Design and results of Box-Beknhen experiments

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table3 Variance analysis of response surface experiments

從表3可以看出，方程一次項(xiàng)中X4極顯著，X1、X3顯著，X2不顯著，方程二次項(xiàng)均為極顯著，X2與X3、X3和X4交互作用極顯著，X1與X3交互作用顯著，其余交互項(xiàng)均不顯著，表明試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線(xiàn)性關(guān)系，而是呈二次拋物面關(guān)系。還可以看出影響林蛙卵團(tuán)膠狀物中多糖得率的因素按影響的大小排序依次為浸提時(shí)間X4、浸提溫度X3、NaOH溶液的濃度X1、料液比X2，其中浸提時(shí)間對(duì)多糖得率的影響達(dá)到了極顯著水平(P＜0.01)。

表4 模型可信度分析Table4 Reliability analysis for the model

表4模型可信度分析表明，多元回歸關(guān)系顯著，R2和R2Adj分別達(dá)到96.08%、91.50%，說(shuō)明方程擬合充分，回歸方程顯著，可用上述回歸方程描述個(gè)因子與響應(yīng)值的關(guān)系。

2.3.2 響應(yīng)面圖形分析

響應(yīng)面的圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，圖5為運(yùn)用SAS軟件分析得到的響應(yīng)面圖和等高線(xiàn)圖，可以直接反應(yīng)各因素對(duì)響應(yīng)值的影響，找出最佳工藝參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用，從響應(yīng)面的最高的和等高線(xiàn)可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值。將建立的回歸模型中的任一因素固定在零水平，得到另外兩個(gè)因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線(xiàn)如圖5所示。

如圖5a所示，在X1與X3交互作用等高線(xiàn)中，等高線(xiàn)密度沿X3軸方向略大于X1軸方向，說(shuō)明X1和X3的交互作用中，X3對(duì)響應(yīng)值峰值的影響大于X1、X3的變化可引起響應(yīng)值較大幅度的變化。此外，等高線(xiàn)的形狀可以反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，X1與X3、X4兩項(xiàng)的等高線(xiàn)呈圓形，可以知道它們間的相互作用對(duì)多糖提取率的影響很小，等高線(xiàn)扁平，證明因素間的相互影響較大。如圖5c所示，X3與X4交互作用等高線(xiàn)中，沿X3軸向等高線(xiàn)變化密集，而X4軸向等高線(xiàn)變化相對(duì)稀疏，說(shuō)明X3對(duì)響應(yīng)值峰值的影響比X4大，X3、X4兩因素的影響就很明顯。

圖5 響應(yīng)面三維圖和對(duì)應(yīng)的等高線(xiàn)Fig.5 Response surface and contour plots of response surface experiments

為求出最佳點(diǎn)的編碼值，對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)，并解得：X1=0.1404、X2=0.3089、X3=1.1344、X4=0.9129，真實(shí)值為NaOH溶液濃度(X1)1.24mol/L、料液比(X2)1:7.5 (g/mL)、浸提溫度(X3)56.34℃、浸提時(shí)間(X4)73.7min，林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量理論值可達(dá)24.07mg/g，考慮到實(shí)際操作的便利，將最佳工藝參數(shù)設(shè)定為NaOH溶液濃度(X1)1.2mol/L、料液比(X2)1:8(g/mL)、浸提溫度(X3) 56℃、浸提時(shí)間(X4)73min，經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)，林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量平均值為24.01mg/g，可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型符合良好，說(shuō)明該模型能較好地模擬林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量。

3 結(jié) 論

使用堿液對(duì)林蛙卵團(tuán)膠狀物中粗多糖的提取，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝，依據(jù)回歸分析確定各因素對(duì)粗多糖含量的影響，經(jīng)過(guò)優(yōu)化后確定最佳工藝參數(shù)為NaOH溶液濃度(X1)1.2mol/L、料液比(X2)1:8(g/mL)、浸提溫度(X3)56℃、浸提時(shí)間(X4)73min，林蛙卵團(tuán)膠狀物粗多糖含量平均值為24.01mg/g。

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Optimization of Alkaline Extraction Conditions for Crude Polysaccharides from Rana Egg Jelly by Response Surface Methodology

LIU Xiao-dan，ZHENG Ming-zhu，LIU Jing-sheng*
(College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Rana egg jelly was used as the raw material to extract polysaccharides by an alkaline extraction method. Based on single factor experiments, NaOH concentration, material-liquid ratio, extraction temperature and extraction time during extraction process were optimized by response surface methodology. Results exhibited the best extraction conditions were NaOH concentration of 1.2 mol/L, material-liquid ratio of 1: 8, extraction temperature of 56 ℃ and extraction time of 73 min. The extraction rate of crude polysaccharides can reach up to 24.01 mg/g.

Rana；egg jelly；polysaccharides；response surface methodology

Q538

A

1002-6630(2010)22-0096-05

2010-05-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30671536)

劉曉丹(1982—)，女，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品生物化學(xué)工程與功能性食品研究。E-mail：lxd820928@126.com

*通信作者：劉景圣(1964—)，男，教授，博士，主要從事食品資源深加工與綜合利用研究。E-mail：liujs1007@vip.sina.com